Laboratoriediagnostik av tuberkulos

Tuberkulos är en sjukdom som är lätt att diagnostisera i moderna förhållanden och vetenskapliga prestationer. Laboratoriediagnostik av tuberkulos är central för andra diagnostiska metoder, andra enbart för röntgenmetoder för forskning.

[1], [2], [3], [4],

Kliniskt blodprov

Hos patienter med tuberkulos är förändringar i den allmänna analysen av blod inte patognomoniska. Med begränsade och inaktiva former av tuberkulos är erytrocyten hypokrom i normal mängd. När massiva infiltrat eller kaseös lunginflammation, medan förekomsten av kaseös lymfadenit specifika intestinala lesioner, liksom för stora lung- eller postoperativ blödning och notera erythropenia Microcytos, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytos och speciellt poikilotsitoz möts mycket mindre, vanligtvis med svår anemi. Antal retikulocyter vid steg tuberculosis kompenserad sträcker sig från 0,1 till 0,6%, med subcompensated - 0,6-1,0% och en% kännetecknas av icke kompenserade retikulocyter.

När tuberkulos i vissa fall kan det finnas en måttlig leukocytos (upp till 15 tusen av leukocyter.), Mindre strålning, som förekommer hos 2-7% av patienterna med begränsade och enkla process förekommande former och i 12,5% - genom destruktiv och progressiv lungtuberkulos .

De vanligaste skiftningarna förekommer i leukocytformeln. Markera både relativ och absolut neutrofili, en måttlig förändring av leukocytformeln till vänster före promyelocyter. Myelocyter är mycket sällsynta vid okomplicerad tuberkulos. En ökning av antalet neutrofiler med patologisk granularitet i hemogram hos en patient med tuberkulos indikerar alltid varaktigheten av processen: hos patienter med svår tuberkulos innehåller nästan alla neutrofiler patologisk granularitet. När det tuberkulära utbrottet upphör, närmar sig kärnväxeln relativt snabbt normalt. Neutrofilernas patologiska granularitet brukar kvarstå längre än andra förändringar i hemogrammet.

Innehållet av eosinofiler i perifert blod varierar också beroende på processens fas och organismens allergiska tillstånd. Deras mängd minskar upp till aneosinofili i svåra och långvariga utbrott av sjukdomen och omvänt ökar med resorption av infiltreringar och pleurala effusioner såväl som i de tidiga formerna av primär tuberkulos.

De flesta former av primär tuberkulos åtföljs av lymfopeni, som ibland observeras i ett antal år, även efter att det har skett några specifika förändringar. Sekundär tuberkulos i förvärringsfasen, beroende på svårighetsgraden av processen, kan åtföljas av antingen ett normalt antal lymfocyter eller lymfopeni.

Det upptar en särskild plats bestämning erytrocytsedimentationshastighet Ytterligare tester för att utvärdera tuberkulös förfarande (ESR), som har ett värde för att utvärdera processflödes tuberkulos och identifiera dess aktiva former. Ökning i ESR indikerar närvaron av den patologiska processen (infektiös-inflammatoriska, varbildande septisk, hemoblastosis, Hodgkin et al.) Och är en indikation på dess svårighetsgrad, men normala nivåer ESR inte alltid indikerar avsaknad av patologi. Accelereringen av erytrocytsedimentering underlättas av en ökning av innehållet i globuliner, fibrinogen, kolesterol i blodet och en minskning av viskositeten hos blodet. Att sänka ner erytrocytsedimenteringen är karakteristisk för tillstånd som åtföljs av hemokoncentration, en ökning av albumins och gallsyror.

Hemogrammet hos patienter med tuberkulos förändras under behandlingen. Hematologiska skift försvinner ju snabbare, desto mer framgångsrika den terapeutiska ingreppet. Man bör dock komma ihåg effekten på hemopoiesis av olika antibakteriella läkemedel. De orsakar ofta eosinofili, i vissa fall leukocytos och oftare leukopeni upp till agranulocytos och lymfoid-retikulär reaktion. Systematisk hematologisk kontroll och korrekt analys av de erhållna data är väsentliga för att bedöma patientens kliniska tillstånd, processens dynamik och effektiviteten av behandlingen som används.

[5], [6], [7], [8], [9],

Klinisk analys av urin

Med tuberkulos av urinvägarna är urinanalysen den viktigaste laboratoriediagnostiska metoden. Du kan observera leukocyturi, erytrocyturi, proteinuri, hypoisostenuri, tuberkulos mykobakterium, icke-specifik bakteriuri.

Leukocyturi - det vanligaste symtomet av tuberkulos i urinvägarna före kemoterapi och det finns ingen specifik endast i undantagsfall, till exempel fullständig utplåning av lumen i urinledaren. Nechyporenko testet (bestämning av antalet leukocyter i 1 ml urin) hjälper till att mer objektivt bedöma graden leukocyturia nefrotuberkuloze med, och i vissa fall för att identifiera det med normal urinanalys. Det måste emellertid beaktas att leukocyturi kan förekomma i akut och kronisk pyelonefrit, cystit, uretrit, njure och urinsten.

Eritrotsiturii. Såväl som leukocyturi. Anses vara ett av de vanligaste laboratorie tecknen på tuberkulos i genitourinary systemet. Frekvensen av hematuri beror på förekomsten av processen, den ökar när den destruktiva tuberkuloseprocessen utvecklas i njuren. Erytrocyturi utan leukocyturi är mer typisk för tidiga stadier av njurt tuberkulos. Hematuri, som dominerar över leukocyturi, är ett viktigt argument för nyre tuberkulos i dess differentiering med icke-specifik pyelonefrit.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biokemiskt blodprov

Med tuberkulos beror förändringar i vissa biokemiska parametrar huvudsakligen på processens fas, komplikationer och olika samtidiga sjukdomar. Hos patienter med inaktiv tuberkulos i lungorna och andra organ är de totala protein- och proteinfraktionerna i blodserum oförändrade och bestämmer deras normala innehåll.

I akuta former av sjukdomen, liksom med förvärring och progression av kroniska former av tuberkulos minskar albumin-globulinkoefficienten.

Väsentliga vid bedömningen av funktionella tillstånd av organisk skada och lever i tuberkulos och dess komplikationer är bestämningen av serum totalt och direkt bilirubin, AST (ACT), alaninaminotransferas (ALT). Dynamisk bestämning av nivån av aminotransferaser. Bilirubin vid behandling av tuberkulospasienter, särskilt i svåra former, är en obligatorisk komponent i en biokemisk undersökning av tuberkulospatienter och utförs varje månad.

Bedömning av njurens funktionella tillstånd innefattar bestämning av serumkreatinin och beräkning av glomerulär filtreringshastighet enligt Cockcroft-Gault-formeln. Beräkning av glomerulär filtreringshastighet med Rebergs prov ger mindre noggranna resultat.

Huvudmålet med dynamiska biokemiska studier av tuberkulospasienter är att övervaka processen, tidig upptäckt av biverkningar av läkemedel och adekvat korrigering av de uppkomna hemostatiska störningarna.

[17], [18], [19]

Tillämpning av biokemiska metoder för undersökning vid extrapulmonell tuberkulos

Den mest informativa indikatorn är innehållet i tuberculostearinsyra i biologiska vätskor, men dess definition är förknippad med tekniska svårigheter (behovet av gaskromatografi och masspektrometri).

Prospektiv mätning av aktiviteten av adenosindeaminas - ett enzym, bestämt i vätskor: synovial, perikardial, ascitisk eller spinal. De främsta tillverkarna av adenosindeaminas är lymfocyter och monocyter. Bestämning av adenosindeaminas aktivitet i biologiska vätskor underlättar diagnosen tuberkulossynovit, tuberkulos av lymfkörtlar, tuberkulos meningit, tuberkulosserosit.

Vissa biokemiska indikatorer på grund av deras icke-specificitet bestäms endast i biologiska vätskor, nära läsningsfokus. Mät nivåerna av indikatorer som svar på subkutan eller intradermal injektion av tuberkulin (vanligtvis före och 48 och 72 timmar efter det). Efter detta beräknas graden av ökning av markörsnivån (i%) med hänsyn till initialnivå.

Optimal bestämning i urinen av aktiviteten hos ett organspecifikt enzym av transamidas, vars utseende noteras vid nederlag av njurar av olika slag. Studien av transamidinas är endast motiverad under betingelser för subkutan injektion av tuberkulin för att förvärra den lokala inflammatoriska processen. Bestäm aktiviteten av transamidin i urinen initialt och 24-72 timmar efter införandet av 50 TE tuberkulin. Utvidgningen av fermentia i 2 gånger och mer tillåter i 82% av fallen att differentiera aktiv tuberkulos hos njurarna från förvärring av kronisk pyelonefrit.

Med tuberkulos av kvinnliga könsorganen bestäms koncentrationerna av haptoglobin och malonaldialdehyd i blodet under förhållanden av ett provokerande tuberkulinprov. Subkutant injicerat tuberkulin i en dos av 50 TE och 72 timmar senare utfördes en andra biokemisk studie. I fallet med tuberkulosetiologi är graden av ökning i haptoglobinnivå inte mindre än 28% och malondialdehydnivån är 39% eller mer. Bestämningen av aktiviteten av adenosindeaminas i en peritoneal vätska erhållen från Douglas-rymden används också. Punktatet undersöks om 72 timmar efter intradermal injektion av tuberkulin vid doser av 0,1 TE och 0,01 TE i projiceringen av de inre genitala organen på den främre bukväggen. Till förmån för tuberkuloseprocessen är en ökning av aktiviteten av adenosindeaminas 10% eller mer i jämförelse med den initiala.

När ögat påverkas undersöks fokalreaktionen som uppträder i ögat som svar på antigenstimulering. Det är oönskade att utveckla ett uttalat svar, åtföljt av en minskning av visuella funktioner. Eftersom bedömningen av minimala fokalreaktioner ofta är svår, är det för att objektiveringen av slutsatsen rekommenderas att orientera parallellt och på graden av tillväxt i blodserum av haptoglobin eller adenosindeaminas.

Alla biokemiska studier bör genomföras tillsammans med andra metoder.

[20], [21], [22], [23],

Blodkoagulationssystemforskning

Forskningens relevans status blodkoagulering systemet av TB orsakas av närvaron av ett antal patienter med pulmonell hemoptys tuberkulos eller lungblödning, samt hemocoagulation komplikationer i kirurgisk behandling av tuberkulos. Dessutom påverkar det latenta flödet av intravaskulär hemokoagulering som naturligt följer tuberkulos sjukdomsförloppet och effektiviteten av kemoterapi.

Hos patienter med lungtuberkulos prevalens av exsudativ inflammation komponent i den observerade minskningen i blod antikoagulationsaktivitet. Hos patienter med låg prevalens av en specifik skada i lungorna med en dominans av produktiv hemocoagulation intravaskulär inflammatorisk komponent uttryckt något. Hos patienter med lungtuberkulos med hemoptys och pulmonell blödning state blodkoagulering systemet är annorlunda: hos patienter med låga blodförlust på höjden gemoptoe eller omedelbart efter dess avslutning finns det en kraftig ökning av blodkoagulering förmåga till följd av svår intensifiering av trombinoobrazovaniya medan ökad "strukturell" koagulering upprätthållande. Hos patienter med massiv blodförlust observeras en minskning av koagulationspotentialen på grund av en minskning av koncentrationen av fibrinogen. Faktor XIII aktivitet, trombocytantal. Vid kirurgisk behandling upplever patienter med begränsade former av tuberkulos inte svaga signifikanta störningar i hemostasystemet. Patienter med utbredd process i genomförandet av pnevmon- eller plevropnevmonektomii utvecklas ofta DIC, vilket kan ske i form av "andra sjukdomar."

Att övervaka tillståndet av blodkoagulering hos patienter med lungtuberkulos bör utföras bestämning av den aktiverade partiella tromboplastintiden (aPTT), fibrinogen, trombin tid, protrombin index och blödningstid och koagulationstiden.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonal forskning

Moderna experimentella och kliniska observationer indikerar närvaron av förändringar i hormonstatusen i en specifik tuberkulös lunginflammation. Det är bevisat att korrigeringen av dysfunktion av hypofysen-binjure, hypofys-sköldkörtel system och bukspottkörtelns funktion i samband med anti-TB-terapi bidrar till aktivering av fibrogenes och reparation vid ett lokus specifik inflammation.

Den funktionella tillståndet hos hypofys-sköldkörtel systemet bedöms av innehållet i blodserum av trijodtyronin (T ₃ ), tyroxin (T ₄ ), hypofysen tyroidstimulerande hormon (TSH). Det konstaterades att subklinisk hypotyreos upptäcks i 38-45% av patienter med lungtuberkulos, och oftast den diagnostiseras med disseminerad och fibro-cavernous former process. Under dessa samma former flesta dramatiskt reducerade nivåer av både T ₃ och T ₄, och det kommer en obalans av dessa hormoner i form av ökning av förhållandet T ₄ / T _s.

Funktionen hos binjuren utvärderas av nivån av kortisol i blodserumet och den inkrementella funktionen av bukspottkörteln genom koncentrationen av det immunreaktiva insulinet. I den akuta fasen av den smittsamma sjukdomen ökar behovet av endogen kortisol och insulin. Hyperinsulinemi vittnar också mot insulinresistensen hos kroppsvävnader, vilket är typiskt för alla aktiva inflammatoriska processer, särskilt specifika. Bestämning av binjurskörtelns glukokortikoidfunktion med aktiv lungtubberkulos gör det möjligt att avslöja förekomsten av hyperkorticism hos majoriteten av patienterna. Normala nivåer av kortisol blodkoncentrationen i patienten med infektiös inflammation i den akuta perioden bör betraktas som relativa misslyckandet av glukokortikoid funktion av binjurebarken som kan ligga till grund för att hålla doser adekvat ersättningsterapi av glukokortikoider.

Nästan en tredjedel av patienterna med lungtubberkulos kan konstatera att nivån av insulinemi i dem är ganska låg och närmar sig den nedre gränsen för normen medan 13-20% observerar signifikant hyperinsulinism. Både relativ hypo- och hyperinsulinism är höga riskfaktorer för utveckling av överträdelser av kolhydratmetabolismen i varierande grad. Dessa förändringar i den funktionella aktiviteten hos pankreatiska B-celler kräver regelbunden övervakning av glykemi hos patienter med tuberkulos och tidig förebyggande av diabetes mellitus. Dessutom. Detta tjänar som en ytterligare berättigande för att det är lämpligt att använda fysiologiska doser insulin i komplex terapi av tuberkulos.

I allmänhet lägre nivåer av sköldkörtelhormoner och deras obalans hyperkortisolemi och hyperinsulinism störst räckvidd i patienter med svår loppet av tuberkulös process, med omfattande lungskador och svåra symtom på förgiftning tuberkulos.

Mikrobiologisk diagnos av tuberkulos

Mikrobiologiska studier är nödvändiga för att identifiera patienter med tuberkulos, verifiera diagnosen, övervaka och korrigera kemoterapi, utvärdera behandlingsresultat, det vill säga från det ögonblick patienten är registrerad hos tuberkulos innan den tas av.

Alla epidemiologiska program och projekt baseras på en bedömning av antalet bakteriella excretorer, vilket inte kan göras utan att använda laboratoriemetoder för att upptäcka mykobakteriella tuberkulos. I en undersökning av den så kallade oorganiserade befolkningen når andelen bakteriella invaderare 70 eller mer, vilket gör laboratoriemetoder till ett tillräckligt effektivt sätt att identifiera tuberkulospasienter bland denna befolkningsgrupp.

Traditionella mikrobiologiska metoder för att diagnostisera tuberkulos är bakterioskopiska och kulturstudier. Moderna metoder överväger odling av mycobacterium tuberkulos i automatiserade system, inställning av PCR. Men alla dessa metoder kombinerar nödvändigtvis med klassiska bakteriologiska metoder.

Insamling av diagnostiskt material

Effekten av laboratoriestudier beror i stor utsträckning på kvaliteten på det diagnostiska materialet. Överensstämmelse med reglerna för insamling, lagring och transport av diagnostiskt material och det exakta genomförandet av patientbedömningsalgoritmen påverkar direkt resultatet och säkerställer biologisk säkerhet.

För testning på tuberkulos används en mängd olika material. På grund av det faktum att TB logkih- vanligaste formen tubercular lesioner, den grundläggande material för forskning anser sputum och andra typer av löstagbara trakeobronkiala: övre luftvägssekret erhållna efter aerosolinhala: bronkiala tvätt; bronchoalveolära sköljningar; material som erhållits genom bronkoskopi, och intrapulmonell transtrakeal biopsier från bronkiala utsugna prover, laryngeala kompresser, exsudat från sår och utstryk al.

Effektiviteten av forskning ökar om en kontrollerad samling av material från en patient utförs. För detta ändamål tilldelas ett specialutrustat rum eller specialkabiner köpas. Samlingen av material är ett farligt förfarande, därför är det nödvändigt att samla in material för forskning, iakttagande av infektionssäkerhetens regler.

Materialet för testning på mycobacterium tuberculosis samlas i sterila flaskor med tätt skruvade kepsar för att förhindra att miljön förorenas och skydda det uppsamlade materialet från förorening.

Injektionsflaskor för insamling av diagnostiskt material måste uppfylla följande krav:

• måste vara gjord av slagbeständigt material;
• bör smälta lätt under autoklavering;
• ha tillräcklig volym (40-50 ml):
• ha en bred öppning för sputumuppsamling (diameter inte mindre än 30 mm);
• vara lätt att hantera, genomskinligt eller genomskinligt, så att du kan bedöma kvantiteten och kvaliteten på det samlade provet utan att öppna locket.

För att få optimala forskningsresultat måste följande villkor följas:

• Samla materialet före kemoterapiens början.
• Material för studien måste samlas före morgonintaget av mat och medicin.
• För forskning är det önskvärt att samla minst 3 prover av morgonslim. Samla sputum i 3 på varandra följande dagar;
• Det samlade materialet ska levereras till laboratoriet så snart som möjligt:
• Om det omedelbart är omöjligt att leverera materialet till laboratoriet, förvaras det i kylskåp vid en lufttemperatur på 4 ° C i högst 48 timmar.
• Vid transport av materialet är det nödvändigt att noggrant övervaka flaskans integritet.

Korrekt uppsamlat sputum är slim eller mucopurulent. Den optimala volymen av det testade sputumet är 3-5 ml.

Sputum samlas under överinseende av en medicinsk professionell. Personer med ansvar för sputuminsamling bör följa genomförandet av vissa regler:

• Det är nödvändigt att förklara för patienten syftet med studien och behovet att hosta upp inte saliv eller nasofaryngealt slem, men innehållet i djupt luftvägar. Detta kan uppnås som ett resultat av en produktiv hosta som uppstår efter flera (2-3) djupa andetag. Det är också nödvändigt att varna patienten att han ska skölja sin mun med kokt vatten för att avlägsna huvuddelen av mikrofloran som växer i munhålan och matrester som hindrar undersökningen av sputum.
• en sjuksköterska som deltar i sputumsamling, förutom en badrock och en hatt, måste ha en mask, gummihandskar och ett gummiförkläde;
• står bakom patienten, rekommenderas han att hålla flaskan så nära som möjligt på läpparna och omedelbart separera in i slem när det hostar, och det måste finnas att luftflödet riktas bort från vårdpersonal:
• Efter avslutad sputumuppsamling ska hälsovårdsarbetaren noggrant stänga injektionsflaskan med lock och utvärdera kvantiteten och kvaliteten på det samlade sputumet. Sedan märks flaskan och placeras i en speciell bix för transport till laboratoriet.

Om patienten inte producerar slem, kvällen innan och tidigt på morgonen den dag då insamlingen av material som behövs för att ge honom en slemlösande :. Ett extrakt av rötter marshmallow (mukaltin), bromhexin, ambroxol, etc. - eller tillämpa en irriterande inhalation med hjälp av utrustning som installeras i rummet för att samla in sputum. Det material som samlas på detta sätt är inte föremål för bevarande och bör undersökas på dagen för insamling. För att undvika att "culling" i laboratoriet i riktningen ska göra ett särskilt märke.

Om mikrobiologiska studier inte utförs vid denna anläggning ska det samlade diagnostiska materialet levereras centralt till laboratoriet, förutsatt att materialet bevaras i intervallen mellan leveranser i kylskåp eller med konserveringsmedel. Leverera material till laboratoriet i transportlådorna, som lätt kan desinficeras. Varje prov ska förses med lämplig etikett, och hela partiet ska fyllas med en kompletterande blankett.

[29], [30], [31],

Modeller och frekvens av undersökning av patienter

Vid den initiala, så kallade diagnostiska undersökningen av patienten för tuberkulos är det nödvändigt att undersöka minst 3 sputumpartier i 2 eller 3 dagar. Samlas under övervakning av medicinsk personal, vilket ökar effektiviteten av mikroskopi.

Den primära screeningen för tuberkulos bör utföras av alla medicinska diagnostiska institutioner i hälsovårdssystemet. Nyligen har så kallade mikroscopiccentraler, utrustade med moderna mikroskop och utrustning för epidemisäkerhet, organiserats på grundval av kliniska diagnostiska laboratorier för att förbättra effektiviteten vid den inledande undersökningen.

I anti-TB-anläggningar används ett screeningstest som innefattar sputumundersökning eller annat diagnostiskt material i minst 3 gånger i 3 dagar. Under behandlingen utförs mikrobiologiska studier regelbundet minst en gång i månaden under den intensiva kemoterapifasen. Vid övergången till behandlingsfasen utförs studier mindre ofta - med ett intervall på 2-3 månader, medan studiens frekvens minskas till två.

Funktioner i samlingen av diagnostiskt material för extrapulmonell tuberkulos

Har patologiskt material med extrapulmonell former av TB - Mycobacterium tuberculosis låg koncentration i den, vilket kräver en mer känsliga metoder för mikrobiologiska studier, primärt på sådd tekniker medium.

Med tuberkulos i genitourinary systemet är urin det mest tillgängliga studiematerialet. Urinsamling bör göras av en specialutbildad sjuksköterska.

De yttre könsorganen tvättas med vatten med tvål eller en svag lösning av kaliumpermanganat. Urinrörets yttre öppning behandlas noggrant. I en steril flaska samlas en genomsnittlig del av morgonurinen: hos män, naturligtvis hos kvinnor, med hjälp av en kateter. Urin från njurbäckenet uppsamlas i sterila rör med kateterisering av en eller två njurar, i det senare fallet - nödvändigtvis separat från varje njure. En liten mängd av denna urin centrifugeras, sedimentet undersöks.

Hos män, sperma, punkta testiklar utsätts prostats hemlighet för centrifugering för erhållande av en fällning. Med någon lokalisering av en specifik process i könsorganet hos män kan prostationsmassage främja sekretionen av sekret som innehåller mycobacterium tuberkulos.

Menstruationsblod hos kvinnor samlas in genom att suga eller använda en Kafka-keps. Det erhållna materialet befrias från röda blodkroppar, tvättar det med destillerat vatten följt av centrifugering. Fällningen undersöks.

Tilldelningar från livmoderns livmoderhalscancer uppsamlas i någon Kafka-kapacitet eller -kapsel, det vill säga att det är önskvärt att ackumulera 1-2 ml patologiskt material.

Material erhållet från operativa ingrepp på njurarna, könsorganen. Med biopsier, skrapningar från endometrium, homogenisera. För att göra detta placeras den i en steril murbruk och krossas noggrant med steril sax. Till denna uppslamning sattes sterilt flodsand i en mängd lika med dess vikt och sedan fyllas på med 0,5-1.0 ml isoton natriumkloridlösning, och allt triturerades tills en pastaartad massa med tillsats av isotonisk natriumkloridlösning (4-5 ml). Sedan får massan sedimentera i 1-1,5 minuter, supernatanten undersöks.

Tuberkulos av ben och leder. Punctaten (pus av abscesser) erhållen med en steril spruta placeras i sterila rätter och omedelbart levereras till laboratoriet. Steril pipett, tidigare fuktad med steril isotonisk natriumkloridlösning, tar 2-5 ml pus, överför den till en flaska pärlor och tillsätt ytterligare 2-3 ml isotonisk natriumkloridlösning. Flaskan är stängd med en kork och skakad i en joker-apparat i 8-10 minuter. Den homogeniserade suspensionen undersöks.

I fistösa former av osteoartikulär tuberkulos tas pus från fisteln. Den rikliga urladdningen samlas in direkt i ett provrör. I fall mager pyorrhea fistel tvättades med steril isotonisk natriumkloridlösning, och tvättvätskorna uppsamlades i ett provrör, eller den bit av tampongen impregnerat med pus skickas för analys.

Det kirurgiska material som erhållits under kirurgiska ingrepp på ben och leder kan bestå av purulenta nekrotiska massor, granuleringar, ärrvävnad, benvävnad, synovial membranvävnad och andra substrat. Dess behandling utförs som hos tuberkulos av njurarna.

Mikrobiologisk undersökning av synovialvätska i en 3% lösning av natriumcitrat (1: 1 förhållande) för att förhindra koagulering utförs omedelbart efter punkteringen.

Tuberkulos av lymfkörtlarna. Pusen, extraherad under punkteringen av lymfkörtlarna, undersöks också. Som pus av abscesserna. Vävnaderna i lymfkörtlarna som erhållits under kirurgiska ingrepp, biopsier, undersöks, som med andra former av tuberkulos.

Studien av avföringsmassor på mycobacterium tuberculosis är extremt sällsynt, på grund av den nästan totala bristen på positiva resultat.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacteriummikroskopi

Sputummikroskopi är en relativt snabb, enkel och billig metod som borde användas i alla fall med misstänkt tuberkulos. Dessutom utförs denna studie för att utvärdera effektiviteten av kemoterapi och för att fastställa återhämtning eller misslyckande av behandlingen om det inte finns något odlingstest.

Två metoder för mikroskopisk undersökning används:

• Metod för direktmikroskopi, när ett smet framställs direkt från det diagnostiska materialet;
• Metod för mikroskopi av ett sediment framställt från dekontaminantbehandlat material för odling.

Den första metoden används i de laboratorier där endast mikroskopiska studier utförs (kliniska och diagnostiska laboratorier i det allmänna medicinska nätverket).

De bästa resultaten av mikroskopisk undersökning erhålls genom att man koncentrerar det diagnostiska materialet (till exempel genom centrifugering).

För att detektera mycobacterium tuberculosis med en sannolikhet på 50% vid genomförandet av mikroskopi bör 1 ml sputum innehålla mer än 5000 mikrobiella celler. Sputumet hos patienter med lungformar av tuberkulos innehåller vanligtvis en betydande mängd syrafasta bakterier, vilket gör att de kan påvisas på ett tillförlitligt sätt genom bakterioskopi. Den diagnostiska känsligheten hos denna metod kan förbättras genom att undersöka flera sputumprover från en patient. Ett negativt resultat av en bakterioskopisk undersökning utesluter inte diagnosen tuberkulos, eftersom sputum hos vissa patienter innehåller mindre mykobakterier än det som kan detekteras med mikroskopi. Dålig förberedelse av sputum smet kan också orsaka ett negativt resultat av en bakterioskopisk undersökning.

Den vanligaste metoden för detektering av syrafasta mykobakterier i smeten är färg enligt Tsiol-Nelsen. Metoden är baserad på penetrationen av karbolfuchsin i en mikrobiell cell genom ett membran som innehåller ett vaxartat lipidlager samtidigt som den upphettar och stark etsningsverkan av fenol. Efterföljande missfärgning av smeten med en 25% lösning av svavelsyra eller 3% saltsyra leder till missfärgning av alla icke-syrafasta strukturer. De missfärgade elementen i smeten färgas med en 0,3% lösning av metylenblå. Mykobakterier uppfattar inte de vanliga anilinfärgämnena, vilket resulterar i vilka syrafasta mykobakterier är färgade crimson-röda och andra mikrober och cellulära element - i blått.

För att studera smutsarna som färgas av Tsilyu-Nelsen, använd ett ljust binokulärt mikroskop med ett nedsänkningsmål (90- eller 100-faldig förstoring) och ett okular med 7- eller 10-faldig förstoring. Utforska 100 synfält, som är tillräckliga för att identifiera enskilda mykobakterier i smeten. I händelse av att resultatet av en sådan studie är negativ, rekommenderas för bekräftelse att se ytterligare 200 synfält. Spela in resultaten, vilket indikerar antalet upptäckta syrafasta baciller (KUM).

Förutom denna teknik används färgfluorokromer för luminescerande mikroskopi, vilket möjliggör bästa resultat. Användningen av denna metod ökar effektiviteten hos mikroskopi med 10-15%. Vid behandling av mykobakterier med luminescerande färgämnen (auramin, rhodamin, etc.) binder dessa ämnen också till de vaxliknande strukturerna i den mikrobiella cellen. När man bestrålar färgade celler med en spännande ljuskälla (ett visst spektrum av ultraviolett strålning) börjar de att lysa med orange eller ljust rött ljus på en svart eller mörkgrön bakgrund. På grund av den synliga bildens höga ljusstyrka och kontrast kan den totala förstoringen av mikroskopet minskas 4-10 gånger, synfältet breddas och förberedelsens visningstid minskar. Tillsammans med detta på grund av det mycket större skärpedjupet kan du öka studiens komfort.

När fluorescensmikroskopi används för att skanna samma område expanderar smetet betydligt mindre tid än ljusmikroskopi av Tsiol-Nelsen-färgningen. Om en arbetsdag undersöker ett mikroskop om 20-25 sådana smuts, då kan man med hjälp av fluorescensmikroskopi undersöka mer än 60-80 prover samtidigt. Erfaren mikroskopister vet att färgningen av celler med en blandning av auramin och rhodamin på något sätt är specifik för sura baciller, vilket i detta fall ser ut som guldpinnar. Saprofyter är målade i en grön färg.

En annan viktig fördel med förfarandet av fluorescerande mikroskopi - förmågan att detektera förändrade mykobakterie, förlorade under inflytande av negativa faktorer, inklusive intensiv kemoterapi, kislotousotoychivosti egendom och detekteras inte i samband med denna färgning Ziehl-Nelsenu.

Nackdelarna med metoden för fluorescensmikroskopi inkluderar den relativt höga kostnaden för mikroskopet och dess drift. I centrala eller andra stora laboratorier, där lasten överstiger normen hos 3 laboratorie tekniker som arbetar med tre konventionella mikroskop, är det emellertid billigare att använda ett fluorescerande mikroskop istället.

Bakterioskopiska metoder har ganska hög specificitet (89-100%). Omkring 97% av de positiva resultaten som erhållits med någon metod för mikroskopi bekräftas entydigt av resultaten av sådd.

Det bör noteras att vid mikroskopisk undersökning av smet av patologiskt material är det omöjligt att bestämma vilka arter som hör till de identifierade syrafasta mykobakterierna. Mikroskopi metoden tillåter att avge ett yttrande endast på närvaro eller frånvaro av syra vid framställning av mikroorganismer, vilket kan förklaras av att det finns i naturen av ett stort antal morfologiskt liknar tuberkelmykobakterier komplexa nontubercular syraresistenta mikroorganismer.

Resultaten av mikroskopi utvärderas i halvkvantitativa enheter.

För att kunna jämföra resultaten av olika metoder för mikroskopi införs empiriska koefficienter. Till exempel för att jämföra resultaten av utstryk färgade med fluorescerande färgämnen, är dataforskningsljusmikroskop (1000 gånger förstoring) det nödvändigt att dividera antalet syrafasta baciller detekteras av fluorescensmikroskop, motsvarande koefficient vid 250-faldig förstoring - till 10, 450 gånger - till 4, med 630 gånger - till 2.

Egenskaper hos mikroskopi för extrapulmonell tuberkulos

Direktmikroskopi utförs, såväl som mikroskopi av utstrykningar framställda efter anrikning, följt av Tsiol-Nelsen-färgning eller luminescerande färgämnen. Direkt mikroskopi av smuts är ineffektiv på grund av en låg koncentration av mykobakterier i materialet, och därför är det mer rationellt att använda anrikningsmetoder. Den mest effektiva är centrifugering. Om det biologiska materialet är visköst, är centrifugering appliceras under samtidig kondensering och homogenisering av materialet, som utförs med användning av höghastighets centrifuger med centrifugalkraft på 3000 g och hypokloritlösningar. Andra metoder för berikning, såsom mikroflotation, används för närvarande inte på grund av bildandet av biologiskt farliga aerosoler.

[37], [38],

Den kulturella metoden för diagnos av tuberkulos

Metoden för sådd eller odlingsmetoden är känsligare än smörsmikroskopi och har ett antal fördelar över det senare. Det gör det möjligt att upptäcka flera dussintals livskraftiga mykobakterier i testmaterialet och har ett stort diagnostiskt värde. Detta är särskilt viktigt när man undersöker ett material från ny diagnostiserade eller behandlade patienter som släpper ut en liten mängd mykobakterier.

Jämfört med mikroskopi möjliggör kulturforskning att antalet TB-patienter diagnostiseras med mer än 15-25%, samt att verifiera tuberkulos i tidigare steg när sjukdomen fortfarande är mottaglig för behandling. En väldigt viktig fördel med odlingstestet är möjligheten att erhålla en exciterkultur som kan identifieras och studeras med avseende på läkemedelskänslighet, virulens och andra biologiska egenskaper.

Nackdelarna med odlingsmetoder inkluderar deras varaktighet (väntetiden för material når 10 veckor). Högre kostnad, komplexitet vid behandling av diagnostiskt material.

Principer för presowing behandling av diagnostiskt material

Konventionella mikrobiologiska metoder kan inte användas vid studier av tuberkulos. Detta beror på det faktum. Att mycobacterium tuberculosis växer mycket långsamt, och de flesta kliniska prover innehåller snabbväxande pyogena och putrefaktiva mikroorganismer, svampar. Deras snabba tillväxt på rika näringsämnen påverkar utvecklingen av mykobakterier och tillåter inte isolering av orsaksmedlet för tuberkulos, så det diagnostiska materialet måste förbehandlas före sådd. Dessutom är mykobakterier som frigörs från patientens luftvägar vanligen omgivna av en stor mängd slem, vilket gör det svårt att koncentrera dem. I detta hänseende är det nödvändigt att försvaga dekontaminering före plantering av sputum och andra liknande material.

Alla tvättmedel och dekontaminer har en mer eller mindre uttalad toxisk effekt på mykobakterier. Till följd av bearbetning kan upp till 90% mykobakterier dö. Att hålla tillräckligt av mykobakteriella befolkningen och skonar behovet att använda bearbetningstekniker som tillåter, å ena sidan, för att undertrycka de snabbt växande pyogena bakterier och unken, och å andra sidan - för att bevara livskraften hos mykobakterier som föreligger i materialet.

Beroende på materialet, dess grad av homogenitet och föroreningar för förbehandling med användning av olika saneringsmedel: Sputum - 4% natriumhydroxidlösning, lösningar trohzameschonnogo natriumfosfat 10%, bensalkoniumklorid, trinatriumfosfat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cystein natriumhydroxid) vid en slutkoncentration av 1% NaOH, i urin och andra flytande material - svavelsyralösning 3%, för de förorenade proverna, fetthaltiga material - lösning av oxalsyra till 5%. Dessutom används i vissa fall enzymer, ytaktiva ämnen (tvättmedel). Användningen av Tween och några andra tvättmedel åtföljs av en mindre död av mykobakteriella celler (40-50% överlever). De kan dock endast användas för flytande material. Den största distributionen i världen var NALC-NaOH. Producerad i uppsättningar. Med denna metod kan man fördela mer än 85% av populationen av mykobakteriella celler. Dekontaminering av tyginnehållande fasta material är svårare eftersom det är svårt att gissa graden av dispersion av materialet under homogeniseringsprocessen. Till exempel åtföljs behandlingen av biopsier av lymfkörtlar ofta av ökad frekvens av förorening av främmande flora. I detta fall kan 1% etonium användas.

Icke homogent material homogeniseras med glaspärlor i närvaro av dekontaminanter. De vätskeformiga materialen för-centrifugeras och endast en fällning behandlas.

Sånings- och inkubationsteknik

Efter förbehandling centrifugeras materialet och därigenom utfäller mykobakterierna och ökar deras innehåll i sedimentet ("slamberikning"). Den resulterande fällningen neutraliseras och ympas (inokuleras) med täta näringsmedier eller rör med flytande (halvflytande) medium. Från resten av sedimentet utförs smuts för mikroskopisk undersökning. Söttekniken bör förhindra korskontaminering av det diagnostiska materialet.

För en tillförlitlig klinisk tolkning av resultaten av en mikrobiologisk studie måste följande regel följas: mikroskopiska och kulturstudier måste utföras parallellt från samma prov av det diagnostiska materialet.

De inokulerade rören placeras i en termostat vid 37 ^° C i 2 dagar i ett horisontellt läge. Detta säkerställer en jämnare absorption av materialet i odlingsmediet. Efter 2 dagar överförs rören till vertikalt läge och hermetiskt förseglade med gummi eller silikonpluggar för att förhindra torkning av det såda mediet.

Grödor inkuberas vid 37 ^om C under 10-12 veckor med regelbundna vecko visning. För varje förhandsgranskning registreras följande parametrar:

• perioden visuellt observerad från dagen för såddtillväxt
• tillväxthastighet (antal CFU)
• kontaminering av grödan med en extern mikrobiell flora eller svampar (sådana rör avlägsnas);
• brist på synlig tillväxt. Rören lämnas i termostaten till nästa visning.

Näringsämnen

Olika näringsmedia används för odling av mykobakterier; tät, halvvätska, flytande. Inget av de kända näringsmedierna har emellertid egenskaper som säkerställer tillväxten av alla mykobakteriella celler. I samband med detta rekommenderas 2-3 näringsmedia med olika kompositioner att användas samtidigt för att öka effektiviteten.

WHO rekommenderar Levenstein-Jensen-miljön som standardmedium för primär isolering av orsaksmedlet för tuberkulos och för bestämning av dess läkemedelskänslighet. Detta är en tät äggmiljö där tillväxten av mykobakterier erhålls den 20: e 25: e dagen efter sådd av ett bakterioskopiskt positivt material. Växter av bakterioskopiskt negativt material kräver en längre inkubationsperiod (upp till 10-12 veckor).

I vårt land, den föreslagna E.R. Finn äggmiljö Finn-II. Det skiljer sig därför att i stället för L-asparagin använder det natriumglutamat, vilket utlöser andra sätt att syntetisera aminosyror av mykobakterier. Tillväxten framträder på detta medium något tidigare, och frekvensen för tilldelning av mykobakterier är 6-8% högre än i Lowenstein-Jensen-mediet.

För att förbättra effektiviteten hos bakteriologisk diagnos av extrapulmonell tuberkulos är det lämpligt att inkludera modifierade Finn-II-medier i komplexet av näringsmedia. För att påskynda tillväxten tillsätts dessutom en natriumtioglykolat 0,05%, som minskar koncentrationen av syre, till Finn-II näringsmediet. För att skydda mycobakteriens enzymsystem från giftiga lipidperoxidationsprodukter i Finn-II näringsmediet tillsätts antioxidant-a-tokoferolacetat i en koncentration av 0,001 μg / ml. Sötningen av det diagnostiska materialet utförs enligt en standardprocedur.

I Rysslands anti-tuberkuloslaboratorier används också andra modifieringar av täta näringsmedier. Föreslagna G.G. Mordovian näringsmedium "New", utvecklat av V.A. Anicic Nutrient Media A-6 och A-9, etc.

På grund av det faktum att i processen för kemoterapi är skador på olika metaboliska system av mikrobiella celler, förlorar en del mykobakteriella befolkningen förmågan att utvecklas normalt i konventionella näringsmedia och kräver osmotiskt balanserad (eller halvflytande) odlingsmedia.

Bedömning och registrering av såddresultat av diagnostiskt material

Vissa stammar och arter av mykobakterier växer långsamt, tillväxt kan förekomma även vid den 90: e dagen. Antalet sådana grödor är liten, men det gör det möjligt att klara avgrödor i en termostat i 2,5-3 månader.

Virulenta kulturer av mycobacterium tuberculosis växer vanligtvis på täta äggmiljöer i form av R-form kolonier av olika storlekar och arter. Kolonier torr, skrynklig, elfenben, något pigmenterad. I andra medier kan kolonin av mycobacterium tuberkulos vara mer fuktig. Efter en behandling med kemoterapi eller under behandling kan smidiga kolonier med fuktig tillväxt (S-former) tilldelas.

Vid isolering av grödor används en uppsättning specialstudier för att särskilja mycobacterium tuberculosis från icke-tuberkulosa mykobakterier och syrabeständiga saprofyter.

Ett positivt svar ges efter en obligatorisk mikroskopisk undersökning av den färgade Tsiol-Nelsen-smeten från de odlade kolonierna. När det gäller tillväxt av mykobakterier i smuts, finns ljusa röda pinnar som ljuger enskilt eller i grupper som bildar kluster i form av filt eller flätor. I unga kulturer, särskilt isolerade från långtidsbehandling av patienter med kemoterapi, mykobakterier skilja den uttryckta polymorfism, tills förekomsten av stavformade, tillsammans med korta, nästan kockoida eller långsträckta versioner som liknar mycel.

Tillväxten av mykobakterier indikeras med följande schema: (+) - 1-20 cfu in vitro (skarp bakteriell utsöndring); (++) - 20-100 CFU in vitro (måttlig bakteriell utsöndring); (+++) -> 100 CFU in vitro (riklig bakteriell utsöndring). I laboratoriediagnosen av tuberkulos räcker det inte att svara på om mykobakteriet detekteras med en eller annan metod. Ha en detaljerad förståelse för mycobakteripopulationens omfattning och natur, dess sammansättning och egenskaper. Det är dessa data som gör det möjligt för oss att korrekt tolka processens tillstånd, planera taktik och korrigera behandlingen i rätt tid.

Under de senaste åren för att påskynda tillväxten av mykobakterier har näringsämnen på agarbasis med olika tillväxtadditiv och användning av en speciell gasblandning föreslagits. För att få tillväxten av mykobakterier på dessa medier skapas under odling en atmosfär med högt koldioxidinnehåll (4-7%). Speciella CO ₂ -inkubatorer används för detta ändamål . De mest utvecklade automatiserade systemen för odling av mykobakterier: MGIT-BACTEC-960 och MB / Bact.

Ett sådant system - MGIT systemet (mykobakterier tillväxt indikerar rör), som hänvisar till utvecklingen av högteknologi och är avsedd för snabb bakteriologisk diagnos av tuberkulos och Mycobacterium mottaglighet för första linjens läkemedel, och vissa andra linjens läkemedel. MGIT fokuserar på att använda den som en del av VASTES-960-enheten. Mikroorganismer odlas i speciella rör med ett flytande näringsmedium baserat på det modifierade Middlebrook-7H9-mediet. För att stimulera tillväxten av mykobakterier och undertrycka tillväxten av extern mikroflora används MGIT Growth Supplement och en blandning av PANTA antibakteriella läkemedel.

Tillväxten av mikroorganismer registreras optiskt. Det är baserat på fluorescens, vilket uppstår när syre konsumeras av mykobakterier under tillväxt. Oxygenberoende fluorokromfärg finns på undersidan av ett speciellt provrör och täckt med ett silikonskikt. Reproduktion mykobakterier leder till en minskning i mängden syre i röret och minskning av koncentrationen som orsakar en ökning i fluorescens, som blir synlig under bestrålning av ultravioletta lysrör och registreras automatiskt foto inbyggda apparat VASTES-960. Intensiteten av luminescens registreras i tillväxtenheter (GU-tillväxtenheter). Tillväxtdata registreras i datorn, där de kan sparas automatiskt. Datoranalys av tillväxtkurvor kan ge information om förekomsten av en mängd olika Mycobacterium pooler, inklusive nontubercular, och bidrar också till att utvärdera tillväxtegenskaper mykobakterier.

Som ett resultat av införandet av sådana system minskade tiden för tillväxten av mykobakterier signifikant, medeltal 11 dagar på VASTES-960 och 19 dagar på MB / Bact kontra 33 dagar på ett standardtät näringsmedium. Det bör noteras att dessa system kräver högkvalificerad personal. Såningen av materialet på flytande media är nödvändigtvis åtföljt av sådd på Levenstein-Jensen-mediet, som spelar rollen som en säkerhetskopia i de fall där mykobakteriet tuberkulos inte ger upphov till andra medier.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Bestämning av mykobakteriens läkemedelskänslighet

Bestämning av spektrum och graden av känslighet för mykobakterier mot anti-tuberkulosläkemedel är av stor klinisk betydelse, liksom för den epidemiologiska utvärderingen av spridningen av tuberkulos med läkemedelsresistens. Dessutom möjliggör övervakning av läkemedelsresistens att utvärdera effekten av tuberkulosprogrammet som en helhet, vilket är en integrerad indikator på utförandet av alla komponenter i anti-tuberkulosaktiviteter.

Multiplikation och timing av läkemedelskänslighet:

• före behandlingens början en gång för att bestämma strategin och taktiken för behandlingen:
• när de isoleras från sjuka kulturer från olika material (sputum, BAL-vätska, urin, exsudater, sprit etc.) undersöks alla isolerade stammar:
• i slutet av intensivfasen i avsaknad av klinisk och radiologisk dynamik:
• om det är nödvändigt att ändra behandlingsregimen i följande fall:
  • frånvaro av sputum smear;
  • återisolering av kulturen efter sputum smear-negativ;
  • en drastisk ökning av antalet CMU i swab efter den initiala nedgången. Det är välkänt att stammar av mykobakterium tuberkulos, vilka är heterogena när det gäller läkemedelskänslighet, isoleras från materialet från en patient med tuberkulos. Stressens känslighet för anti-tuberkulosemediciner kan skilja sig åt i spektrumet av läkemedel, grad, frekvens och frekvens av förekomst av resistens.

Graden av läkemedelsresistens hos Mycobacterium tuberculosis bestämdes i enlighet med etablerade kriterier, som är fokuserade på den kliniska betydelsen och stabilitet beror på aktiviteten av anti-TB läkemedel, dess farmakokinetik, koncentrationen i lesionen. Den maximala terapeutiska dosen och så vidare.

Bestämningen av mykobakteriens läkemedelskänslighet utförs för närvarande genom mikrobiologiska metoder:

• Absoluta koncentrationer (utspädningsmetod på täta eller flytande näringsmedier),
• proportioner,
• motståndskoefficient.

Vanligtvis manifesteras motståndet i form av visuellt observerad tillväxt av kolonierna av mycobacterium tuberculosis, men det finns metoder som inducerar tillväxt i de tidiga stadierna av celldelning av mykobakterier i form av färgreaktioner. Dessa metoder förkortar testtiden från 3-4 till 2 veckor.

Som enat i Ryssland har förlängts, rekommenderas av kemoterapi metoden WHO kommitté absoluta koncentrationer, som är från en metodsynpunkt är det enklaste, men det kräver hög precision och standardisering av laboratoriemetoder. Testet för läkemedelskänslighet består av en uppsättning provrör med ett näringsmedium modifierat med anti-TB-läkemedel. Setet består av 2-3 rör med olika koncentrationer av var och en av de läkemedel som används, ett kontrollrör utan läkemedel i miljön och ett rör innehållande 1000 mcg / ml natrium Sali tsilovokislogo eller 500 ug / ml paranitrobenzoynoy syra nontubercular att detektera tillväxt av mykobakterier.

För att förbereda en uppsättning media med preparat användes ett modifierat Levenstein-Jensen-medium (utan stärkelse) som hälls i kolvar. I vart och ett av kolvarna tillsätts en specifik volym av lämplig utspädning av det antituberkulösa preparatet. Innehållet i kolvarna blandas noggrant, hälls i rör och viks i ett lutande läge i 40 minuter vid en temperatur av 85 ° C. Det rekommenderas att spola mediet i en elektrisk rewinder med automatisk temperaturreglering. Onsdag med anti-TB-droger

1-st-serien kan förvaras i kylskåp vid 2-4 ° C i 1 månad, med beredningar av andra raden - högst 2 veckor. Förvaring av media med preparat vid rumstemperatur är oacceptabelt. Vid beredning av lösningar av anti-tuberkulosläkemedel beaktas deras aktivitet, beräkning av koncentrationen justerad för molekylvikten för den icke-specifika delen av preparatet, renhet etc. För att bestämma narkotikakänsligheten används endast kemiskt rena substanser.

Principen med metoden är att bestämma koncentrationen av ett antituberkulöst läkemedel som hämmar tillväxten av en signifikant del av den mykobakteriella populationen. Om det görs korrekt har denna metod god tillförlitlighet.

Före provet är det nödvändigt att se till att den isolerade kulturen av mycobacterium tuberculosis inte har någon extern mikroflora. Från mykobakteriernas kultur i 0,9% natriumkloridlösning framställs en homogen suspension innehållande 500 miljoner mikrobiella kroppar per ml (optisk turbiditetsstandard om 5 enheter). Den erhållna uppslamningen späds med 0,9% natriumkloridlösning (1:10) och 0,2 ml uppslamning tillsätts till varje rör av uppsättningen odlingsmedium. De utsöndrade rören placeras i en termostat vid 37 ° C och hålles i ett horisontellt läge i 2-3 dagar, så att odlingsmediets sluttande yta är jämnt inokulerad med suspensionen av mycobacterium tuberculosis. Rören överförs sedan till vertikalt läge och inkuberas i 3-4 veckor. Resultaten registreras efter 3-4 veckor.

Eftersom tidpunkten för excretionsutskiljning från det kliniska materialet på näringsmedia är åtminstone 1-1,5 månader kan resultaten av bestämning av läkemedelskänsligheten med denna metod erhållas inte tidigare än 2-2,5 månader efter sådd av materialet. Detta är en av de största nackdelarna med metoden.

Tolka resultaten för att bestämma mykobakteriens läkemedelskänslighet på grundval av vissa kriterier. På fast odlingsmedium anses känslig för koncentrationen av läkemedlet som finns i mediet, om antalet kolonier av mykobakterier som odlas in vitro med detta läkemedel är inte mer än 20 med riklig tillväxt i kontrollröret utan droger. Endast i närvaro av mer än 20 kolonier anses kulturen vara resistent mot denna koncentration. I praktiken, när man erhåller tillväxtresultat i provrör nära 20 cfu. Det är nödvändigt att anmäla den kliniska enheten att känslighet eller motstånd i detta fall är gräns, eftersom det ibland kan förklara den fuzzy dynamiken hos kliniska indikatorer.

För olika läkemedel etableras en viss koncentration, vid vilken reproduktionen av den kritiska andelen av den mykobakteriella populationen observeras. Dessa koncentrationer kallas "kritisk". Som ett kriterium för stabilitet används tillväxten av populationen av mykobakterier på ett näringsmedium med en beredning vid en kritisk koncentration.

Vid inhemsk TB-övning är det vid bestämning av läkemedelsresistensen inte begränsat till att endast bestämma kritiska koncentrationer. Detta beror på det faktum. Att den utökade definition nivån av läkemedelsresistens tillåter klinikern att mer exakt placera taktik kemoterapi med hjälp av kunskap om att förstärka effekten av läkemedelskombinationer, kors och tvärs väntas motstånd eller att tillämpa en effektivare läkemedel grupp använde anti-TB droger.

Den absoluta koncentrationsmetoden är den enklaste, men det är också den mest känsliga för de fel som görs när den utförs. Mer tillförlitlig, särskilt vid bestämning av känsligheten för andralinjedroger, och vanligt utanför Ryssland är metoden för proportioner. Det tar hänsyn till bristerna i metoden för absoluta koncentrationer, men i utförande är det mer krävande.

Metoden är mycket lik den absoluta koncentrationsmetoden. Förberedelse av provrör med läkemedel utförs på samma sätt. Som i den absoluta koncentrationsmetoden. Frösdosen av suspensionen av mykobakteriet tuberkulos reduceras emellertid med en faktor 10. Vilket eliminerar frekvensen av spontan resistans hos vissa stammar av mycobacterium tuberculosis till sådana läkemedel som Etambutol, protionamid, kapreomycin. Som kontroll används 2 eller 3 rör med en frödos som är lika i provrören, successivt utspädda 10 och 100 gånger. Kriteriet för stabilitet är andelen visuellt observerad tillväxt av mycobacterium tuberculosis. För droger i den 1: a serien är stabilitetskriteriet det övervägande av tillväxten av 1% av den ursprungliga populationen, för drogerna i andra raden - en ökning med 1 eller mer än 10% av den ursprungliga, beroende på den valda kritiska koncentrationen.

Under 1997 har en arbetsgrupp av WHO och Internationella unionen för identifiering av god tuberkulos TB läkemedelsresistens gjort justeringar till dessa kriterier, som erbjuder anses resistenta mykobakterier, som växer på fast ägg media Lowenstein-Jensen vid följande koncentrationer:

• dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• isoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Etambutol - 2 μg / ml.

År 2001 föreslogs kritiska koncentrationer för följande andra läkemedel (för en kritisk andel av 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamycin - 30 μg / ml;
• viomycin - 30 mcg / ml;
• cykloserin 40 | ig / ml;
• aminosalicylsyra - 0,5 | ig / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Tillväxtresultatet utvärderas efter 4 veckor i förväg och efter 6 veckors odling - som den sista.

För bestämning av läkemedelskänsligheten för pyrazinamid, som används allmänt vid modern kemoterapi för tuberkulos, är den rekommenderade kritiska koncentrationen 200 μg / ml. Det finns emellertid fortfarande ingen allmänt accepterad metod för bestämning av läkemedelsresistens mot detta läkemedel på fasta näringsmedier, eftersom dess antibakteriella aktivitet uppenbaras endast i surt medium (pH <6), vilket är tekniskt svårt att upprätthålla. Dessutom växer många kliniska kulturer av mykobakteriella tuberkulos motvilligt på äggmiljöer med en sur miljö.

För att utvärdera kvaliteten av resultaten av drogkänslighetstestning av Mycobacterium, rekommenderas att varje ny sats av mediet LJ styra parallell bestämning av känsligheten hos standard museum stam H37Rv. Dessutom finns det vissa mikrobiologiska kriterier som måste bibehållas så att teknikerna ger ett väl reproducerbart och korrekt tolkt resultat. Dessa inkluderar viabiliteten av kulturen av Mycobacterium tuberculosis, reglerna för att erhålla en homogen suspension och suspensionsodlingar av urvalsregler av Mycobacterium tuberculosis, representativitet den valda bakteriemassan. Tillförlitligheten hos bestämningen av läkemedelsresistens minskar med en extremt knappa bakteriell frisättning.

Nyligen har en metod för att bestämma läkemedelskänslighet med hjälp av automatiserade system ansetts lovande. Den mest perfekta i detta område är utvecklingen baserad på VASTES MGIT-960. I detta fall bestäms läkemedelskänsligheten för mykobakteriella tuberkulos på basis av en modifierad metod för proportioner. Vid bestämningsprocessen jämförs tillväxten av mykobakterium tuberkulos i ett kontrollrör och i provrör med läkemedel. Att bestämma känsligheten mot streptomycin, isoniazid, rev-pitsinu och etambutol används berikande tillsatser och antibiotika ingick i satsen SIRE kit. För att bestämma känsligheten för pyrazinamid, använd PZA-kit. Under loppet av suspensionstestet Mycobacterium tuberculosis inokulerades provrör med läkemedel, såväl som kontrollrören med beredd suspension 100 gånger för alla läkemedel utom pyrazinamid, varvid suspensionen är utspädning av 10 gånger. Kriteriet för stabilitet är tillväxtindikatorn för mykobakterier på 100 GU när tillväxt uppnås i kontrollröret 400 GU (se "Kulturmetoder för isolering av mykobakterier"). Redovisning och tolkning av resultaten utförs automatiskt och ställs in av det ingående eller valda programmet.

Som kritiska koncentrationer används slutliga koncentrationer i ett provrör med flytande näringsmedium. För närvarande har kritiska koncentrationer utvecklats för både 1-linjiga och andra linjedroger. Det bör noteras att känsligheten av mykobakteri-tuberkulos till cykloserin och aminosalicylsyra bestäms endast på äggnäringsmedia.

Elaborate arbete protokoll beskrivna systemet gör det möjligt att studera läkemedelskänslighet som dedicerad kultur (tät näringsmedium), och användning av den primära Mycobacterium MGIT-tillväxt in vitro. Det senare alternativet minskar avsevärt tiden för kultur, så att du kan få det fullständiga resultatet av kulturen av Mycobacterium tuberculosis (inklusive information om läkemedelskänslighet) efter 3 veckor från den dag då insamlingen av materialet, medan den traditionella metoden är det möjligt att erhålla endast den 3: e månaden. Med tiden kan de resultat som erhålls när patienten befinner sig i en intensiv behandlingsfas kompensera för den relativt höga kostnaden för forskning.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Differentiering av mykobakterier

Med tanke på att det använda näringsmediet inte är strikt selektivt. Den efterföljande differentieringen av de isolerade mykobakterierna är erkänd som obligatorisk. Behovet av differentiering av mykobakterier beror på ett antal funktioner av patologiska processer orsakade av släktet: annan kurs och utfallet av tuberkulos och mykobakterios, närvaron av naturliga läkemedelsresistens mot vissa anti TB-droger.

Det inses att primära identifieringen av komplex Mycobacterium tuberculosis M. Nontubercular från mykobakterier utförs genom följande egenskaper: tillväxttakten på fasta näringsmedier, pigmentering, kolonimorfologi, närvaron av syraresistens och temperatur optimal tillväxt.

Tyvärr finns det ingen enskild laboratoriemetod för att tillförlitligt skilja M. Tuberculosis komplex mykobakterier från andra syrafasta baciller, ändå kombinationen av särdrag som beskrivits ovan med de resultat som ges nedan av ett antal biokemiska tester möjliggör identifiering av Mycobacterium tuberculosis-komplexet med M. Sannolikt att 95%.

För differentiering av Mycobacterium-komplexet M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii och andra) från långsamt växande mykobakterier används nontubercular grundläggande biokemiska tester som detekterar närvaron av följande symtom:

• förmågan att producera nikotinsyra (niacintest):
• nitratreduktasaktivitet;
• termostabil katalas;
• tillväxt på medium med natriumsalicylat (1 mg / ml).

Som ytterligare test kan tillväxt på ett medium innehållande 500 μg / ml paranitrobensoesyra eller 5% natriumklorid också användas.

Många bakteriologiska laboratorier identifierar dessa mikroorganismer endast på komplexets nivå, vilket beror på laboratoriernas begränsade kapacitet och metodologiska egenskaper hos specialister.

I de flesta fall är dock i praktiken för att differentiera M. Tuberculosis och M. Bovis är tillräcklig följande tester: niacin, för närvaron av nitrat, närvaron registrering och pirazinamidazy tillväxt i medium innehållande 2 pg / ml hydrazid av tiofen-2-karboxylsyra. Det tas hänsyn till att mykobakterierna av M. Tuberculosis-komplexet kännetecknas av följande uppsättning tecken:

• långsam tillväxt (mer än 3 veckor);
• tillväxttemperatur i intervallet 35-37 ^° C;
• frånvaro av pigmentering (elfenben)
• markerad syrafast färg;
• ett positivt niacintest
• ett positivt nitratreduktasprov
• frånvaro av termostabil katalas (68 ^° C).
• Frånvaron av tillväxt på ett Levenstein-Jensen medium innehållande:
  • 1000 μg / ml natriumsalicylat,
  • 500 | ig / ml paranitrobensoesyra,
  • 5% natriumklorid:
• tillväxt i närvaro av 1-5 | ig / ml tiofen-2-karboxylsyra.

Relevansen av differentiering av isolerade mykobakterier kommer att öka markant med ökningen av frekvensen av registrering av HIV / AIDS-fall i samband med tuberkulos eller mykobakterier. För närvarande finns det ingen absolut säkerhet om beredskapen från praktiska regionala laboratorier att korrekt utföra denna arbetsvolym.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Immunologisk diagnos av tuberkulos

Det finns ett antal universella fenomen, droger och immunologiska tester som ursprungligen hittades exakt med tuberkulos eller på modellen av immunsvaret mot mykobakterier. Dessa inkluderar BCG Tuberculin, ett sådant fenomen som kutan DTH (tuberkulin - Pirquet och Mantoux reaktion), reaktionen till subkutana tuberkulin sensibiliserade djur (Koch fenomen). En av de första antikropparna i infektionssjukdom detekterades också i tuberkulos. Naturligtvis djupare förståelse för bra mekanismer immunitet tuberkulos och deras genetiska kontroll, kan större blir användning av immunologiska metoder och läkemedel som påverkar immunsystemet, för att lösa praktiska problem av TB.

Det viktigaste och svåra praktiska problemet betraktas för närvarande detektering av tuberkulos vid massscreening av befolkningen. Trots de många rapporterna om "framgångar" (på begränsat material) finns det ingen lämplig immunologisk metod (reproducerbar i "några armar") och ett läkemedel som är lämpligt för detta ändamål.

Immunologiska metoder, i synnerhet serologiska studier (bestämning av antigener, antikroppar) och tuberkulinprovokerande test används mycket i klinisk praxis.

Först och främst bland de immunologiska studier som används vid differentialdiagnos finns serologiska metoder - bestämning av antigener och antikroppar i olika miljöer i kroppen.

Specificiteten hos antikroppar mot tuberkulos av mykobakterier beror på antigenerna som används i immunoanalysen. En betydande mängd antigener föreslås, varav den första är tuberkulin PPD:

• PAP och andra komplexa preparat från odlingsvätskan;
• ultraljudsupplösning;
• Triton-extrakt och andra komplexa preparat av cellväggar;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• ledningsfaktor (trehalos-6,6-di-mykollat);
• fenol och andra glykolipider;
• lipopolysackarid;
• fibronektinbindande antigen;
• proteiner (oftast rekombinant); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA, etc.

Som ett resultat av många års forskning av ryska och utländska forskare har avslöjat de grundläggande lagar och effektiviteten av antikroppen serologiska diagnos av tuberkulos: ju mer komplexa antigen, desto högre känslighet och lägre specificitet av testet. Specificitet i olika länder varierar beroende på befolkningen infektions M. Tuberculosis och nontubercular mykobakterier från att bära BCG-vaccination och andra. Hos barn är lägre än hos vuxna innehåll serodiagnos information. I primär tuberkulos (oftare barn) är definitionen av IgM mer informativ. Med sekundär IgG. Hos HIV-infekterade patienter reduceras det informativa värdet av serodiagnos vid bestämning av antikroppar. Effektivitet bestämning av antikroppar beror på antalet "kliniska aspekter": processaktivitet (närvaron eller frånvaron av "isolering" mykobakterier närvaro avklingning av håligheter, graden av infiltrering), förekomsten av processen, varaktigheten av dess flöde.

Känsligheten hos metoden för enzymimmunanalys (ELISA) är ca 70%. Otillräcklig effektivitet i studien beror på dess låga specificitet. Tidigare övervägdes möjligheten att använda serologisk screening i högriskgrupper, särskilt bland personer med post-tuberkulosförändringar i lungorna.

För att öka specificiteten hos ELISA fortsätter sökningar efter mer specifika antigener, inklusive de som erhållits genom genteknik: ESAT-6, etc. (se ovan). Användningen av strängspecifika antigener (38 kDa, ESAT) ökar specificiteten. Men avsevärt minskar analysens känslighet. Tillsammans med IFA (experimentell laboratorie testsystem. T ex Pathozyme ELISA-kit) tillhandahåller även kit med lateral immunokromatografisk filtrering (Mycodot), såväl som andra liknande tester (dot-analys på membranet) med en visuell bedömning av testresultatet. Under dessa test utförs analysen under 10-30 minuter; De behöver inte särskild utrustning, de kräver en visuell utvärdering av resultaten, som är förknippad med en viss subjektivitet. Dessa metoder har ungefär samma känslighets- och specificitetsegenskaper (70% respektive 90-93%) som den traditionella ELISA.

Användningen av metoder för immunanalys har ett bestämt värde som ett tillägg, med hänsyn till det använda komplexet i den olika diagnosen tuberkulos, speciellt vid diagnosen av dess extrapulmonära former. Den mest effektiva ELISA-metoden är i diagnosen tuberkulos meningit i studien av cerebrospinalvätska. I detta fall är analysens känslighet 80-85% och specificiteten är 97-98%. Det finns data om effektiviteten hos detektion av antikroppar mot mykobakteri-tuberkulos i tårvätska vid diagnos av tuberkulös uveit.

Induktion av gamma interferonsyntes in vitro

Gamma-interferon (IFN-y) är en specifik immunförsvarsfaktor som realiseras genom aktivering av makrofag-enzymsystem. Induktion av IFN-y-syntes genom sensibiliserade T-lymfocyter orsakar deras interaktion med antigener av mykobakterier.

Som antigener som används som tuberkulin PPD. Och de specifika antigenerna, erhållna genom genteknik, i synnerhet antigener ESAT-6 (tidig utsöndrat antigen med en molekylvikt 6 kDa) och CFP-10 (odlingsfiltrat protein 10 kDa). Geneteknik eller rekombinant antigener saknas i cellerna i BCG-vaccinet och andra mykobakterier. Vid användning av tuberkulin är resultaten av induktionstest IFN-y jämförbara med resultaten från tuberkulinhudtestet (direkt korrelation). Vid användning av genetiskt modifierade antigener är testresultaten mer specifika och beror inte på tidigare vaccination av BCG. Vid testning av vaccinerade personer som inte hade kontakt med tuberkulosinfektion, är testets specificitet 99%. Testets känslighet bland patienter med tuberkulos varierar från 81 till 89%.

Tester och diagnostiska verktyg har utvecklats baserat på den kortsiktiga odling av celler eller helblod mononukleära celler som isolerats från blodet med antigener av Mycobacterium tuberculosis in vitro med efterföljande bestämning av IFN-γ-koncentrationen eller genom räkning av antalet av T-lymfocyter som syntetiserar IFN-γ. Koncentrationen av interferon syntetiseras in vitro bestämdes genom ELISA med användning av monoklonala antikroppar som binder av IFN-γ. Sedan, med användning av en kalibreringsstandard av IFN-γ bestäms av dess koncentration i provrör eller brunnar i plattan.

Vid utförandet av Elispot-testet, syntetiserar antalet T-limocyter IFN-y. Räknas på ytan av en platta belagd med antikroppar mot IFN-y.

Utvecklare Diagnosticum på IFN-γ in vitro genom induktion, som är godkänd av byrån för läkemedelsområdet och amerikanska produkter, hävdar att ett test är omöjligt att skilja mellan latent TB-infektion från aktiv tuberkulos. Därför är testet inte direkt diagnostiskt i regioner med hög infektionsnivå. Men i vårt land kan det användas för att skilja tuberkulosinfektion hos barn från allergier efter vaccination och att bedöma nivån av specifik immunitet i behandlingsprocessen.

För närvarande studeras det inhemska testsystemet för att bestämma induktionen av IFN-y-syntes genom specifika tuberkulosantigener in vitro.

Immunstatus och förlopp av tuberkulos, immunkorrigering

I behandling av tuberkulos hos människor finns förändringar i antigenemi och immunsystemets tillstånd.

Data om förändringar i utsöndringar och vävnader är i stor utsträckning motsägelsefulla. Det enda som kan noteras med goda skäl är att i tuberkulära granulomer detekteras som regel ett signifikant antal aktiverade T-lymfocyter.

Det är vettigt att dö för ytterligare två bestämmelser som är nödvändiga för att förstå rollen som immunologiska mekanismer vid behandling av tuberkulos hos människor:

• AIDS-patienter har en särskilt hög förekomst av flera läkemedelsresistens;
• med multipel läkemedelsresistens (och i frånvaro av HIV-infektion) är immunitetsstörningar (särskilt T-cell-länken) särskilt signifikanta.

När tuberkulos allmänt tillämpa olika metoder för immunmodulering: det är i första hand läkemedel som verkar primärt på T-cellsimmunitet och ett system av mononukleära fagocyter (tymiska hormoner, isoforon, likopid, polioksidony et al.). Såväl som hela (dämpade) mykobakterier och deras komponenter.

Molekylärbiologisk diagnos av tuberkulos

För molekylärbiologiska metoder i diagnos av smittsamma sjukdomar innefattar, i huvudsak, metoder baserade på att manipulera med det genomiska materialet av bakteriella och virala patogener för att identifiera specifikt genetiskt material - DNA-segment med en nukleotidsekvens som är specifik för en viss typ eller patogenstammar att analysera specifika DNA-sekvenser i gener som bestämmer patogenens känslighet för vissa medicinska substanser, och även för funktionell analys aktiviteten hos vissa gener av patogenen. Molekylärbiologiska tekniker var brett i vetenskaplig forskning och praktisk tillämpning vid diagnos och övervakning av olika bakteriella och virala infektioner efter att ha öppnat i 1985, Carrie Myullisom (vinnare av Nobelpriset. 1989) polymeraskedjereaktion.

Principer och möjligheter för polymeras kedjereaktionsmetoden

PCR tillåter att amplifiera (multiplicera) in vitro en nukleotidsekvens (DNA-fragment av patogenen) i flera timmar i miljoner gånger. Reaktionen i närvaro av enkla DNA-kedjor bestämmer analysens extremt höga känslighet.

Nukleotidsekvensen för vissa regioner i DNA-kedjan bestämmer den genetiska identiteten hos mikroorganismen, vilket förklarar PCRs specifika specificitet.

Värdet på denna teknik för detektering och undersökning av de egenskaper som orsakas av Mycobacterium tuberculosis biologiska egenskaperna hos en mikroorganism som har mycket långsam tillväxt: fördubblingstid av DNA Mycobacterium tuberculosis när odlingen är 12-24 timmar.

Principen för PCR-metoden består i förstärkning - flera, miljoner gånger. Multiplicera sektionerna av en specifik DNA-sekvens i en rörmikrovolym under en cyklisk återkommande av de följande tre reaktionsstegen, vilka var och en passerar i en annan temperaturregim:

• Steg I - denaturering av dubbelsträngat DNA vid upphettning med en divergens av dess kedjor;
• II-steg - komplementär bindning (hybridisering) av primrar (primingoligonukleotider) med terminala sektioner av strängspecifika kedjor, valda för multiplikation av DNA-fragmentet;
• Steg III - slutförande av kedjan av DNA-fragmentet med användning av ett termostabilt DNA-polymeras.

För att amplifiera in vitro måste det finnas molekyler av matris-DNA. Fyra typer av deoxinukleosidtrifosfater (nukleotider) innehållande lämpliga kvävehaltiga baser: adenin (A), tymin (T), guanin (G), cytosin (C); konstgjorda syntetiserade primingoligonukleotider (primrar) bestående av 18-20 baspar; termostabilt DNA-polymerasenzym som har ett temperaturoptimum av 68-72 ^på C, och magnesiumjoner.

Specificiteten av PCR beror på valet av DNA-fragmentet. I enlighet härmed syntetiseras flankfröoligonukleotider. Specificitet av hybridisering och slutförande av DNA-kedjan beror på komplementaritetsprincipen hos följande par kvävebaser: adenin-tymin, guanin-cytosin.

För att bestämma den genomiska tuberkelmykobakterier komplex mest effektiva målamplifiering i de flesta testsystem valda DNA-fragment av IS6110, som i de flesta stammar av genomet Mycobacterium tuberculosis har ett betydande antal (10-20) upprepningar, som ger, tillsammans med specificitet, hög känslighet hos analysen. Samtidigt beskrivs stammar av Mycobacterium tuberculosis med ett litet antal upprepningar eller frånvaron av IS6110-fragment.

Isolering av DNA-molekyler från ett biologiskt prov

För att utföra PCR, bör patogenens DNA-molekyler isoleras från det biologiska materialet i en minimal volym med en minimal mängd icke-specifikt DNA och olika hämmare av enzymet-DNA-polymeraset.

Framställningen av prover bör utföras under betingelser som förhindrar korskontaminering av proven genom de isolerade DNA-molekylerna. För att göra detta krävs förbehandling av rummet med ultraviolett, golv och arbetsyta på skrivbord och apparater med klorhaltiga lösningar. Också obligatorisk användning av rena handskar, engångsrör och tips till automatiska pipetter.

För att isolera DNA från Mycobacterium tuberculosis från kliniska prover (cerebrospinalvätska, bronkial tvätt) som inte innehåller ett stort antal celler, cellrester, eller salter därav, är tillräcklig för att centrifugera provet vid 3-4 tusen. Rpm, lägga till slammet 20-30 ul av 2% lösning triton X-100 och värmdes vid 90 ^om C under 30 min.

För beredning av sputumprover måste vara effektiv kondensering, som i allmänhet används för en 4% lösning av natriumhydroxid och N-acetyl-L-cystein (NALC) i en mängd av 50-80 mg per prov - beroende på provets viskositet. NALC-lösningen måste framställas ex tempore eller NALC-pulver kan tillsättas torrt till provet direkt. Efter kondensation bör prov centrifugeras i 15 minuter vid 3,5-4000 rpm (3000 g) i 50 ml ampuller med skruvkåpor, i. E. Under samma förhållanden som rekommenderas för förberedande beredning av slem.

För extraktion av DNA från pelleten metoden används mest ofta baserade på användning av en 5-6 molar lösning av guanidinisotiocyanat lysisreagens som de mikroporösa partiklarna och kiseloxid ( "kiselgur") sorberande DNA-molekyl. Icke-specifika ämnen, däribland inhibitorer möjliga, tvättades sedan i en 2,5 molar lösning av guanidinisotiocyanat och etanollösning, varefter DNA-molekylen desorberas i vatten, och dessa prover användes för att utföra PCR. För att förenkla DNA-extraktionstekniken ersätts "diatomacejord" ofta med magnetiska mikropartiklar belagda med kiseloxid. I detta fall används ett speciellt magnetiskt ställ för mikrotubes istället för centrifugering för att fälla ut partiklarna.

I Ryssland utvecklades en ursprunglig metod för immunomagnetisk separation av mykobakterier, följt av extraktion av patogenens DNA. För Mycobacterium tuberculosis immunomagnetisk separation med användning ferroparticles storlek av 3-5 mikron, belagt med kiseldioxid, till vilka är bundna genom kemisk bindning polyklonala (kanin) antikroppar mot Mycobacterium tuberculosis. Prov av sputum efter alkalisk lys neutraliseras med en sur tris-HCl-lösning och inkuberas med en immunomagnetisk sorbent. Därefter uppsamlas immunoferropartiklarna med en magnetstång med en utbytbar spets, överförs till en mikrotub och utfälles. Tillsätt 20-30 μl av en 2% Triton X-100-lösning och värm i 30 minuter vid 90 ^° C. Supernatanten användes som en DNA-mall för PCR-analys.

Ett svårt problem är isoleringen av mycobacterium tuberculosis DNA från biopsiprover. För enzymbiopsi används enzymproteinet K vid en slutlig koncentration av 200-500 mg / 1 vid en temperatur av 56 ^° C över natten. Vidare används en av de kända metoderna. Överskott av icke-specifikt DNA i PCR-analysen av biopsier orsakar ofta inhiberingen av reaktionen, vilket kräver upprepad extraktion av DNA.

Metoder för att upptäcka resultat

Efter avslutad reaktion identifieras patogenens amplifierade DNA-fragment genom olika metoder.

Gelelektroforesmetoden är välkänd. Det resulterande DNA-fragmentet identifieras genom en positiv kontroll innehållande det önskade specifika DNA-fragmentet eller enligt en känd storlek (antalet nukleotidpar) i fragmentet, vilket bestäms med användning av en standardmolekylär markör.

I närvaro av ett specifikt färgämne ingår etidiumbromid i dubbelsträngat DNA. Det syntetiserade DNA-fragmentet detekteras som ett band som lyser under ultraviolettverkan.

Storleken på DNA-fragmentet, bestämt genom elektrofores från avståndet från början, måste motsvara en känd molekylviktmarkör eller positiv kontroll.

Andra metoder för bestämning av PCR-resultat baserat på hybridiseringen av en enkelkedjig PCR-produkter med en oligonukleotid komplementär till denna - DNA-prob märkt med biotin, följt av detektering via enzymatiska reaktioner, t ex genom bindning till streptavidin-biotin alkaliskt fosfatas.

Baserat på denna typ av detektion har PCR-analysatorer skapats där detekteringen av PCR-resultat utförs automatiskt som ett resultat av att man läser den optiska densiteten i proverna efter manifestationen av den enzymatiska reaktionen.

Nackdelarna med dessa metoder är möjligheterna för infralaboratorisk kontaminering genom ganska korta fragment av DNA-molekyler. När molekyler matar in nya prover blir de en matris för PCR och leder till falska positiva resultat.

I detta avseende införs strikta regler för separation och isolering av lokaler för att förhindra falskt positiva resultat: att extrahera DNA från biologiska prover; lokaler för detektering av resultat (elektrofores) från renzonen. Dessa lokaler är en zon av sannolik förorening. Ett annat isolerat område är ett rent rum för införande av DNA-proverna som skall testas i rör med en reaktionsblandning för PCR. Slutligen antas det att huvudanordningen - DNA-förstärkaren - ska placeras i ett separat, eventuellt kontor, rum.

För att förhindra kontaminering av produkterna från de föregående reaktionerna - vissa Likon-amp-PCR systemtest istället dezoksinukleozidtimidina innehålla dezoksinukleoziduridin vilka, när in vitro-syntes krets inkorporerad i stället i rätt läge, dvs. Den kvävebaserade basen av tymin närvarande i nativt DNA ersätts med uracil. Uracil-DNA-glykosylas, som sättes till reaktionsblandningen till det material som analyseras, förstör endast föroreningsfragmenten med deoxyuridin, men inte nativt DNA som ska analyseras. Som innehåller deoxitymidin. Efterföljande upphettning vid 94 ^° C inaktiverar detta enzym och stör inte amplifiering i PCR.

Det finns ett testsystem baserat på isotermisk amplifiering av rRNA, för vilket omvänd transkription och syntes av DNA-molekyler utförs först. Vilken i sin tur är en matris för den efterföljande syntesen av RNA-molekyler. RNA-amplikoner detekteras med användning av en akridinfärgad DNA-prob när hybridiserad i en reaktionsrörlösning. Denna metod, förutom hög känslighet, har fördelen av att analysera i ett rör, vilket förhindrar kontaminering. Enligt författarna når känsligheten av denna metod i respiratoriska prover 90% med en specificitet på 99-100%.

Nya detekteringsmetoder implementeras i realtid PCR. Dessa metoder skiljer sig huvudsakligen från att PCR och detektering av dess resultat utförs samtidigt i ett slutet rör. Detta förenklar inte bara tekniken för analys, men förhindrar också kontaminering av laboratorierum och testprover med produkter från tidigare PCR.

I realtidsresultat PCR detekterings beror på fluorescens som uppträder under en fluorogen hybridiseringsprob DNA med amplifitsi Rui-PCR under ett specifikt DNA-fragment. Struktur fluorogena DNA-prober konstrueras så att den fluorescerande markören frigöres som ett resultat av enzymatisk reaktion eller på avstånd från släckningsmolekylen fluorescens endast under specifik hybridisering med den önskade DNA-molekylen som skall amplifieras under PCR. Som antalet probmolekyler hybridiserade med ökningen i fluorescens är proportionell mot den detekterade nivån av antalet molekyler av den amplifierade produkten. Eftersom vid varje cykel antal PCR-fragment DNA-molekyl multipliceras med halv, cykelnumret vid vilket fluorescensen bestämmes och ökar omvänt proportionellt mot antalet av DNA-molekyler i det ursprungliga provet. Om reaktionen är att introducera som kalibratorn flera olika kända koncentrationer av molekyler motsvarande DNA-fragment av Mycobacterium tuberculosis, användning av datorprogrammet kan beräknas och mängden av genomiskt DNA i testmaterialet.

Varje standardprov dupliceras. Det kvantitativa kriteriet är det minsta antalet PCR-cykler som är nödvändiga för uppkomsten och tillväxten av den bestämda fluorescensen. På abscissen - antalet cykler; ordinaten är fluorescensvärdet. DNA-koncentrationerna är omvänt proportionella mot antalet cykler som erfordras för utseendet av fluorescens. I den högra kolumnen (21-32) markeras cykelnumren för motsvarande koncentrationer. Skillnader mellan 10-faldiga koncentrationer av DNA-fragment 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 cykler. För två patienter var koncentrationerna av IS6110-fragment omkring 10 ³ / ml och 10 ⁴ / ml. Med hänsyn till antalet repetitioner (6-20) av fragmenten som analyseras i genomet av Mycobacterium tuberculosis är antalet mykobakterier i kliniska prover ca 100 respektive 1000 celler.

Användningen av PCR vid diagnosen tuberkulos

PCR-metoden används mest för accelererad diagnos av tuberkulos - detektion av mycobacterium tuberkulos i kliniska prov: sputum. Bronkial spolning, pleural exsudat, urin, cerebrospinalvätska, osteolysepunktet, kvinnliga könsorganala aspirat och olika biopsiprover. I studien i Nederländerna studerades ca 500 sputum och bronkial lavage prover från 340 patienter med bekräftad diagnos på lungtuberkulos att jämföra känsligheten hos PCR-förfaranden, mikroskopi och kulturstudier utstryk. Analysens känslighet var 92,6,88,9 respektive 52,4%. Specificiteten hos alla metoder var ca 99%.

Effektiviteten av detektion av mycobacterium tuberculosis genom smearmikroskopi, sådd på Levenstein-Jensen-mediumet, VASTES-testsystem och PCR-analys jämfördes. PCR visade en känslighet av 74,4%, mikroskopi - 33,8%, sådd på ett tätt medium - 48,9% och VASTES - 55,8%. Den genomsnittliga detekteringstiden för sådd på ett Levenstein-Jensen-medium är 24 dagar. VASTES - 13 dagar, PCR - 1 dag.

Möjligheterna att använda PCR som en känslig och snabb metod för att övervaka effekten av tuberkulosbehandling diskuteras också.

Detektion av DNA från Mycobacterium tuberculosis genom PCR med effektiv kemoterapi bestämdes under en längre tid - i genomsnitt 1,7 månader jämfört med utstryk definieras under fluorescensmikroskopi och med 2,5 månader jämfört med bakteriologisk undersökning.

Diagnos av extrapulmonära former av tuberkulos

Värde som en känslig PCR-metoden är särskilt stor för extrapulmonell former, när den bildas under dessa kliniska och radiografiska metoder konventionella bakteriologiska metoder för bestämning av Mycobacterium tuberculosis i diagnostiska material ineffektiva.

I undersökningen av urinprover var PCR-resultat positiva i 16 av 17 patienter med aktiv tuberkulos och negativa urin 4 patienter inaktiva njur tuberkulos och 39 patienter med urinsystemet sjukdom nontubercular.

Effektiviteten av PCR-analys i studien av benmärgsaspirat hos patienter med feber av okänt ursprung visades vid misstänkt tuberkulos. För att diagnostisera tuberkulös lymfadenit, aspirerade 102 punktering och en biopsiprov av 67 barn med misstänkt tuberkulös lymfadenit studerades hos barn. Positiva resultat erhölls: 71,6% realtid PCR. Fluorescensmikroskopi - 46,3%. Kulturforskning - 41,8%. I studien av 50 lymfkörtelbiopsier hos patienter med "kattskrap" -sjukdom var alla resultat negativa. Således demonstrerades 100% specificitet av PCR-analys. I samma arbete, med punkteringsbiopsi av lymfkörtlar, påvisades möjligheten att detektera M. Avium.

Diagnos av tuberkulos av det kvinnliga könsorganets infertilitet är, som det är känt, ett av de svåraste problemen med diagnosen. Vid undersökning genom PCR biopsier av endometriet, granskade endometriala aspirat vätskeprover från Douglas utrymme 14 (56%) av 25 patienter laparoskopiskt misstänkt tuberkulos, positiva resultat erhölls. Med användning av smältmikroskopi och odling erhölls 1 och 2 resultat. Dessa fall var också PCR-positiva. De flesta PCR-positiva resultaten var relaterade till fall med karakteristiska tecken på tuberkulos enligt den histologiska studien. Ett mindre antal - med misstanke om tuberkulos enligt laparoskopi data. Endast ett positivt resultat av PCR-analys erhölls i frånvaro av laparoskopiska data för tuberkulos.

Vid diagnos av extrapulmonala former av tuberkulos har kliniker ofta en fråga om möjligheten att upptäcka en patogen när de testar blodprover med PCR-metoden. Litterära data indikerar att detektion av DNA från mycobacterium tuberculosis från blodprover är möjlig med långtgående former av HIV-infektion. DNA av mycobacterium tuberculosis detekterades endast med generaliserad tuberkulos av olika organ hos patienter med transplanterad njure och immunosuppression.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Artidentifiering av mykobakterier

PCR-metoden kan vara ganska effektiva för snabb identifiering av mykobakterier med komplex tuberculosis och vissa arter av mykobakterier nontubercular mottar efter deras initiala tillväxt. I detta fall kan användningen av PCR spara 7-10 dagar, vilket är nödvändigt för den efterföljande kulturidentifiering av ett positivt resultat. Forskning PCR är tekniskt mycket enkel, eftersom den inte kräver komplicerade provberedning kliniskt material för att uppnå hög känslighet. I studien 80 positiva i detta testsystem (MB Vasto. Organon företag) alla positiva kulturer av PCR var strikt specifik och hölls i en dag. Att identifiera andra arter av mykobakterier vid framställning av DNA av patogenen kulturen hybridiserades med specifika DNA-sonder märkta med akridin och stammar som detekteras genom uppträdandet av kemiluminescens via kemiluminometer eller nitrocellulosaremsor med en visuell bedömning efter hybridisering. Med hjälp av ett sådant kit identifierat ett begränsat antal arter: Mycobacterium tuberculosis komplex. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii och M. Gordonae.

A.Telenti et al. Också utvecklat en relativt enkel och billig metod för artidentifiering av kliniskt viktiga arter av mykobakterier genom PCR och efterföljande behandling med två restriktionsenzymer (enzymer med egenskaper skära en DNA-molekyl vid specifika punkter). DNA-fragmentet amplifieras. Som kodar för ett värmekokprotein (65 kDa) och därefter behandlas PCR-fragmentet av 439 nukleotidpar som produceras av PCR separat med två enzymer, Bste II och Nae III. Analyseras sedan med användning av agarosgelelektrofores erhållna två produkter, bestämning av deras storlek (antal baspar) med användning av en standarduppsättning av DNA-fragment (molekylära DNA-markörer) i längd från 100 till 1000 baspar. I var och en av de specifika typer (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M fortuitum) detektera två eller tre DNA-fragment av olika storlek för varje restriktionsenzym. Kombinationen av olika erhållna DNA-storlekar möjliggör differentiering av dessa arter i sig.

Tekniken för biologiska DNA-mikroarrays utvecklas. Som hjälper till att identifiera mer än 100 arter av mykobakterier i en studie.

Identifierings arter kan också utföras genom PCR-amplifiering av 16S rRNA variabel region, följt av sekvensering av amplikoner vid jämförelse med motsvarande primära struktur som möjliggör identifiering av mer än 40 arter av mykobakterier.

Med hjälp av PCR kan en artidentifikation inom tuberkuloskomplexet mycobacterium också utföras, inklusive differentiering av M. Bovis och M. Bovis BCG. För att göra detta analyseras närvaron eller frånvaron av några gener i de genomiska regionerna av RD1. RD9 och RD10. RD1 är frånvarande i M. Bovis BCG, men är närvarande i virulenta arter, inklusive M. Bovis.

Bestämning av läkemedelskänslighet hos Mycobacterium tuberculosis genom PCR

Uppgifterna för molekylärgenetiska metoder för att bestämma läkemedelsresistens eller resistens hos mycobacterium tuberculosis reduceras till detektion av mutationer i vissa nukleotidsekvenser av kända gener. Huvudmetoderna baseras antingen på direktavläsning (sekvensering) av dessa sekvenser efter amplifiering eller vid hybridisering av biotinmärkta DNA-fragment amplifierade under PCR med DNA-prober. Båda alternativen involverar identifiering av nukleotidsubstitutioner i sekvenserna som använder DNA-sonder leder till frånvaro eller ofullständig hybridisering till ett nitrocellulosamembran med användning av enzymkonjugat (streptavidin-alkaliskt fosfatas) - Metod LiPA-Rif-TB.

Förfarande för mätning av fluorescens i ett lokalt fixerad på microsections DNA-sonder komplementära till kända mutationer i PCR-amplifierad gen regioner som är ansvariga för resistens eller läkemedelskänslighet, som kallas mikrobiochipov metod. Huvudalgoritmen för genomförandet av denna forskning är som följer. Efter isolering av DNA från ett kliniskt prov eller odling av mykobakterier är nödvändigt att genomföra PCR-amplifiering av relevanta fragment av rpoB-genen som ansvarar för läkemedelskänslighet mot rifampicin eller katG och Inha gener som kodar för proteiner av Mycobacterium är ansvariga för känslighet för Isoniazid. PCR-resultaten utvärderades genom agarosgelelektrofores, i vilket bekräftar mottagandet av lämpliga DNA-fragment av den önskade längden. Genomföres sedan den 2: a omgången av PCR för att introducera den fluorescerande märkningen i DNA. Resultaten av PCR bekräftas igen genom gelelektrofores. Därefter utfördes hybridisering (inkubation över natten), följt av tvättning av det resulterande materialet på biochip, som är ett stort antal fasta i en liten glasplatta korta DNA-strängar (prober) som är komplementära till nukleotidsekvenser av den läkemedelskänsliga typ Mycobacterium tuberculosis vid punkterna för möjliga mutationer. Såväl som de mutanta sekvenser som är ansvariga för läkemedelsresistens. Lokalisering av DNA-prober på plattan - strikt definierade, och nivån av fluorescens observeras vid hybridisering för att bestämma resultatet med användning av en speciell avläsningsanordning är installerad. I detta avseende bestäms resultaten av analysen med hjälp av ett speciellt datorprogram.

Under de senaste åren har alternativa metoder för bestämning av mykobakterie tuberkulosens läkemedelskänslighet utvecklats på grundval av realtids-PCR-teknik, vilket gör det möjligt att genomföra dessa studier i ett slutet rörprov.

I fig. 13-13 presenterar resultatet av analysen av kliniska kulturer av mycobacterium tuberculosis vid bestämning av läkemedelsresistens mot rifampicin genom realtid PCR: 218 - ett kontrollprov (känsligt för rifampicin); 93 - positiv kontroll för mutationen av Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - positiv kontroll för mutation av Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - experimentella prover. Resultat av beräkning av kinetiska kurvor för amplifiering på 4 kanaler: kanal 1: 393 - positiv kontroll för mutation av Ser-Trp TCG-TGG; kanal 2: 4482 - positiv kontroll för mutation av Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - experimentella prover; kanal 4: kinetiska kurvor för amplifiering av alla prover som deltar i experimentet. Positiv kontroll av amplifieringsreaktionen. Slutsatser: Baserat på analysens resultat identifierades följande mutationer som bestämde resistansen mot rifampicin: i prover 162.163.172.295-Ser-Leu TCG-TTG. Samma princip användes för att bestämma läkemedelsresistensen mot isoniazid för generna katG och inhA, som bestämmer de vanligaste mutationerna.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Stamidentifikation av mycobacterium tuberculosis

Den mest grundligt studerade metod för identifiering av stammar av Mycobacterium tuberculosis är en teknik som kallas restriktionsfragmentlängd-polymorfism (RFLP RFLP,. Eller i den engelska versionen), och som är baserad på fragmentirovanin (restriktion) av DNA från Mycobacterium tuberculosis enzymet PvuII och fragmenten erhållna efterföljande hybridisering med vissa specifika sekvenser på DNA dess upprepade element IS6110. Inomartsvariation förverkligas genom olika antal upprepningar IS6110 och deras placering på DNA. Såväl som en mängd olika avstånd mellan vissa angreppspunkter restriktionsenzym (restriktionsställen) och elementet IS6110. Denna teknik är mycket komplicerad och tidskrävande. Efter behandling med DNA som extraherats från en kultur av Mycobacterium tuberculosis, är gelelektrofores utförs med ett restriktionsenzym, och överfördes sedan DNA-fragment av olika längder på ett nitrocellulosamembran, utfördes hybridisering med fragment av IS6110-elementet och detekteras med hjälp av enzymatiska reaktioner. Det resulterande mönstret specifika DNA-band karakteriserar speciell stam av Mycobacterium tuberculosis. Använda dator analys identiska eller besläktade stammar. Trots det faktum att RFLP-metoden är den mest diskriminerande, dvs. Identifierar det största antalet skillnader i stammar som analyserats, är det ineffektivt för ett litet antal (mindre än 5) IS6110-upprepningar som observerats i vissa stammar. I fig. 13-14 visar resultaten av RFLP-typning av stammar.

Ett alternativ kan vara metoden för spoligotypning - analys av polymorfismen av spacer-DNA-sekvenser - mellanprodukt mellan direkta upprepningar av DR-regionen. Vid utförande av spoligotypning av stammarna utförs PCR med primers som begränsar DR-regionen, varefter fragment med olika längd bildas som hybridiserar med de variabla mellanliggande regionerna av DNA. Analys av distanssekvenserna i DR-regionen presenteras. Enligt forskare, enklare, produktiv och lämplig för primär screening av stammar och preliminär epidemiologisk analys, samt forskning direkt kliniskt material.

Det är uppenbarligen att den mer effektiva och tekniskt tillgängliga metoden är VNTR (förkortning av engelska ord) eller metoden för bestämning av det variabla antalet exakta tandemrepetationer i DNA av mycobacterium tuberculosis. Denna metod är endast baserad på användningen av PCR och kräver ingen ytterligare manipulation. Eftersom antalet tandemupprepningar i olika stammar och i olika ställen är olika bestäms fragmenten av olika storlekar och analyseras på det resulterande elektroforeget av PCR-produkter. Enligt forskarna uppnår VNTR en större grad av diskriminering av stammar än med RFLP-metoden.

Många uppmärksamhet har betalats de senaste åren till fördelningen av stammar av Mycobacterium tuberculosis hos W-Beijing-familjen (ibland kallad Peking-stammen), som i stor utsträckning är narkotikabeständiga.

Grundläggande krav på kvaliteten på molekylärbiologisk forskning

[72], [73], [74], [75],

Grundläggande regleringsdokument för PCR

Beställningar Russian Hälsoministeriet: №45 från 2000/02/07 g .. Nummer 109 från 2003/03/21 g .. Nummer 64 från 2000/02/21, riktlinjerna: 1.3.1888-04 "organisationen av arbetet i studier med PCR material infekterad med patogena biologiska medel i grupp III-IV för patogenitet "; 1.3.1794-03 "Arrangemang av arbete vid studier av PCR-material, infekterat med mikroorganismer av I-II-patogenitetsgrupperna". 2003.; 3.5.5.1034-01 "dekontaminering av material, infekterade bakterier I-IV patogenicitet grupper vid användning av PCR," 2001 Bilagan 11 till de enhetliga instruktioner för mikrobiologiska undersökningsmetoder i identifiering, diagnostik och behandling av tuberkulos.

[76], [77], [78]

Personalen

Utförande av molekylärbiologisk forskning kan hålla läkare i klinisk laboratoriediagnostik, läkare bakteriologer, virologer, läkare, biologer, klinisk diagnostik laboratorium samt specialister med sekundär medicinsk utbildning, passerade specialisering och avancerad utbildning på föreskrivet sätt.

Arrangemang av laboratorielokaler

Följande laboratorierum krävs:

• Provhanteringsområdet är ett laboratorium anpassat för att fungera med infektiösa agens av III-IV-patogenitetsgrupper enligt metodiska instruktionerna 13.1888-04.
• Zon för beredning av reaktionsblandningar PCR - laboratoriumrum, som skyddar mot intern laboratorieförorening - "ren" zon.
• • Om elektrofores eller hybridisering används för att analysera PCR-produkter. Laboratorie rum där de multiplicerade DNA-fragmenten extraheras från rören och amplifiering, respektive, kan komma ut i miljön, i enlighet med kraven för PCR-laboratorier (1.3.1794-03 Riktlinjer, Ledning 1.3.1888-04) måste vara helt isoleras från de lokaler som anges i föregående stycken. Det bör uteslutas från rörelsen zonen till zon elektrofores för provhantering och en "ren" område av någon personal, utrustning, några material och föremål, samt överföringen av luft genom ventilationssystemet, eller som ett resultat av utkast. Denna zon är inte nödvändig för fluorimetrisk detektering av PCR-produkter.
• Rummet för dokumentation och behandling av resultat är utrustad med datorer och nödvändig kontorsutrustning. Detta rum kan innehålla utrustning som gör det möjligt att upptäcka PCR-produkter utan att öppna röret. - fluorescerande PCR-detektorer och termiska cykler för realtids-PCR.

Sanitära och epidemiologiska krav för primärbehandling av sputum liknar de vanliga mikrobiologiska kraven för att arbeta med mykobakterier tuberkulos.

[79], [80], [81], [82],

Slutförande av laboratorieutrustning för PCR-diagnostik

Laboratoriet innehåller utrustning för följande rum.

• rum för provberedning, innehåller följande utrustning: laminär av II-klassen av skydd "SP-1.2": fast tillståndstermostat med uppvärmningskåpa för provrör av typen "Eppendorf"; mikrocentrifug vid 13 000 rpm; en centrifug (vortex); kylskåp med temperaturintervall från -20 ^ї С till +10 ^ї; pipetter med variabel volym i "Rroline" serien; en pump med en OM-1 fällningskolv; ett stativ för pipetter; stativ arbetsstation 200x0,5 ml; stativ arbetsstation 50x1,5 ml; Stativ för förvaring av provrör 80x1,5 ml;
• Reaktionsblandningsberedningsrum: PCR-box med skyddskammare ("Laminar-C, 110 cm); centrifug - Vortex; Variable volym pipetter av Proline serien; ett stativ för pipetter; stativ arbetsstation 200x0,2 ml; Stativ för förvaring av provrör 80x1,5 ml; kylskåp med temperaturintervall från -20 ^ї С till + 10 ^о С;
• utrymme för elektrofores: kamera för horisontell elektrofores; strömförsörjning; transilluminator;
• DNA-förstärkare eller nukleinsyraanalysator (PCR i realtid) med en dator och mjukvara; kan placeras i något extra rum. Om realtids-PCR-teknik används. Utrymme för elektrofores behövs inte.

[83], [84], [85], [86]

Extern kvalitetskontroll

För att vara säkra på att få objektivt tillförlitliga resultat bör laboratorier delta i systemet för extern utvärdering av laboratorieforskningens kvalitet.

Deltagare i kvalitetsstyrningssystemet mottar; 12 injektionsflaskor med frystorkade bakterie cellsuspensioner, av vilka två innehåller E. Coli E. Coir, 3 injektionsflaskor med Mycobacterium tuberculosis (avirulent stam) vid 10 ² / ml; 3 ampuller med celler av en liknande stam i en koncentration av 10 ⁴ / ml; 2 ampuller med icke-tuberkulos-mykobakterier M. Avium-intracellulare och M. Kansasii i en koncentration av 10 ⁵ / ml.

Distribuerade tester för extern kvalitetsbedömning prövas i två oberoende laboratorier med stor erfarenhet inom detta område.

[87], [88]