Immunologisk forskning inom urologi

Att förskriva ett immunogram till en urologisk patient innebär att den behandlande läkaren misstänker förekomsten av störningar i immunsystemet. Återkommande bakteriella, virus-, svampinfektioner, allergiska manifestationer, systemiska sjukdomar kan vara tecken på dessa störningar, vilka kännetecknas av ett antal syndrom (infektiösa, onkologiska, allergiska, autoimmuna, lymfoproliferativa). En patient kan ha flera syndrom. Till exempel kan kroniska infektionssjukdomar (infektiöst syndrom) orsaka immunbrist, och immunbrist kan manifestera sig som en predisposition för infektiösa och onkologiska sjukdomar (onkologiskt syndrom). Predisposition för infektioner kan uppstå mot bakgrund av sekundär immunbrist, som utvecklats som ett resultat av en lymfoproliferativ sjukdom, såsom leukemi. Det finns tre huvudgrupper av patologiska förändringar i immunsystemet:

• kvantitativ eller funktionell brist på en eller annan länk i immunsystemet, vilket leder till utveckling av ett immunbristtillstånd;
• en störning i immunsystemets igenkänning av antigener, vilket leder till utveckling av autoimmuna processer;
• ett hyperreaktivt eller "perverst" immunsvar, som manifesteras genom utveckling av allergiska sjukdomar.

Det finns screeningmetoder (nivå 1-tester) och klargörande metoder (nivå 2-tester) inom immundiagnostik. De förra finns för att registrera störningar i immunsystemet, de senare för att fastställa de mekanismer som är involverade i deras implementering i syfte att ytterligare immunkorrigera.

B-cellsimmunitet

Screeningmetoder

• Bestämning av det relativa och absoluta antalet B-lymfocyter med hjälp av immunofluorescens eller flödescytofluorometri med monoklonala antikroppar mot B-cellsantigener (CD19, CD20, där CD är differentieringskluster). Det normala innehållet av B-lymfocyter hos vuxna är 8–19 % av det totala antalet leukocyter eller 190–380 celler/μl. En ökning av innehållet av B-lymfocyter sker vid akuta och kroniska bakterie- och svampinfektioner, kroniska leversjukdomar, systemiska bindvävssjukdomar, kronisk lymfatisk leukemi och myelom.
• Bestämning av koncentrationen av ospecifika immunoglobuliner (F, M, G, E) genom enkel radiell immunodiffusion, nefelometri eller turbometri, radioimmunanalys eller enzymimmunanalys (ELISA). Normer för vuxna: immunoglobulin (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. En ökning av koncentrationen av immunoglobuliner sker under samma patologiska tillstånd som en ökning av innehållet av B-lymfocyter sker. En minskning av koncentrationen av immunoglobuliner sker vid medfödd hypogammaglobulinemi, neoplasmer i immunsystemet, borttagning av mjälten, proteinförlust, njur- eller tarmsjukdomar, behandling med cytostatika och immunsuppressiva medel.

Förtydligande metoder

• Bestämning av cirkulerande immunkomplex i blodet genom selektiv utfällning i polyetylenglykol följt av spektrofotometrisk densitetstestning (normal 80-20 U). En ökning av cirkulerande immunkomplex är typisk för akuta bakteriella, svamp-, virusinfektioner, autoimmuna sjukdomar, immunkomplexsjukdomar, serumsjuka, allergiska reaktioner av typ 3;
• Bestämning av specifika immunoglobuliner i blodet i relation till bakteriella och virala antigener, deoxiribonukleinsyra (DNA) vid autoimmuna sjukdomar, detektion av antispermi- (autoimmun infertilitet) och antirenala antikroppar (pyelonefrit och glomerulonefrit) med radial immunodiffusion eller ELISA-metoden.
• Bestämning av antispermiantikroppar i spermier [MAR-test (blandad antiglobulinreaktion)], normalt - negativt resultat.
• Bestämning av koncentrationen av immunoglobuliner i urin för differentialdiagnos mellan pyelonefrit och glomerulonefrit (selektivitet av proteinuri).
• Bestämning av IgE-halt i prostatajuice för diagnostisering av allergisk prostatit med hjälp av radial immunodiffusionsmetod eller ELISA.
• Studie av responsen i reaktionen av B-lymfocyt-blasttransformation på B-cellsmitogen (kermesbärsmitogen för stimulering av reaktionen av B-lymfocyt-blasttransformation i närvaro av T-lymfocyter), vars normativa värde är 95-100%.

T-cellslänk för immunitet

Screeningmetoder

• Bestämning av det relativa och absoluta antalet mogna CD3 T-lymfocyter med immunofluorescensreaktion eller flödescytofluorometri med monoklonala anti-CD3-antikroppar. Normen för vuxna är 58–76 % eller 1100–1700 celler/μl. En minskning av antalet T-lymfocyter är en indikator på otillräcklighet i den cellulära immunitetslänken. Detta är typiskt för vissa sekundära och primära immunbristsjukdomar (kroniska bakteriella och virala infektioner: tuberkulos, förvärvat immunbristsyndrom, maligna tumörer, kronisk njursvikt, skador, stress, åldrande, undernäring, behandling med cytostatika, exponering för joniserande strålning). En ökning av antalet T-lymfocyter sker mot bakgrund av immunhyperaktivitet eller vid lymfoproliferativa sjukdomar. Vid inflammation ökar antalet T-lymfocyter först och minskar sedan. Avsaknaden av en minskning av T-lymfocyter indikerar en kronisk inflammatorisk process.
• Utvärdering av lymfocytsubpopulationer.
  • Bestämning av antalet T-hjälpare (anti-CD4-antikroppar). Normalt 36–55 % eller 400–1100 celler/mcl. En ökning av antalet av dessa celler sker vid autoimmuna sjukdomar, Waldenströms sjukdom, aktivering av antitransplantationsimmunitet; en minskning av antalet T-hjälpare sker vid kroniska bakteriella, virala och protozoinfektioner, tuberkulos, förvärvat immunbristsyndrom, maligna tumörer, brännskador, skador, undernäring, åldrande, behandling med cytostatika, exponering för joniserande strålning.
  • Bestämning av antalet T-suppressorer (anti-CD4-antikroppar). Normalt 17–37 % eller 300–700 celler/μl. En ökning av antalet T-suppressorer sker under samma förhållanden som antalet T-hjälpare minskar, och deras minskning sker under samma förhållanden som innehållet av T-hjälpare ökar.
  • Immunreglerande index CD4/CD8, normalt 1,5-2,5. Hyperaktivitet med värden över 2,5 (allergiska och autoimmuna sjukdomar); hypoaktivitet - mindre än 1,0 (predisposition för kroniska infektioner). I början av den inflammatoriska processen ökar immunreglerande index, och när det avtar normaliseras det.

Förtydligande metoder

• Bestämning av antalet naturliga mördare (NK-celler) - antikroppar mot CD16 och antikroppar mot CD56. Normen för CD16-lymfocyter är 6–26 %, CD56 - 9–19 %. En ökning av antalet NK-celler sker vid transplantatavstötning, en minskning - vid virusinfektioner, cancer, primära och sekundära immunbrister, brännskador, skador och stress, behandling med cytostatika och exponering för joniserande strålning.
• Bestämning av antalet T-lymfocyter med en receptor för interleukin-2 (aktiveringsmarkör) - anti-CD25-antikroppar. Normen är 10-15%. En ökning av deras antal observeras vid allergiska sjukdomar, transplantatavstötning, respons på tymusberoende antigener under den akuta perioden av primärinfektion, en minskning - vid samma sjukdomar där det finns en minskning av antalet NK-celler.
• Studie av uttryck av aktiveringsmarkör - klass II histokompatibilitetsmolekyl HLA-DR. Ökat uttryck förekommer i inflammatoriska processer, hos patienter med hepatit C, celiaki, syfilis, akuta luftvägssjukdomar.
• Utvärdering av lymfocytapoptos. En grov uppfattning om lymfocyternas beredskap för apoptos kan bestämmas genom uttrycket av Fas-receptorn (CD95) på deras yta och bd-2-proto-onkogenen i mitokondrierna. Lymfocytapoptos bedöms genom att behandla dem med två fluorescerande färgämnen: propidiumjodid, som binder till DNA-fragment, och annexin Y, som binder till fosfatidylserin, som uppträder på cellmembranet vid apoptosens början. Resultaten utvärderas med hjälp av en flödescytofluorometer. Resultaten beräknas baserat på förhållandet mellan celler färgade med olika färgämnen. Ofärgade celler är livskraftiga, celler bundna endast till annexin Y är tidiga manifestationer av apoptos, med propidiumjodid och annexin Y är sena manifestationer av apoptos, färgning med endast propidiumjodid indikerar nekros.
• Utvärdering av T-lymfocytproliferation in vitro.
  • Förändringar i cellblastogenes - lymfocytblasttransformationsreaktion. Leukocyter inkuberas med valfri mitogen av växtursprung (lektiner). Fytohemagglutinin används oftast i 72 timmar, sedan tas ett utstryk, färgas och antalet blaster räknas! Stimuleringsindex är förhållandet mellan andelen transformerade celler i experimentet (kultur med fytohemagglutinin) och andelen transformerade celler i kontrollen (kultur utan fytohemagglutinin). Lymfocytblasttransformationsreaktionen kan bedömas genom att inkludera en radioaktiv märkning (ZN-tymndinum) i de odlade cellerna, eftersom DNA-syntesen ökar under celldelning. Störningar i det proliferativa svaret förekommer vid både primära och sekundära immunbrister i samband med infektioner, cancer, njursvikt och kirurgiska ingrepp.
  • I dessa studier utvärderas uttrycket av aktiveringsmarkörer (CD25, transferrinreceptor - CD71) och molekylen för det huvudsakliga histokompatibilitetskomplexet klass II HLA-DR, vilka praktiskt taget saknas på vilande T-lymfocyter. T-lymfocyter stimuleras med fytohemagglutinin, efter 3 dagar analyseras uttrycket av aktiveringsmarkörer med metoden med direkt eller indirekt immunofluorescensreaktion, flödescytofluorometri, med användning av monoklonala antikroppar mot de isolerade receptorerna.
  • Mätning av mängden mediatorer som syntetiseras av aktiverade T-lymfocyter [interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon, etc.] med hjälp av radioimmunanalys eller ELISA. Av särskild vikt är bedömningen av koncentrationen av γ-interferon och IL-4 som markörer för Th1 och Th2 i supernatanten från aktiverade kulturer och inuti cellen. Om möjligt är det användbart att bestämma genuttrycket för motsvarande cytokin genom nivån av matrixribonukleinsyra i producentcellen och intensiteten av uttrycket av receptorer för motsvarande cytokiner.
    
• Reaktion på hämning av lymfocytmigration. Sensibiliserade T-lymfocyter utsöndrar lymfokiner i reaktion med antigen, inklusive faktorer som hämmar lymfocytmigration. Hämningsfenomenet observeras när mitogener introduceras i cellkulturen. Utvärdering av hämningsgraden gör det möjligt att bedöma lymfocyternas förmåga att utsöndra cytokiner. Normalt är migrationsfrekvensen, beroende på det specifika mitogenet, 20–80 %.
• Bedömning av NK-cellers cytotoxicitet. Naturliga mördarcellers förmåga att döda målceller i K-562 erytromyeloidlinjen bestäms. Om antikroppsberoende cytotoxicitet bedöms används målceller belagda med IgG-antikroppar. Målcellerna märks med 3H-uridin och inkuberas med effektorceller. Målcellernas död bedöms genom frisättning av den radioaktiva märkningen i lösningen. En minskning av cytotoxiciteten sker vid maligna neoplasmer. I vissa fall, när det är nödvändigt att förutsäga effektiviteten av behandling med interleukiner, bedöms NK-cellernas cytotoxicitet under inkubation med vissa cytokiner.

Studie av fagocytfunktion

Screeningmetoder

Studie av absorptionsintensiteten av mikrobiella celler av fagocyter (fagocytos av latexpartiklar, testkultur av stafylokocker, E. coli eller mikroorganismer isolerade från patienten). Genom centrifugering av hepariniserat blod isoleras en suspension av leukocyter, serum av IV-blodgrupp tillsätts för opsonisering (opsoniner är proteiner som förstärker fagocytos). Den mikrobiella suspensionen späds ut, blandas med leukocyter och inkuberas i 120 minuter, varvid prover tas för analys 30.90.120 minuter efter inkubationsstart. Utstryk tas från den insamlade leukocytsuspensionen. Följande fagocytosindikatorer bestäms:

• fagocytiskt index - andelen celler som gick in i fagocytos inom 30 minuter och 120 minuter efter inkubation; standardvärdet för fagocytiskt index (30) är 94 %, fagocytiskt index (120) är 92 %;
• fagocytantal - det genomsnittliga antalet bakterier som finns intracellulärt; standardvärdet för fagocytantalet (30) är 11%, fagocytantalet (120) är 9,8%;
• fagocyttalkoefficient - förhållandet mellan fagocytantalet (30) och fagocytantalet (120); normalt 1,16;
• Neutrofil bakteriedödande index - förhållandet mellan antalet mikrober som dödas inuti fagocyter och det totala antalet mikrober som absorberas; normalt 66 %.

Förtydligande metoder

• Studie av fagocyters bakteriedödande förmåga i testet med nitroblått tetrazolium (NBT) - NBT-test. Gult nitroblått tetrazoliumfärgämne tillsätts leukocyter. När en neutrofil absorberar färgämnet sker en reduktionsprocess under påverkan av fria syreradikaler, vilket resulterar i blå färgning. Reaktionen utförs i en 96-brunns flatbottnad platta. Hanks lösning (spontan NBT) tillsätts till de tre första brunnarna med en blandning av NBT och leukocyter, och latexpartiklar tillsätts till den andra; blandningen inkuberas vid 37 °C i 25 minuter. Resultaten avläses vid 540 nm på en läsare och uttrycks i godtyckliga enheter. Stimuleringskoefficienten (Kst ₎ beräknas, lika med förhållandet mellan den optiska densiteten i de stimulerade brunnarna och den genomsnittliga optiska densiteten i brunnarna utan stimulering. Hos friska personer är NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. Rätm = _1,78 ± 0,36.
• Studie av adhesionsmolekyler. Flödescytofluorometri används för att bestämma uttrycket av ytantigenerna CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Immunbrister med nedsatt adhesion manifesteras av återkommande infektioner, långsam sårläkning och avsaknad av var i infektionsområdet.

Studie av komplementsystemet

Screeningmetoder

Bestämning av komplementets hemolytiska aktivitet är en studie av den klassiska vägen för komplementaktivering. Olika utspädningar av serum från en sjuk och frisk person tillsätts till erytrocyter belagda med antikroppar. Enheten för hemolytisk aktivitet är det reciproka värdet av serumutspädningen vid vilken 50 % av erytrocyterna förstörs. Hemolysgraden uppskattas fotometriskt genom frisättningen av hemoglobin i lösningen. En minskning av komplementets hemolytiska aktivitet observeras vid systemisk lupus erythematosus med njurskada, akut glomerulonefrit, kombinerad immunbrist, myasteni, viral hepatit, lymfom, en ökning av obstruktiv gulsot, Hashimotos tyreoidit, reumatism, reumatoid artrit, nodulär periarterit, dermatomyosit, hjärtinfarkt, ulcerös kolit, Reiters syndrom, gikt.

Förtydligande metoder

• Bestämning av komplementkomponenter. Kvantitativ bestämning utförs med radiell immunodiffusion och nefelometri.
  Studien är inte informativ om inte komplementkomponenternas antigena egenskaper förändras.
• Det har fastställts att Clq-komponenten i komplementet förstärker fagocytos och medierar cellulär cytotoxicitet. Dess minskning sker vid immunkomplexsjukdomar, systemisk lupus erythematosus, purulenta infektioner och tumörer.
• C3-komponenten är involverad i aktiveringen av de klassiska och alternativa komplementvägarna. En minskning av dess koncentration är förknippad med kroniska bakteriella och svampinfektioner, förekomsten av cirkulerande eller vävnadsbaserade immunkomplex.
• C4-komponenten är involverad i aktiveringen av den klassiska signalvägen. En minskning av dess koncentration är förknippad med förlängd aktivering av komplement av immunkomplex och en minskning av koncentrationen av C1-hämmaren, som kontrollerar aktiveringen av den klassiska komplementvägen. C4-brist förekommer vid systemisk lupus erythematosus, en ökning av C4 förekommer vid njursjukdom, transplantatavstötning, akut inflammation och mag-tarmsjukdomar.
• C5a är ett litet fragment av C5-molekylen, som avspjälkas från den som ett resultat av aktivering av komplementsystemet. Dess koncentration ökar vid inflammation, sepsis, atopiska och allergiska sjukdomar.
• Cl-hämmaren är en multifunktionell faktor. Den kontrollerar aktiveringen av komplementkomponenten C1, hämmar aktiviteten hos kallikrein, plasmin och aktiverad Hageman-faktor, Cls och Or-proteaser. Brist på C1-hämmaren leder till angioödem.
• Funktionella studier av komplement. Testserumet tillsätts till ett standardserum som saknar komplementkomponenter och komplementets hemolytiska aktivitet bestäms. Om den hemolytiska aktiviteten inte återställs till det normala anses aktiviteten hos denna komplementkomponent i testserumet vara reducerad.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]