Molekylära genetiska metoder för diagnos av ärftliga sjukdomar

DNA-teknologimetoder används för att bestämma lokalisering i en speciell kromosom av den mutanta genen ansvarig för ursprunget för vissa former av ärftliga sjukdomar. Eftersom genen är ett DNA-segment och genmutation - skada på den primära strukturen av DNA (en mutation förstås av alla förändringar i DNA-sekvensen, oavsett deras läge och påverkan på den enskilda viabilitet) därefter sondering beredningar av metafas patientens kromosomer ärftlig sjukdom, möjligt att fastställa lokalisering av patologisk gen. Metoder för molekylärgenetik för att skapa möjligheten att diagnostisera sjukdomar vid en förändrad DNA-struktur, de tillåter att fastställa lokaliseringen av ärftliga sjukdomar. Molekylärgenetiska metoder kan avslöja mutationer i samband med utbyte av till och med en enda bas.

Det viktigaste steget i identifieringen av en gen är dess isolering. DNA kan isoleras från vilken typ av vävnad och cell som innehåller kärnor. Stegen av DNA-isolering inkluderar snabb lys av cellerna genom centrifugering med avlägsnande av fragment av cellulära organeller och membran, enzymatisk nedbrytning av proteiner och deras utvinning från lösningen med fenol och kloroform, DNA-koncentrationen genom utfällning i etanol.

I genetiska laboratorier isoleras DNA oftast från blodleukocyter, för vilka patienten tas 5-20 ml venöst blod i ett sterilt rör med en antikoagulantlösning (heparin). Leukocyter separeras sedan och bearbetas enligt stegen beskrivna ovan.

Nästa steg i materialberedning till studiet - DNA "cut" till fragment på platser med strikt specifik bassekvens utförs med hjälp av bakteriella enzymer - restriktionsendonukleaser (restriktionsenzymer). Restriktionsenzymer känner igen specifika sekvenser av 4-6, minst 8-12 nukleotider i dubbelsträngad DNA-molekyl och dess separeras till fragment av dessa sekvenser lokalisera centra kallade restriktionsställen. Siffer producerade restriktionsfragment av DNA som bestäms av frekvensen av förekomsten av restriktionsställen och fragment av storlek - arten av fördelningen av dessa platser längs längden av den ursprungliga DNA-molekylen. Ju oftare restriktionsställena är placerade desto kortare DNA-fragment efter restriktion. Närvarande finns det mer än 500 olika typer av restriktionsenzymer av bakteriellt ursprung, och vardera av dessa enzym känner igen dess specifika sekvens av nukleotider. I framtiden kan restriktionsställen användas som genetiska markörer för DNA. De resulterande DNA-restriktionsfragment kan sorteras efter längd med elektrofores i agaros eller polyakrylamidgeler, och sålunda kan bestämmas deras molekylvikt. Vanligtvis för detektion av DNA i gelén som används av specifik färgning (vanligtvis etidiumbromid) och visning av gelén i genomlysning det ultravioletta. Platser av DNA-lokalisering har en röd färg. Emellertid endonukleaser en person i bearbetningen av flera DNA-restriktions bildas så många fragment av olika längder att de misslyckas med att separeras genom elektrofores, är det inte möjligt att visuellt identifiera de individuella DNA-fragmenten att electrophoregram (producerad enhetlig färgning över hela längden av gelén). Därför används en hybridiseringsmetod med märkta DNA-prober för att identifiera de önskade DNA-fragmenten i en sådan gel.

Varje enkelsträngat segment av DNA eller RNA kan binda (hybridisera) till dess komplementära kedja och guanin är alltid associerad med cytosin, adenin med tymin. Detta är bildandet av en dubbelsträngad molekyl. Om en enkelsträngad kopia av den klonade genen är märkt med en radioaktiv märkning, kommer en sond att erhållas. Sonden kan hitta ett komplementärt segment av DNA, vilket sedan lätt identifieras genom radioautografi. En radioaktiv sond som läggs till ett läkemedel med utsträckta kromosomer gör att genen kan lokaliseras på en viss kromosom: vissa DNA-prover kan identifieras med en DNA-prob i Southern blotting. Hybridisering sker om testdelen av DNA innehåller en normal gen. I det fall där det finns en onormal sekvens av nukleotider, dvs de motsvarande kromosom strukturer innehåller en mutant gen, hybridisering inte kommer att inträffa, vilket gör det möjligt att bestämma lokalisering av den onormala genen.

För att erhålla DNA-prober används genkloning-metoden. Kärnan i förfarandet består i att det DNA-fragment som motsvarar varje gen eller region av genen insatt i klonings partikel, vanligtvis en bakteriell plasmid (cirkulärt extrakromosomalt DNA närvarande i bakterieceller och som bär resistensgener mot antibiotika), och sedan bakterierna att ha en plasmid med en inbyggd human gen multipliceras. På grund av de syntesförfaranden är det möjligt att erhålla plasmiden miljarder kopior av den humana genen eller en del därav.

Vidare användes DNA-kopior märkta med en radioaktiv märkning eller fluorokrom som prober för att söka efter komplementära sekvenser bland poolen av DNA-molekyler som studerats.

För närvarande finns det många sorter av metoder som använder DNA-prober för diagnos av genmutationer.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],