Enzymerna och cytokinernas roll i artrosens patogenes

Under de senaste åren har en hel del forskning fokuserat på identifieringen av proteaser som är ansvariga för nedbrytningen av ECM hos ledbrosk hos artros. Enligt moderna idéer spelas en viktig roll i artrosens patogenes av matrismetalloproteaser (MMP). Patienter med artros har en ökad nivå på tre representanter för MMP-kollagenaser, stromelysiner och gelatinaser. Kollagenas är ansvarig för nedbrytning av nativt kollagen, stromelysin - kollagen typ IV, laminin och proteoglykaner, azhelatinaza - för nedbrytning av gelatin, kollagen IV, Vh XI typer elastin. Vidare förutsätts det att det finns ett annat enzym - aggrekanas som har egenskaper MMP och ansvarar för proteolysen av brosk proteoglykan aggregat.

Ledbrosk i humana koUagenaser identifierade tre typer av nivåer som är förhöjda hos patienter med artros - kollagenas-1 (MMP-1), kollagenas-2 (MMP-8), kollagenas-3 (MMP-13). Sameksistensen av tre olika typer av kollagenaser i ledbrusk indikerar att var och en av dem spelar sin egen specifika roll. Indeed, kollagenas-1 och -2 är huvudsakligen lokaliserade i den ytliga och övre mellanliggande zon av ledbrosket, medan kollagenas-3 finns i botten av de mellanliggande och djupa zoner. Dessutom har resultaten av immunhistokemiska studier visat att under utvecklingen av artros nivå av kollagenas-3 når en platå eller till och med minskar, medan nivån av kollagenas-1 gradvis ökas. Det finns belägg för att för artros kollagenas-1 är huvudsakligen involverade i den inflammatoriska processen i ledbrosket, medan kollagenas-3 - i vävnadsombildning. Uttrycks i brosket av patienter med OA kollagenas 3 utför nedbrytning av typ II kollagen mer intensivt än kollagenas-1.

Av företrädare för den andra gruppen metalloproteaser Mänskligt stromelizinovu identifieras som tre - stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10) och stromelysin-3 (MMP-11). Idag är det känt att endast stromelysin-1 är involverad i den patologiska processen i artros. I synovialmembranet hos patienter med artros bestäms inte stromelysin-2, men det visar sig i mycket små mängder i synoviala fibroblaster från patienter med reumatoid artrit. Stromelysin-3 finns också i synovialmembranet hos patienter med reumatoid artrit nära fibroblasterna, särskilt i fibroszoner.

I gruppen av gelatinaser i human broskvävnad identifieras endast två - 92 gelatinas kDa (gelatinas B, eller MMP-9) och 72 gelatinas kDa (gelatinas A, eller MMP-2); hos patienter med osteoartrit bestäms en ökning av nivån av 92 kD gelatinas.

Inte så länge sedan identifierades en annan grupp av MMP som lokaliseras på cellemembrans yta och kallas MMP-membrantyp (MMP-MT). Till denna grupp hör till fyra enzymer - MMP-MT1-MMP-MT-4. MMP-MT-uttryck finns i den humana artikulära brosken. Även om MMP-MT-1 har egenskaperna av kollagenas, båda enzymerna MMP MT-MMP-1 och MT-2 kapabel aktivirovatzhelatinazu-72 kD och kollagenas-3. Rollen av denna grupp av MMP i patogenesen av OA kräver förfining.

Proteinaser utsöndras i form av en zymogen, som aktiveras av andra proteinaser eller organiska föreningar av kvicksilver. Den katalytiska aktiviteten hos MMP beror på närvaron av zink i enzymets aktiva zon.

Den biologiska aktiviteten hos MMP styrs av specifika TIMP. Hittills har tre typer av TIMP identifierats som finns i humana ledvävnader, TIMP-1-TIMP-3. Den fjärde typen av TIMP identifieras och klonas, men den har ännu inte detekterats i de mänskliga ledvävnaderna. Dessa molekyler binder specifikt till det aktiva stället av MMP, även om vissa av dem är i stånd att binda det aktiva stället i 72 kDa progelatinase (TIMP-2, -3, -4) och 92 kDa progelatinase (TIMP-1 och -3). Visar data att OA ledbrosk i en obalans mellan MMP och TIMP som resulterar i en relativ brist av inhibitorer som kan vara delvis relaterade till ökad MMP-aktivitet i vävnaden. TIMP-1 och -2 finns i artikulärt brosk, de syntetiseras av kondrocyter. Med artros i synovialmembranen och synovialvätskan har endast den första typen av TIMP detekterats. TIMP-3 detekteras exklusivt i ECM. TIMP-4 har en identisk aminosyrasekvens med TIMP-2 och -ZIN med nästan 38% -STIMP-1 med nästan 50%. De andra målceller av TIMP-4 är ansvarig för modulering av aktiveringen progelatinase 72 kD cellytan, vilket tyder på en viktig roll som en regulator av vävnadsspecifik ECM ombyggnad.

En annan mekanism för att kontrollera MMP: s biologiska aktivitet är deras fysiologiska aktivering. Man tror att enzymer från familjen av serin och cysteinproteaser, såsom AP / plasmin respektive cathepsin B, är fysiologiska aktivatorer av MMP. I ledbrusk hos patienter med artros, upptäcktes en förhöjd nivå av urokinas (UAP) och plasmin.

Trots det faktum att flera typer av katepsiner finns i de gemensamma vävnaderna anses kathepsin-B vara den mest sannolika aktivatorn av MMP i brosk. I vävnaderna i den humana leden detekterades fysiologiska inhibitorer av serin- och cysteinproteaser. Aktiviteten hos inhibitoren AP-1 (IAP-1), liksom cysteinproteaser, reduceras hos patienter med artros. På liknande sätt som MMP / TIMP är det obalansen mellan serin och cysteinproteaser och deras hämmare som kan förklara den ökade MMP-aktiviteten i ledbrusk hos patienter med artros. Dessutom kan MMPs aktivera varandra. Stromelysin-1 aktiverar till exempel kollagenas-1, kollagenas-3 och gelatinas 92 kD; Kollagenas-3 aktiverar 92 kD gelatinas; MMP-MT aktiverar kollagenas-3, och gelatinas-72 kD potentierar denna aktivering; MMP-MT aktiverar också 72 kD gelatinas. Cytokiner kan delas in i tre grupper - destruktiva (proinflammatoriska), regulatoriska (inklusive antiinflammatoriska) och anabola (tillväxtfaktorer).

Typer av cytokiner (enligt van den Berg WB et al)

Destruktiva	Interleukin-1 TNF-alfa Leukemisk inhiberande faktor Interleukin-17
Föreskrivande	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzyminhibitorer
Anabola	Msulinliknande tillväxtfaktorer TGF-b Benmorfogenetiska proteiner Morfogenetiska proteiner härledda från brosk

Destruktiva cytokiner, i synnerhet IL-1 inducerad ökning i frisättningen av proteaser och inhiberar syntes av proteoglykaner och kollagener kondrocyter. Regulatoriska Cytokiner, särskilt IL-4 och -10, hämmar produktionen av IL-1-receptorantagonist, för att öka produktionen av IL-1 (IL-1 RA), och minska nivån och NO-syntas-aktivitet i kondrocyter. Sålunda, IL-4 antagoniserar IL-1 på tre sätt: 1) minskar produktionen och förhindrar dess effekter, 2) ökar produktionen av grundläggande "scavenger" IL-1 Pa och 3) minskar produktionen av primära sekundära "budbärare» NO. Dessutom reducerar IL-4 enzymatisk vävnadsnedbrytning. In vivo-betingelser uppnås den optimala terapeutiska effekten med kombinationen av IL-4 och IL-10. Anabola faktorer, såsom kakTFR-p och IGF-1, inte riktigt störa produktionen eller verkan av IL-1, men som visar den motsatta aktivitet, exempelvis, stimulera syntesen av proteoglykan och kollagen, inhibera proteasaktivitet och TGF (3, inhiberar också frisättningen av enzymer och stimulerar deras inhibitorer.

Proinflammatoriska cytokiner är ansvariga för den ökade syntesen och uttrycket av MMP i de gemensamma vävnaderna. De syntetiseras i synovialmembranet och diffunderas sedan in i ledbrusk genom synovialvätskan. Proinflammatoriska cytokiner aktiverar kondrocyter, som i sin tur också kan producera proinflammatoriska cytokiner. I lederna som påverkas av osteoartros spelas rollen av effektorn av inflammation huvudsakligen av cellerna i det synoviala membranet. Det är synovit av makrofagstyp som utsöndrar proteaser och inflammatoriska mediatorer. Bland dem är IL-f, TNF-a, IL-6, leukemisk inhiberande faktor (LIF) och IL-17 inblandad i patogenesen av osteoartrit i största möjliga utsträckning.

Biologiskt aktiva ämnen som stimulerar ledbrusknedbrytning vid artros

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-alfa
• Kolonistimulerande faktorer: makrofag (monocytisk) och granulocyt-makrofag
• Ämne P
• PGE ₂
• Aktivatorer av plasminogen (vävnad och urokinas-typer) och plasmin
• Metalloproteaser (kollagenaser, ellastaser, stromelysiner)
• Cathepsins A och B.
• Thriller
• Bakteriella lipopolysackarider
• Fosfolipas-ag

Litteraturen föreslår att IL-ip och möjligen TNF-a - de viktigaste förmedlarna av destruktion av ledvävnad i osteoartrit. Det är dock fortfarande inte känt huruvida de fungerar oberoende av varandra eller det finns en funktionell hierarki mellan dem. På modeller av artros hos djur visades att IL-1 blockad förhindrar effektivt förstörelsen av ledbrosk, medan blockering av TNF-alfa leder till en försvagning av inflammation i gemensamma vävnader. I synovialmembranen, synovialvätska och brosk hos patienter upptäcktes ökade koncentrationer av båda cytokinerna. Kondrocyterna kan öka syntesen av icke endast proteaser (MMP och främst AP) men också mindre kollagener såsom typ I och III, samt minska syntesen av kollagen typ II och IX och proteoglykaner. Dessa cytokiner stimulerar också aktiva syrespecies och inflammatoriska mediatorer såsom PGE ₂. Resultatet av sådana makromolekylära förändringar i ledbrosk i artros är ineffektiva reparationsprocesser, vilket leder till ytterligare nedbrytning av brosket.

De ovan nämnda proinflammatoriska cytokiner modulerar de processer av depression / aktivering av MMP i osteoartrit. Till exempel, kan obalansen mellan nivåerna av TIMP-1 och MMP i brosk i osteoartrit medieras av IL-ip, eftersom studien in vitro visade att ökande koncentrationer av IL-1 beta reducerar koncentrationen av TIMP-1 och MMP ökad syntes av kondrocyter. Syntes av AP moduleras även av IL-1beta. Stimulering in vitro kondrocyter av ledbrosk med IL-1 vyzyvet dosberoende ökning av syntes och skarp AP minskning av syntesen av PAI-1. Förmågan hos IL-1 att minska syntesen av PAI-1-syntes och stimulera AP är en kraftfull mekanism för generering av plasmin-aktivering och MMP. Dessutom är plasmin inte bara ett enzym aktivera andra enzymer, deltar det också i nedbrytningen av brosk genom direkt proteolys.

IL-ip syntetiseras som en inaktiv prekursor massan 31 kD (pre-IL-ip), Azat, efter klyvning av signalpeptiden, omvandlas till den aktiva cytokinet från vikten av 17,5 kD. I vävnaderna i lederna, inklusive synovialmembranet och ledvätskan hos ledbrosk, IL-ip detekteras i aktiv form, och i studier in vivo visade förmågan hos synovialmembranet i osteoartrit utsöndrar detta cytokin. Vissa serinproteaser kan konvertera pre-IL-ip till dess bioaktiva form. I däggdjur, är sådana egenskaper som finns i endast ett proteas, som tillhör familjen av cystein aspartatspetsificheskih enzymer kallas IL-1p-converting enzyme (IKF eller kaspas-1). Detta enzym har förmåga att specifikt omvandla pre-IL-ip biologiskt aktiv "mogna" IL-ip med en massa på 17,5 kD. IKF är ett proenzyme med en molekylvikt av 45 kD (p45), som är lokaliserad i cellmembranet. Efter proenzima p45 proteolytisk klyvning för att bilda två subenheter, kända som p10 och p20, som är karakteristisk för enzymatisk aktivitet.

TNF-a syntetiseras också som en membranbunden föregångare med en massa av 26 kD; genom proteolytisk klyvning frisätts den från cellen som en aktiv löslig form med en massa av 17 kD. Proteolytisk klyvning utförs av TNF-a-konverterande enzymet (TNF-KF), som tillhör adamalysins familj. AR Amin och medförfattare (1997) fann ökat uttryck av TNF-CF mRNA i ledbrusk hos patienter med osteoartrit.

Den biologiska aktiveringen av kondrocyter och synovitocyter IL-1 och TNF-a medieras genom bindning till specifika receptorer på ytan av celler - IL-R och TNF-R. För varje cytokin identifierade två typer av receptorer - IL-IP I och II typer och TNF-R I (p55) och II (p75) typer. För överföring av signaler i cellerna i de gemensamma vävnaderna svarar IL-1PI och p55. IL-1P typ I har en något högre affinitet för IL-1beta än för IL-la; IL-1P typ II - tvärtom har en större affinitet för IL-1a än för IL-ip. Det är fortfarande oklart om signaler IL-IP II typ medierar IL-1 eller det är den enda anslutningen till kompetitiv inhibering av IL-1 till IL-1RI typ. I hondroiitah och synoviala fibroblaster från patienter med artros hitta en stor mängd av IL-1PI och p55, vilket i sin tur förklarar den höga känsligheten hos dessa celler på stimulering av cytokiner relevanta. Denna process leder både till en ökning av utsöndringen av proteolytiska enzymer och till förstöringen av ledbrusk.

Det är inte uteslutet att IL-6 deltar i den patologiska processen vid artros. Detta antagande grundar sig på följande observationer:

• IL-6 ökar antalet inflammatoriska celler i det synoviala membranet,
• IL-6 stimulerar proliferationen av kondrocyter,
• IL-6 ökar effekterna av IL-1 för att öka syntesen av MMP och hämma syntesen av proteoglykaner.

Emellertid, är IL-6 i stånd att inducera produktionen av TIMP, men påverkar inte produktionen av MMP anses därför att denna cytokin är inblandad i processen för inneslutning av proteolytisk nedbrytning av artikulärt brosk, vilket sker genom en återkopplingsmekanism.

Annan representant av IL-6-familjen är den LIF - cytokin, som produceras av kondrocyter erhållna från patienter med artros, som svar på stimulering av pro-inflammatoriska cytokiner IL-ip och TNF-a. L IF stimulerar resorption av brosk proteoglykaner, samt syntesen av MMP och NO-produktion. Denna cytokins roll i artros är inte fullständigt förstådd.

IL-17 är en 20-30 kD homodimer med IL-1-liknande verkan, men mycket mindre uttalad. IL-17 stimulerar syntesen och frisättningen av ett antal proinflammatoriska cytokiner, innefattande IL-ip, TNF-a, IL-6 och MMP i målceller, såsom humana makrofager. Dessutom stimulerar IL-17 ingen produktion med kondrocyter. Liksom LIF har rollen av IL-17 i patogenesen av OA varit liten studerad.

Oorganisk friradikal NO spelar en viktig roll vid nedbrytning av ledbrusk med OA. Kondrocyter erhållna från patienter med artros producerar mer NO så spontant som efter stimulering med proinflammatoriska cytokiner jämfört med normala celler. Höga koncentrationer av NO detekterats i ledvätska och serum hos patienter med artros - är ett resultat av ökat uttryck och syntes inducerad NO-syntas (hNOC) - enzym som NO-produktion. Det var nyligen klonade DNA hondrotsitspetsificheskoy hNOC, bestämda aminosyrasekvensen hos enzymet. Aminosyrasekvensen indikerar en 50% identitet och 70% likhet med hNOC specifikt för endotelet och nervvävnaden.

NEJ hämmar syntesen av makromolekyler av ECM av ledbrusk och stimulerar syntesen av MMP. Vidare åtföljs en ökning av NO-produktion av en minskning av syntesen av antagonisten IL-IP (IL-1RA) med kondrocyter. Således leder en ökning av nivån av IL-1 och en minskning av IL-1 RA till hyperstimulering av NO av kondrocyter, vilket i sin tur leder till ökad nedbrytning av broskmatrisen. Det har rapporterats om en terapeutisk effekt in vivo av en selektiv hNOC-hämmare på progressionen av experimentell artros.

Naturliga cytokinhämmare kan direkt hämma bindningen av cytokiner till receptorerna av cellmembran, vilket minskar deras proinflammatoriska aktivitet. Naturliga hämmare av cytokiner kan delas in i tre klasser enligt deras verkningssätt.

Den första klassen av inhibitorer innefattar receptorantagonister, vilka förhindrar bindning av liganden till dess receptor genom konkurrens för bindningsstället. Hittills är denna inhibitor finns bara för IL-1 - är över en kompetitiv hämmare av IL-1 / IL-1 ILIP PA-system. IL-1 RA blockerar många av de effekter som observeras i vävnaderna hos lederna vid artros, inklusive syntesen av prostaglandiner genom synoviala celler, produktion av kollagenas av kondrocyter och nedbrytning av ledbrosk i skåpet.

IL-1RA detekteras i olika former - en löslig (rIL-1PA) och två intercellulär (μIL-lPAI och μIL-1APAP). Affiniteten för den lösliga formen av IL-1RA är 5 gånger den hos intercellulära former. Trots den intensiva vetenskapliga sökningen är den sistnämnda funktionen fortfarande okänd. Eksperimety in vitro har visat att hämning av IL-1 beta-aktivitet erforderliga koncentrationen av IL-1 Pa 10-100 gånger överskrider den gräns i villkoren för in vivo kräver tusenfalt ökning i koncentrationen av IL-1 Pa. Detta faktum kan delvis förklara den relativa bristen på IL-1 RA och överskottet IL-1 i synovia hos patienter med artros.

Den andra klassen av naturliga hämmare av cytokiner representeras av lösliga receptorer av cytokiner. Exempel på sådana inhibitorer i humant relaterade till patogenes osteoartrou är rIL-1 R och PP55. Lösliga cytokinreceptorer är stympade former av normala receptorer genom att binda till cytokinet, hindrar de deras bindning till membran-associerade receptorer av målceller, i egenskap av en mekanism kompetitiv antagonism.

Huvudprekursorn för lösliga receptorer är membranbunden IL-1PP. Affiniteten för rIL-IP med avseende på IL-1 och IL-1 PA är annorlunda. Således har pIL-1PH en större affinitet för IL-1p än för IL-1 PA, och pIL-1PI visar en större affinitet för IL-1RA än för IL-ip.

För TNF finns det också två typer av lösliga receptorer - pp55 och pp75, som lösliga IL-1-receptorer, de bildas av "sheeding" (dumpning). In vivo finns båda receptorerna i vävnaderna hos de drabbade lederna. Rollen av lösliga TNF-receptorer i patogenesen av artros diskuteras. Det förmodas att i låga koncentrationer de stabiliserar den tredimensionella strukturen av TNF och öka halveringstiden för den bioaktiva cytokin, medan höga koncentrationer av PP55 och PP75 kan minska aktiviteten av TNF genom kompetitiv antagonism. Tydligen kan pp75 fungera som en bärare av TNF, underlätta dess bindning till den membranassocierade receptorn.

Den tredje klassen av naturliga hämmare av cytokiner representeras av en grupp av antiinflammatoriska cytokiner, vilka innefattar TGF-beta, IL-4, IL-10 och IL-13. Antiinflammatoriska cytokiner minskar produktionen av proinflammatoriska, liksom vissa proteaser, stimulerar produktionen av IL-1RA och TIMP.