Orsaker till tuberkulos

Familjen Mycobacteriaceae i ordningen Actinomycetales omfattar det enda släktet Mycobacterium. År 1975 fanns det cirka 30 arter i detta släkte, och år 2000 hade antalet redan närmat sig 100. De flesta mykobakteriearter klassificeras som saprofytiska mikroorganismer, utbredda i miljön.

Gruppen av obligata parasiter är obetydlig, men dess praktiska betydelse är stor och bestäms av de arter som orsakar tuberkulos hos människor och djur. Det finns en uppfattning att föregångarna till mykobakterier som är patogena för människor var forntida jordmykobakterier.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Taxonomi för mykobakterier

Alla mykobakterier är indelade i de som är patogena för människor och de som är opportunistiska.

Inom klinisk mikrobiologi används flera metoder för att klassificera mykobakterier:

• genom tillväxthastighet och optimal temperatur, förmågan att bilda pigment;
• för kliniskt signifikanta komplex.

De mykobakteriearter som orsakar tuberkulos kombineras i M. tuberculosis-komplexet, vilket inkluderar M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti och M. canettii. Nyligen har M. pinnipedii och M. sarrae, som är fylogenetiskt besläktade med M. microti och M. bovis, lagts till.

De återstående mykobakterierna som orsakar olika mykobakterier klassificeras som icke-tuberkulösa mykobakterier. Följande komplex skiljer sig från denna grupp: M. avium, bestående av M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum; M.fortuitum inklusive underarterna M.fortuitum och M. chelonae, och M. terrae, inklusive M. terrae, M. triviale och M. nonchromogenicum. De viktigaste grupperna är spetälskepatogenen M. leprae, samt ulcerös lesionpatogen Buruli M. ulcerans.

Denna klassificering förenar mykobakteriearter med samma kliniska betydelse, när deras finare differentiering inte är avgörande. Biologiska, biokemiska och molekylära metoder används för att identifiera arter inom grupper och komplex.

Klassificeringen av icke-tuberkulösa mykobakterier baserad på kulturella skillnader utvecklades av Runyon 1959. Enligt den urskiljs fyra grupper av mykobakterier.

Grupp I - fotokromogena mykobakterier

Denna grupp inkluderar mykobakterier som inte är pigmenterade när de odlas i mörker, men får ljusgul eller gul-orange pigmentering efter exponering för ljus. Potentiellt patogena stammar som tillhör denna grupp är M. asiaticum, M. kansasii, M. marinum, M. simiae. Bland mykobakterierna i denna grupp finns både snabbväxande (M. marinum) och långsamt växande (M. asiaticum, M. kansasii). Den optimala tillväxttemperaturen varierar från 25 ^° C för M. simiae, 32-33 ^° C för M. marinum till 37 ^° C för M. asiaticum.

Den kliniskt mest signifikanta arten i vårt land är M. kansasii, som finns i vattendrag. M. kansasii-stammen (M. luciflavum) orsakar sjukdomar hos människor. Den växer i äggmedium som grova eller släta kolonier, med en temperaturoptimum på 37 ^° C. Morfologiskt är bakterierna av måttlig längd. Två varianter av M. kansasii har hittills beskrivits: orange och vit. När M. kansasii introduceras till marsvin orsakar den infiltrationer och kompaktering av regionala lymfkörtlar.

Grupp II - skotokromogena mykobakterier (från det grekiska ordet scotos - mörker)

Denna grupp omfattar mykobakterier som bildar pigment i mörker. Tillväxthastigheten är 30–60 dagar. Denna grupp omfattar M. aquae (M. gordonae) och M. scrofulaceum.

M. scrofulaceum anses vara en potentiellt patogen art. På äggsubstrat växer bakterier av denna art som släta eller grova kolonier av orange färg. Morfologiskt är mykobakterier stavformade, korta eller långa. De växer vid en temperatur på 25-37 ^° C. Hos barn orsakar de skador på lymfkörtlar och lungor.

M. aquae (M. gordonae) klassificeras som saprofytiska skotokromogena mykobakterier. De växer i äggmedium som orange kolonier vid en temperatur på 25-37 °C. Morfologiskt är mykobakterierna stavformade och måttligt långa (>5 μm). De finns i vattendrag.

Grupp III - icke-fotokromogena mykobakterier

Denna grupp omfattar mykobakterier som inte bildar pigment eller har en ljusgul färg som inte intensifieras i ljus. De växer i 2–3 eller 5–6 veckor. De inkluderar: M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri, M. hattey, M. bruiiense.

M. avium (fågelmykobakterier) växer på Lowenstein-Jensen-medium som pigmenterade eller svagt pigmenterade kolonier vid 37 ^° C och 45 ^° C. Morfologiskt är de medellånga stavar. De kan vara patogena för människor och ett antal försöks- och husdjur (t.ex. grisar). De finns i vatten och jord.

M. xenopi isoleras från en padda. Unga kulturer växer som opigmenterade kolonier. Senare framträder ett gult pigment. Morfologiskt sett är de långa trådformade stavar. De växer vid en temperatur på 40-45 ^° C. De är villkorligt patogena för människor.

M. terrae isolerades först från rädisor. De växer på Lowenstein-Jensen-medium och som pigmentfria kolonier. Den optimala tillväxttemperaturen är 37 ^° C. Morfologiskt representeras de av stavar av måttlig längd, saprofyter.

Grupp IV - snabbväxande mykobakterier

Mykobakterier som tillhör denna grupp kännetecknas av snabb tillväxt (upp till 7-10 dagar). De växer i form av pigmenterade eller icke-pigmenterade kolonier, oftare i form av R-form. God tillväxt ges i 2-5 dagar vid en temperatur på 25 ^° C. Denna grupp inkluderar potentiellt patogena mykobakterier M.fortuitum, såväl som saprofytiska mykobakterier, såsom M. phlei, M. smegmatis, etc. M. fortuitum ger synlig tillväxt på äggmediet på 2-4:e dagen i form av en "rosett". Morfologiskt representeras mykobakterier av korta stavar. På Lowenstein-Jensen-mediet kan de absorbera malakitgrönt och bli gröna. De är utbredda i naturen.

Runyon-klassificeringen har visat sig vara mycket bekväm för att identifiera de vanligaste typerna av mykobakterier. Upptäckten av nya arter och framväxten av ett ökande antal mellanformer av mykobakterier orsakar dock svårigheter att registrera dem i en eller annan Runyon-grupp.

M. tuberculosis är en ung evolutionär formation. På senare tid har det funnits en tendens att dela upp M. tuberculosis i kluster eller familjer. De viktigaste stammarna är de som tillhör Beijing-familjen, vilka utmärks av klonalt beteende och förmågan att orsaka mikroutbrott av tuberkulos.

Mykobakteriernas morfologi

Mykobakterier är tunna stavformade celler med den karakteristiska egenskapen syra- och alkoholbeständighet (i ett av tillväxtstadierna), aeroba. När de färgas enligt Gram är de svagt grampositiva. Mykobakterier är orörliga och bildar inte sporer. Konidier eller kapslar saknas. De växer långsamt eller mycket långsamt på täta näringsmedier: vid optimal temperatur uppträder synliga kolonier efter 2–60 dagar. Kolonierna är rosa, orange eller gula, särskilt vid tillväxt i ljus. Pigmentet diffunderar inte. Koloniernas yta är vanligtvis matt (S-typ) eller grov (R-typ). Mykobakterier växer ofta i form av slemmiga eller skrynkliga kolonier. På flytande medier växer mykobakterier på ytan. Den ömtåliga torra filmen tjocknar med tiden, blir bucklig-rynklig och får en gulaktig nyans. Buljongen förblir transparent och diffus tillväxt kan uppnås i närvaro av rengöringsmedel. I mikrokolonierna av M. tuberculosis (dvs. i de tidiga stadierna) bildas strukturer som liknar snören – en egenskap som är förknippad med snörfaktorn.

När de färgas med karbolfuchsin framträder mykobakterier tuberkulos som tunna, lätt böjda stavar med hallonröd färg, innehållande ett varierande antal granuler.

Mykobakteriernas längd är ungefär 1–10 µm och bredden är 0,2–0,7 µm. Ibland kan böjda eller vridna varianter förekomma. Mikroorganismer som finns enskilt, parvis eller i grupper sticker ut väl mot den blå bakgrunden av andra komponenter i preparatet. Bakterieceller kan ofta vara arrangerade i form av den romerska siffran "V".

Preparatet kan också avslöja förändrade kokoida syraresistenta former av patogenen, rundade sfäriska eller mycelliknande strukturer. I detta fall måste ett positivt svar bekräftas med ytterligare metoder.

Strukturen av cellväggen hos mykobakterier

Mykobakteriernas cellvägg är den mest komplexa jämfört med andra prokaryoter.

Medan gramnegativa bakterier har två membran, består den mykobakteriella cellväggen av flera lager, av vilka några innehåller sockerarter och kännetecknas av en relativt konstant sammansättning. De yttre lagren har en föränderlig kemisk sammansättning och representeras huvudsakligen av lipider, varav de flesta är mykolsyror och deras derivat. Som regel är dessa lager inte synliga under elektronmikroskopi. Cellväggens primära ramverk är tvärbundna peptidglykaner - ett elektrontätt lager. Arabinogalaktanlagret upprepar peptidglykanlagret och bildar ett polysackaridstroma i cellväggen. Det har förbindelsepunkter med peptidglykanlagret och strukturer för bindning av mykolsyror och deras derivat.

Mykolsyror finns i form av fria sulfolipider och cordfaktor, vars närvaro på cellytan är förknippad med den karakteristiska bildningen av M. tuberculosis-kolonier i form av flageller. Mykolsyrornas unika karaktär och nyckelroll i mykobakteriernas strukturella organisation och fysiologi gör dem till ett utmärkt mål för etiotropisk behandling.

Glykolipidlagret kallas "mykosider" och jämförs ibland med en mikrokapsel. Mykosider är strukturellt och funktionellt lika lipopolysackariderna i det yttre membranet hos gramnegativa bakterier, men saknar sin aggressivitet; ändå är de toxiska och (liksom cordfaktor och sulfolipider) orsakar de bildandet av granulom.

Cellmembranet och cellväggens lager är genomsyrade av kanaler eller porer, bland vilka vi kan urskilja passiva porer med kort livslängd, som ger kontrollerad diffusion av ämnen, och kanaler med längre livslängd, som ger energiberoende transport av ämnen.

En annan komponent i mykobakteriernas cellvägg är lipoarabinomannan. Den är förankrad i plasmamembranet, penetrerar cellväggen och kommer ut på dess yta. I detta avseende liknar den lipoteikoinsyrorna hos grampositiva bakterier eller lipopolysackarid-O-antigenet hos gramnegativa bakterier. De terminala fragmenten av lipoarabinomannan, främst dess mannosradikaler, hämmar ospecifikt aktiveringen av T-lymfocyter och leukocyter i det perifera blodet. Detta leder till en störning av immunsvaret mot mykobakterier.

Variabilitet och former av mykobakteriers existens

Bakteriers persistens har en särskild patogenetisk betydelse. Laboratorieexperiment utförda in vitro och in vivo har visat att de bakteriedödande läkemedlen isoniazid och pyrazinamid dödar mykobakterier endast i reproduktionsfasen. Om mykobakterierna befinner sig i en fas med låg metabolisk aktivitet (dvs. bakterietillväxten är nästan helt avstängd och bakterierna kan kallas "vilande"), påverkar inte bakteriedödande läkemedel dem. Detta tillstånd kallas vanligtvis vilande, och mikroorganismerna kallas persister. Persister är inte känsliga för kemoterapeutiska läkemedel, d.v.s. de beter sig som resistenta mikroorganismer. De kan faktiskt behålla känsligheten för läkemedel.

En kraftfull stimulans för mykobakteriella cellers övergång till ett vilande tillstånd är kemoterapeutiska läkemedel, såväl som faktorer i värdens immunsystem. Persister kan stanna kvar i lesionerna i månader eller till och med år. Under persistensen kan mykobakterier omvandlas till L-former. I denna form uppvisar mykobakterier extremt låg metabolisk aktivitet, främst inriktad på att öka tjockleken på cellväggen och den extracellulära matrixen, vilket förhindrar enkel diffusion av ämnen. Dessutom ackumulerar mykobakterier genetiskt material, vilket ökar sannolikheten för att återskapa en normalt fungerande cell när gynnsamma förhållanden uppstår. Detektion av L-former med standardmikrobiologiska metoder är svårt.

Om vilande mykobakterier återfår metabolisk aktivitet och börjar föröka sig under kemoterapi, dör de snabbt. Om kemoterapin avslutas fortsätter sådana "återupplivade" mykobakterier att föröka sig och orsaka ett återfall av sjukdomen. Detta förklarar motiveringen av långa kemoterapikurer och användningen av efterföljande korta profylaktiska, vanligtvis säsongsbetonade, kemoprofylaxkurer.

Mykobakteriernas fysiologi

I prokaryoternas rike är mykobakterier de obestridda ledarna inom syntes av komplexa organiska föreningar. De har förmodligen den mest flexibla metabolismen, vilket ger den nödvändiga variationen för överlevnad både i den yttre miljön och i makroorganismen. Hittills har mer än 100 enzymatiska reaktioner beskrivits, vilket visar den grenade och komplexa naturen hos mykobakteriers metabolism. För att syntetisera slutliga föreningar eller tillhandahålla de nödvändiga fysiologiska funktionerna i mykobakterier kan parallella metaboliska vägar utföras beroende på tillgången på substrat, kemisk miljö, tillhandahållande av andningscykler med nödvändiga komponenter (metalljoner, partialtryck av syre, koldioxid, etc.).

Biokemiska egenskaper hos mykobakterier

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Lipidmetabolism

Cellväggslipider, som utgör upp till 60 % av cellens torra massa, bestämmer de icke-standardiserade tinktoriala, fysiologiska och ekologiska egenskaperna hos mykobakterier.

De specifika lipiderna hos mykobakterier som hittills beskrivits är indelade i 7 huvudgrupper enligt strukturella egenskaper:

1. fettsyraderivat av kolhydrater (främst trehalos - cordfaktor):
2. fosfatidylmyoinositolmannosider:
3. fettsyraderivat av peptider;
4. N-acylpeptidglykosider - mykosider C;
5. fettsyraestrar av ftioceroler;
6. mykosider A, B. G;
7. glycerolmykolater.

Lipider i grupperna 4-6 finns endast i mykobakterier.

Bland de unika är det värt att notera tuberkulostearinsyra och tuberkulopalmitinsyror, vilka är föregångare till mykolsyror.

Mykolsyror är en grupp högmolekylära fettsyror med en kedjelängd på upp till 84 kolatomer, vars huvudkedjas struktur bestäms av mikroorganismens systematiska position och dess tillväxtförhållanden. Deras låga reaktivitet säkerställer hög kemisk resistens hos mykobakteriernas cellvägg. Mykolater hämmar enzymatisk klyvning av cellväggen och fria radikalreaktioner.

Cordfaktor klassificeras som en lipidgrupp 1. Den är förknippad med hög toxicitet hos mykobakterier och virulens.

Ytaktiva lipider, eller sulfolipider, spelar en viktig roll i mykobakteriers intracellulära anpassning. Tillsammans med sladdfaktorn bildar de cytotoxiska membranotropa komplex.

Lipoarabinomannan är en heterogen blandning av högmolekylära lipopolysackarider: grenade polymerer av arabinos och mannos med diacylglycerolderivat av palmitin- och tuberkulostearinsyra.

Mykosider C är peptidglykolipider som bildar det yttre membranet hos mykobakterier, vilket kan observeras under elektronmikroskopi som en transparent zon i cellernas periferi. Mykosider är artspecifika föreningar. Mykobakteriernas antigena egenskaper beror på deras typ.

Den kvantitativa och kvalitativa sammansättningen av lipidföreningar i mykobakterier är dynamisk och beror på cellernas ålder, näringsmediets sammansättning och miljöns fysikalisk-kemiska egenskaper. Unga mykobakterieceller börjar bilda en cellvägg genom att syntetisera lipopolysackarider med relativt korta alifatiska kedjor. I detta skede är de ganska sårbara och tillgängliga för immunsystemet. Allt eftersom cellväggen växer och högmolekylära lipider bildas, förvärvar mykobakterier resistens och likgiltighet i sina interaktioner med immunsystemet.

Kolhydratmetabolism

Den mest föredragna kolkällan för mykobakterier är glycerol.

De viktigaste kolhydraterna är arabinos, mannos och maltos, som utgör mer än hälften av alla sackarider. Dessutom spelar trehalos, glukos, fruktos, galaktos, ramnos och vissa andra sackarider en roll i cellens vitala aktivitet. I detta fall sker syntesen längs hydrolas- och aldolasvägarna. Pyruvatvägen används för att syntetisera glykogen. Arabinos och mannos deltar i bildandet av viktiga strukturella föreningar. Pentosfosfatvägen för glukosoxidation används för att utvinna energi. Den tillhandahålls av enzymerna malat-, isocitrat- och succinatdehydrogenaser, vilket ger andningssystemet flexibilitet.

Glyoxylatvägen, som mykobakterier använder för att införliva fria fettsyror som ackumuleras under mykobakteriell tillväxt i trikarboxylsyracykeln, är unik. Denna cykel har uppmärksammats av forskare som en möjlig mekanism för mykobakteriell kemotaxi under persistens.

Kväve- och aminosyrametabolism

Utnyttjandegraden av nitrater, nitriter och hydroxylaminer av mykobakterier kan användas för att identifiera arter. Mykobakterier föredrar asparagin som kvävekälla. Syntesen av aminosyror är en energiberoende process och tillhandahålls av en grupp enzymer som möjliggör användning av andra aminosyraföreningar, såsom glutamat.

Nitrit- och nitratreduktasaktivitet

Mycobacterium tuberculosis kan bilda adenosintrifosfat (ATP) genom att överföra elektroner längs en kedja av bärare som slutar på NO3- _snarare än O2 _. Dessa reaktioner reducerar _NO3 till NH3 _i mängder som är nödvändiga för syntesen av aminosyror, purin- och pyrimidinbaser. Detta åstadkoms genom den sekventiella verkan av nitrat- och nitritreduktaser.

Katalas- och peroxidasaktivitet

Katalas förhindrar ansamling av väteperoxid, som bildas under aerob oxidation av reducerade flavoproteiner. Enzymaktiviteten beror på mediets pH och temperaturen. Vid en temperatur på 56 °C är katalas inte aktivt. Det finns tester för tillhörighet till det patogena komplexet av mykobakterier, baserat på katalasets termolabilitet.

Det är känt att 70 % av Mycobacterium tuberculosis-stammar som är resistenta mot isoniazid förlorar sin katalas- och peroxidasaktivitet.

Peroxidas- och katalasaktivitet utförs av samma enzymkomplex.

[ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Vitaminer och koenzymer

M. tuberculosis innehåller B-vitaminer (riboflavin, pyridoxin, cyanokobalamin, tiamin), vitamin C och K, para-aminobensoesyra, pantotensyra och nikotinsyra, biotin och folsyra.

Metabolism, näring och respiration hos mykobakterier

Under normala, gynnsamma förhållanden är mykobakterier tuberkulos strikt aerober och mesofiler, dvs. de växer i närvaro av syre och i temperaturintervallet 30-42 ^° C, helst vid 37 ^° C. Under ogynnsamma yttre förhållanden och/eller syrebrist manifesterar sig mykobakterier tuberkulos som mikroaerofiler och till och med som anaerober. I detta fall genomgår deras metabolism betydande förändringar.

_{När det gäller syreförbrukning och utveckling av oxidassystem liknar mykobakterier riktiga svampar. Vitamin K9} fungerar som en länk mellan NADH-dehydrogenas och cytokrom b i överföringssystemet hos släktet Mycobacterium. Detta cytokromsystem liknar det mitokondriella. Det är känsligt för dinitrofenol, precis som hos högre organismer.

Den beskrivna typen av respiration är inte den enda källan till ATP-bildning. Förutom O2 terminalen kan mykobakterier använda respirationskedjor som överför elektroner och slutar med nitrater (NO3- ₎^. Reservkraften i mykobakteriernas respirationssystem är glyoxylatcykeln.

Anoxisk (endogen) respiration, som sker i en atmosfär med en syrekoncentration på mindre än 1%, stimuleras av azidföreningar, vilka minskar oxidationen av pyruvat eller trehalos.

Tillväxt och reproduktion av mykobakterier

Mycobacterium tuberculosis reproducerar sig extremt långsamt: fördubblingsperioden är 18–24 timmar (normala bakterier delar sig var 15:e minut). Därför krävs minst 4–6 veckor för att uppnå synlig tillväxt av typiska kolonier. En av anledningarna till mykobakteriernas långsamma reproduktion anses vara deras uttalade hydrofobicitet, vilket komplicerar diffusionen av näringsämnen. Det är mer troligt att detta är genetiskt betingat och är förknippat med en mer komplex struktur hos mykobakterierna. Det är till exempel känt att de flesta bakterier har flera kopior av ribosomalt ribonukleinsyra (rRNA)-operon. Långsamt växande mykobakterier (M. tuberculosis, M. leprae) har en kopia av operonet, och snabbväxande (M. smegmatis) har bara två kopior.

Vid odling i flytande medier växer mykobakterier på ytan. Den ömtåliga torra filmen tjocknar med tiden, blir ojämn och skrynklig och får en gulaktig nyans, ofta jämförd med elfenbensfärgen. Buljongen förblir transparent och diffus tillväxt kan endast uppnås i närvaro av rengöringsmedel, såsom Tween-80. I mikrokolonier (dvs. i tidiga stadier) bildas strukturer som liknar buntar – ett drag som är förknippat med sladdfaktorn hos M. tuberculosis.

Genetik hos mykobakterier

Släktet Mycobacterium är genetiskt mycket mångsidigt. Till skillnad från många saprofytiska och icke-tuberkulösa mykobakterier innehåller Mycobacterium tuberculosis inte extrakromosomala inneslutningar (t.ex. plasmider). All mångfald av egenskaper hos Mycobacterium tuberculosis bestäms av dess kromosom.

M. tuberculosis-komplexets genom är extremt konservativt. Dess representanter har DNA-homologi på nivån 85–100 %, medan DNA:t från andra mykobakteriearter endast är homologt med M. tuberculosis med 4–26 %.

Representanter för släktet Mycobacteria har stora genom jämfört med andra prokaryoter - 3,1-4,5x10 ^{^9} Da. Emellertid är genomet hos patogena arter mindre än hos andra mykobakterier (hos M. tuberculosis - 2,5x10^ ⁹ Da). Det klassiska orsakande medlet för mänsklig tuberkulos, M. tuberculosis, har fler gener än M. africanum och M. bovis, som har förlorat en del av sitt genetiska material under evolutionen.

År 1998 publicerades nukleotidsekvensen för kromosomen i H37Rv-stammen av M. tuberculosis. Dess längd är 4 411 529 baspar. Kromosomen i tuberkulosmykobakterien har en ringstruktur. Den innehåller cirka 4 000 gener som kodar för proteiner, samt 60 kodande funktionella RNA-komponenter: en unik ribosomal RNA-operon, 10Sa RNA, som deltar i nedbrytningen av proteiner med atypiskt matrix-RNA, 45 transport-RNA (tRNA) och mer än 90 lipoproteiner.

Mer än 20 % av genomet upptas av gener för cellväggens fettsyrametabolism, inklusive mykolsyror, glycinrika sura polypeptider (PE- och PPE-familjer), kodade av polymorfa regioner i PGRS-genomet (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) respektive MPTR-genomet (Major polymorphic tandem repeat) (den femte respektive fjärde ringen på den genomiska kromosomkartan). Variabiliteten i dessa genomregioner säkerställer skillnader i antigener och förmågan att hämma immunsvaret. Genomet för Mycobacterium tuberculosis innehåller i stor utsträckning gener som kontrollerar virulensfaktorer.

Mycobacterium tuberculosis syntetiserar alla komponenter som är nödvändiga för metabolismen: essentiella aminosyror, vitaminer, enzymer och kofaktorer. Jämfört med andra typer av bakterier har M. tuberculosis ökad aktivitet av lipogenesenzymer. Två gener kodar för hemoglobinliknande proteiner som fungerar som antioxidantskydd eller fällor för överskott av cellulärt syre. Dessa egenskaper underlättar snabb anpassning av Mycobacterium tuberculosis till abrupta förändringar i miljöförhållandena.

Ett utmärkande drag hos M. tuberculosis-komplexets genom är ett stort antal upprepade DNA-sekvenser. Således innehåller kromosomen hos M. tuberculosis H37Rv upp till 56 kopior av IS-element (insertionssekvenser), vilket ger DNA-polymorfism av Mycobacterium tuberculosis. De flesta av dem, med undantag för IS6110-elementet, är oförändrade. Kromosomerna hos olika stammar av Mycobacterium tuberculosis innehåller vanligtvis från 5 till 20 kopior av IS6110, men det finns stammar som inte har detta element. Tillsammans med IS-element innehåller genomet flera typer av korta nukleotidupprepningar (PGRS och MPTR), såväl som direkta upprepningar DR (Direct Repeat), belägna i DR-regionen och separerade av variabla sekvenser - spacers (den sjätte ringen på kromosomkartan). Skillnader i antal kopior och lokalisering på kromosomen av dessa genetiska element används för att differentiera stammar av Mycobacterium tuberculosis inom molekylär epidemiologi. De mest avancerade schemana för genotypning av mykobakterier är baserade på detektion av genomisk polymorfism orsakad av IS6110-elementet, såväl som DR och deras spacers. Det är karakteristiskt att divergensen mellan M. tuberculosis-arterna som regel sker på grund av rekombinationer mellan kopior av IS6110-elementet, vilka flankerar olika gener.

Två profager, phiRv1 och phiRv2, hittades i H37Rv-genomet. Liksom det polymorfa stället hos Dral är de förmodligen associerade med patogenicitetsfaktorer, eftersom dessa regioner i genomet skiljer sig från liknande regioner i de avirulenta stammarna av M. tuberculosis H37Ra och M. bom BCG. Regioner i genomet (mutT, ogt-gener) som är ansvariga för en ökning av mutationshastigheten och anpassningen av mykobakterier tuberculosis under pressförhållanden identifierades. Upptäckten av triggergener för dvala hos mykobakterier tuberculosis förändrade konceptet för latent tuberkulosinfektion.

Studie av polymorfism hos gener som kodar för katalas, peroxidas och A-subenheten av DNA-gyras. Tre genotypiska grupper identifierades i M. tuberculosis-komplexet. Den äldsta (ur evolutionär synvinkel) är grupp I: M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis och M. microti. Grupp II och III inkluderar olika stammar av M. tuberculosis, som har blivit utbredda i vissa geografiska regioner. Klonalt beteende är karakteristiskt för grupperna I och II, och stammar av grupp III orsakar extremt sällan masssjukdomar. Genetiska familjer av M. tuberculosis, som fick namnen Haarlem, Afrika och Filippinerna, är utbredda i olika regioner i världen.

En särskild plats intas av Pekingfamiljen, som först identifierades i histologiska preparationer av lungvävnad från patienter i Pekings förorter mellan 1956 och 1990. Hittills har stammar av denna familj hittats i asiatiska länder, Sydafrika, Karibien och USA. Spridningen av denna genotyp i olika områden bestäms av den inhemska befolkningens och migranternas etniska egenskaper. Nyligen har data erhållits om spridningen av stammar av SI/Peking-genotypen i nordvästra delen av den europeiska delen av Ryssland (Sankt Petersburg) och i regionerna Sibirien.

Mykobakteriell resistens

Under evolutionen har tuberkulosmykobakterier utvecklat olika mekanismer för att övervinna eller inaktivera ogynnsamma miljöfaktorer. För det första är detta en kraftfull cellvägg. För det andra är detta omfattande metaboliska förmågor. De kan inaktivera många cellulära toxiner och ämnen (olika peroxider, aldehyder och andra) som förstör cellmembranet. För det tredje är detta morfologisk plasticitet, som består i transformationen av mykobakterier (bildandet av L-former av vilande celler). När det gäller deras stabilitet, efter sporbildande bakterier, intar de en ledande plats i prokaryoternas rike.

Patogenen förblir livskraftig i torrt tillstånd i upp till 3 år. Vid uppvärmning kan tuberkulosmykobakterier motstå temperaturer betydligt högre än 80°C. Idag tror man att tuberkulosmykobakterier som finns i slem förblir livskraftiga när det senare kokas öppet i 5 minuter.

Mycobacterium tuberculosis är resistent mot organiska och oorganiska syror, alkalier, många oxidationsmedel, samt ett antal antiseptiska och uttorkande ämnen som har en skadlig effekt på andra patogena mikroorganismer. Mycobacterium uppvisar resistens mot effekterna av alkoholer och aceton.

Det noteras att produkter baserade på kvartärt ammonium inte uppvisar anti-tuberkulosaktivitet. Under vissa förhållanden har koncentrationer av klor och syreradikaler upp till 0,5 % inte heller någon skadlig effekt på tuberkulosmykobakterier. Detta innebär att det är omöjligt att använda sådana produkter för att sterilisera sputum och annat infekterat biologiskt material.

Mycobacterium tuberculosis är okänslig för diffust solljus och kan existera i den yttre miljön i mer än ett år utan att förlora sin livskraft. Kortvågig ultraviolett strålning har en universell bakteriedödande effekt på alla mikroorganismer. Men under verkliga förhållanden, när Mycobacterium tuberculosis suspenderas i form av cellulära agglomerat med dammpartiklar, ökar deras motståndskraft mot ultraviolett strålning.

Den höga överlevnadsgraden för tuberkulosmykobakterier bidrar till den extremt utbredda spridningen av denna infektion bland befolkningen oavsett klimatförhållanden. Detta är dock inte den enda faktorn som bidrar till problemets globalisering – tuberkulosmykobakterier kan finnas kvar i människokroppen under lång tid och återaktiveras med obegränsade intervaller.

Lokalisering av tuberkulosmykobakterien inuti makrofager ger tillräcklig substratstabilitet, med hänsyn till mononukleära fagocyters "livslängd" och varaktigheten av mykobakteriell replikation, samt isolering från humorala immunitetseffektorer. Samtidigt väljer patogenen en biotop som är oacceptabel för de flesta mikroorganismer på grund av dess potentiella fara. Denna symbios tillhandahålls av ett antal adaptiva mekanismer hos mykobakterier.

Processen för makrofagskada och parasitism i den ser ut så här: penetration av mykobakterier i makrofagen utan dess aktivering; undertryckande av bildandet av fagolysosomer eller deras omvandling till en zon som är bekväm för bakterier; genombrott från fagosomer in i cytoplasman med inaktivering av antimikrobiella faktorer; störning av cellens vitala aktivitet; försvagning av makrofagernas känslighet för aktiverande signaler från T-lymfocyter; minskning av makrofagernas antigenpresenterande funktion och den därmed sammanhängande försvagningen av reaktionerna hos cytotoxiska T-lymfocyter som är konfigurerade att förstöra infekterade celler.

Naturligtvis spelar cellväggens egenskaper en viktig roll för att säkerställa detta, liksom metaboliska och funktionella förmågor. Vid första kontakten med mykobakterier kan makroorganismens immunsystem inte aktivera humoral immunitet, snabbt neutralisera och eliminera cellen från kroppen, eftersom de mobila alifatiska kedjorna i mykobakterieväggen inte tillåter en bedömning av patogenens ytstrukturer och överför relevant information för syntesen av den nödvändiga uppsättningen antikroppar.

Mykobakteriernas höga hydrofobicitet säkerställer ospecifika, dvs. receptoroberoende, kontakter med makrofager. Genom att bilda en fagosom runt mykobakteriecellen placerar makrofagen den inuti sig själv. Ytkomplex av mykosid och lipoarabinomannan kan kännas igen av receptorer, men signalerna som utlöses genom dem aktiverar inte eller aktiverar svagt makrofager. Som ett resultat åtföljs inte fagocytos av frisättning av fria radikaler av syre och kväve. Man tror att detta är mer karakteristiskt för virulenta stammar av M. tuberculosis, vilka på grund av lipoarabinomannans strukturella egenskaper initierar "icke-aggressiv" fagocytos. Andra makrofagreceptorer, särskilt CD 14 och receptorer för komplementkomponenten C3 (CR1-CR3), deltar också i igenkänningen av M. tuberculosis.

Efter att ha trängt in i makrofagen inkluderar mykobakterien ett antal mekanismer som förhindrar bildandet av fagolysosomen: produktion av ammonium, vilket alkaliserar miljön inuti fagosomen, syntes av sulfolipider, vilket leder till bildandet av en negativ laddning på fagosomens yta, vilket förhindrar sammansmältning av fagosomen och lysosomen.

Om en fagolysosom bildas kan mykobakterien, tack vare sitt kraftfulla vaxartade skal, släcka fria radikalreaktioner orsakade av bakteriedödande ämnen i fagocyter. Ammonium alkaliserar miljön, blockerar aktiviteten hos lysosomala enzymer, och sulfolipider neutraliserar membranotropa katjoniska proteiner. Dessutom producerar tuberkulosmykobakterier mycket aktiva enzymer med katalas- och peroxidasaktivitet, vilka konkurrerar med makrofagernas peroxidassystem och samtidigt inaktiverar lysosomhydroperoxider. Allt detta ökar mykobakteriernas resistens mot oxidativ stress.

Ytterligare anpassning av mykobakterier består i att använda järnhaltiga föreningar från makrofager för deras enzymsystem och blockera makrofagernas immunspecifika funktioner. Makrofager är en av de viktigaste reservoarerna av järn, vars överskott ackumuleras i form av ferritin. Järnhalten i alveolära makrofager är 100 gånger högre än i blodmonocyter, vilket säkerligen bidrar till deras kolonisering av tuberkulosmykobakterier.

Mykobakterier utövar toxiska effekter på makrofager med hjälp av endotoxiner och ospecifika faktorer. Båda påverkar främst makrofagernas andningsvägar - mitokondrier. Endotoxiner inkluderar mykoliska arabinolipider, som hämmar mitokondriell respiration. Ospecifika toxiner inkluderar produkter från syntesen av lipiddelen av mykobakteriecellen - ftien och ftionsyra, vilket orsakar frikoppling av oxidativ fosforylering. Ökade metaboliska processer under dessa förhållanden åtföljs inte av korrekt ATP-syntes. Värdcellerna börjar uppleva energibrist, vilket leder till hämning av deras vitala aktivitet och därefter till cytolys och apoptos.

Det är möjligt att vissa patogenicitetsfaktorer endast bildas inuti infekterade celler, vilket är fallet med andra bakterier som föredrar en intracellulär livsstil. Till exempel uttrycker salmonella, som parasiterar inuti makrofager, dessutom mer än 30 gener. Trots den fullständiga beskrivningen av tuberkulosmykobakteriens genom är 30 % av kodonerna relaterade till proteiner med okända egenskaper.

Läkemedelsresistens hos mykobakterier

Ur klinisk synvinkel avgör en mikroorganisms läkemedelskänslighet huruvida standardkemoterapi med det angivna läkemedlet kan användas för att behandla sjukdomen som orsakas av den isolerade stammen. Resistens "förutsäger behandlingsmisslyckande med det testade läkemedlet". Med andra ord, användning av standardkemoterapi som resulterar i en systemisk läkemedelskoncentration som vanligtvis är effektiv under normala förhållanden hämmar inte proliferationen av "resistenta mikroorganismer".

Inom mikrobiologi baseras definitionen av läkemedelskänslighet eller läkemedelsresistens på populationsmetoden, vilket innebär olika grader av resistens hos en pool (heterogen uppsättning) av mikrobiella celler. Läkemedelsresistens bedöms utifrån kvantitativa egenskaper, såsom "minimal hämmande koncentration" (MIC). Till exempel dör 90 % av mikroorganismerna vid MIC-90 (bakteriostatisk koncentration). Därför bör resistens förstås som dess grad i en del av den mikrobiella populationen, vilket i de flesta fall förutbestämmer misslyckandet med behandlingen. Det är allmänt accepterat att 10 % av resistenta stammar bland hela den mikrobiella populationen hos en patient kan ha en patogen effekt. Inom ftisiobakteriologi är det för första linjens antituberkulosläkemedel 1 %. eller 20 kolonibildande enheter - CFU). En sådan del av den mikrobiella populationen kan förskjuta den ursprungliga på en månad och bilda en lesion. För andra linjens antituberkulosläkemedel är kriteriet för resistens en 10 % ökning av den mikrobiella populationen.

Utvecklingen av läkemedelsresistens hos mikroorganismer är förknippad med selektion i närvaro av ett antibiotikum och med den föredragna överlevnaden hos en del av den mikrobiella populationen som har skyddsmekanismer mot det antibakteriella medlet. Varje population innehåller ett litet antal mutanta celler (vanligtvis 10⁶ ^– 10⁶ ) som är resistenta mot ett visst läkemedel. Under kemoterapi dör känsliga mikrobiella celler, och resistenta celler förökar ^sig. Som ett resultat ersätts känsliga celler med resistenta.

Mykobakterier har initialt hög naturlig resistens mot många bredspektrumantibakteriella läkemedel, men olika arter har olika spektrum och grader av denna känslighet.

Sann naturlig resistens förstås som en permanent artspecifik egenskap hos mikroorganismer förknippad med avsaknaden av ett mål för ett antibiotikums verkan eller målets otillgänglighet på grund av cellväggens initialt låga permeabilitet, enzymatisk inaktivering av ämnet eller andra mekanismer.

Förvärvad resistens är enskilda stammars förmåga att förbli livskraftiga vid antibiotikakoncentrationer som hämmar tillväxten av huvuddelen av den mikrobiella populationen. Förvärv av resistens är i alla fall genetiskt betingat: uppkomsten av ny genetisk information eller en förändring i uttrycksnivån av ens egna gener.

För närvarande har olika molekylära mekanismer för resistens hos Mycobacterium tuberculosis upptäckts:

• antibiotikainaktivering (enzyminaktivering), till exempel genom β-laktamaser;
• modifiering av verkningsmålet (förändring i proteinets rumsliga konfiguration på grund av mutation i motsvarande region av genomet):
• hyperproduktion av målet, vilket leder till en förändring i förhållandet mellan ämne och mål och frisättning av en del av bakteriens livsuppehållande proteiner;
• aktivt avlägsnande av läkemedlet från den mikrobiella cellen (efflux) på grund av aktivering av stressförsvarsmekanismer:
• förändringar i permeabilitetsparametrarna för de yttre strukturerna i den mikrobiella cellen, vilket blockerar antibiotikumets förmåga att tränga in i cellen;
• inkludering av en "metabolisk shunt" (bypass-metabolisk väg).

Förutom den direkta påverkan på mikrobiella cellers metabolism leder många antibakteriella läkemedel (bensylpenicillin, streptomycin, rifampicin) och andra ogynnsamma faktorer (immunsystemets biocider) till uppkomsten av förändrade former av mykobakterier (protoplaster, L-former) och överför även celler till ett vilande tillstånd: intensiteten i cellmetabolismen minskar och bakterien blir okänslig för antibiotikumets verkan.

Alla mekanismer bildar olika grader av resistens, vilket ger resistens mot olika koncentrationer av kemoterapiläkemedel, så uppkomsten av resistens hos bakterier åtföljs inte alltid av en minskning av antibiotikans kliniska effektivitet. För att bedöma behandlingens effektivitet och prognos är det viktigt att känna till graden av resistens.

För närvarande har minst en gen identifierats för varje förstahandsbehandling mot tuberkulos och för de flesta reservläkemedel. Specifika mutationer leder till utveckling av resistenta varianter av mykobakterier. I den utbredda spridningen av läkemedelsresistens hos mykobakterier är en hög mutationsfrekvens in vivo viktig, högre än in vitro.

[ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ]

Typer av läkemedelsresistens hos mykobakterier

Man skiljer mellan primär och förvärvad läkemedelsresistens. Mikroorganismer med primär resistens inkluderar stammar isolerade från patienter som inte har fått specifik behandling eller som har fått läkemedel i en månad eller mindre. Om det är omöjligt att klargöra faktumet att antituberkulosläkemedel används används termen "initial resistens".

Primär läkemedelsresistens är av stor klinisk och epidemiologisk betydelse, därför är det, för en korrekt bedömning, nödvändigt att inte administrera kemoterapi till en nydiagnostiserad patient med tuberkulos innan mikrobiologisk undersökning av det diagnostiska materialet har gjorts. Frekvensen av primär läkemedelsresistens beräknas som förhållandet mellan antalet nydiagnostiserade patienter med primär resistens och antalet av alla nydiagnostiserade patienter som testats för läkemedelskänslighet under året. Om en resistent stam isoleras från en patient under antituberkulosbehandling som administrerats i en månad eller mer, anses resistensen vara förvärvad. Frekvensen av primär läkemedelsresistens karakteriserar det epidemiologiska tillståndet hos tuberkulospatogenpopulationen.

Förvärvad läkemedelsresistens bland nydiagnostiserade patienter är resultatet av misslyckad behandling (felaktigt val av läkemedel, bristande följsamhet till behandlingen, minskning av läkemedelsdoser, ojämn tillgång och läkemedelskvalitet). Dessa faktorer leder till en minskning av den systemiska koncentrationen av läkemedel i blodet och deras effektivitet, samtidigt som de "utlöser" försvarsmekanismer i mykobakteriella celler.

För epidemiologiska ändamål beräknas frekvensen av tidigare behandlade fall. För detta ändamål beaktas patienter som registrerats för återbehandling efter en misslyckad kemoterapikur eller återfall. Förhållandet mellan antalet resistenta Mycobacterium tuberculosis-kulturer och antalet av alla stammar som testats för läkemedelsresistens under året bland patienter i denna grupp vid tidpunkten för deras registrering beräknas.

I strukturen av läkemedelsresistens hos Mycobacterium tuberculosis utmärks följande:

Monoresistens - resistens mot ett av läkemedlen mot tuberkulos, känslighet mot andra läkemedel bibehålls. Vid användning av komplex terapi upptäcks monoresistens ganska sällan och som regel mot streptomycin (i 10-15 % av fallen bland nydiagnostiserade patienter).

Polyresistens är resistens mot två eller flera läkemedel.

Multipel läkemedelsresistens är resistens mot isoniazid och rifampicin samtidigt (oavsett förekomst av resistens mot andra läkemedel). Det åtföljs vanligtvis av resistens mot streptomycin etc. För närvarande har multipel läkemedelsresistens (MDR) hos tuberkulospatogener blivit ett epidemiologiskt farligt fenomen. Beräkningar visar att detektion av patogener med MDR i mer än 6,6 % av fallen (bland nydiagnostiserade patienter) kräver en förändring av strategin för det nationella antituberkulosprogrammet. Enligt data från övervakning av läkemedelsresistens varierar frekvensen av MDR bland nydiagnostiserade patienter från 4 till 15 %, bland återfall - 45–55 % och bland fall av misslyckad behandling - upp till 80 %.

Superresistens är multipel läkemedelsresistens i kombination med resistens mot fluorokinoloner och ett av de injicerbara läkemedlen (kanamycin, amikacin, kapreomycin). Tuberkulos orsakad av stammar med superresistens utgör ett direkt hot mot patienters liv, eftersom andra andrahandsbehandlingar mot tuberkulos inte har en uttalad antibakteriell effekt. Sedan 2006 har vissa länder organiserat övervakning för spridning av mykobakteriestammar med superresistens. Utomlands betecknas denna MDR-variant vanligtvis som XDR.

Korsresistens är när resistens mot ett läkemedel leder till resistens mot andra läkemedel. Vid M. tuberculosis är mutationer associerade med resistens vanligtvis inte sammankopplade. Utvecklingen av korsresistens beror på likheten i den kemiska strukturen hos vissa antituberkulosläkemedel. Korsresistens detekteras särskilt ofta inom en grupp av läkemedel, såsom aminoglykosider. För att förutsäga korsresistens är genetiska studier av mykobakteriella kulturer nödvändiga i kombination med mikrobiologiska studier av resistens.

Icke-tuberkulösa mykobakterier

Icke-tuberkulösa mykobakterier överförs extremt sällan från person till person. Frekvensen för isolering av vissa av deras arter från material från patienter är jämförbar med frekvensen för isolering av dessa arter från miljöobjekt. Smittkällor kan vara lantbruksdjur och fåglar, obearbetade produkter. Mykobakterier finns i material efter slakt och mjölk från nötkreatur.

Enligt bakteriologiska laboratorier var prevalensen av icke-tuberkulösa mykobakterier under 2004-2005 0,5-6,2 % bland alla mykobakterier hos nydiagnostiserade patienter. Frekvensen kan troligen vara något högre, eftersom metoden som används för att bearbeta det diagnostiska materialet inte är optimal för icke-tuberkulösa mykobakterier. Saprofytiska mykobakterier kan förekomma i det diagnostiska materialet om insamlingsreglerna inte följs, eller på grund av materialets egenskaper (till exempel kan M. smegmatis isoleras från urinen hos manliga patienter).

I detta avseende är det viktigt att upprepade gånger bekräfta den detekterade typen av mykobakterier från patientens material.

Mykobakterier påverkar huden, mjukvävnaderna och kan även orsaka mykobakterios i lungorna, vilket är särskilt vanligt vid immunbristtillstånd. Vid lunglokalisering upptäcks det oftare hos äldre män med en historia av kroniska lungsjukdomar, inklusive svampskador.

Av alla mykobakterier är M. avium-intracellularae-komplexet det vanligaste orsakande medlet för pulmonell mykobakterios hos människor. Det orsakar sjukdomar i lungorna, perifera lymfkörtlar och disseminerade processer. I norra Europa förekommer cirka 60 % av pulmonella mykobakterioser. Fibrokavernösa och infiltrativa processer dominerar och har ett kroniskt förlopp på grund av hög resistens mot antituberkulosläkemedel.

M. kansasii är orsaken till kronisk lungsjukdom som liknar tuberkulos. Kemoterapi är mer effektiv på grund av M. kansasis högre känslighet för antibakteriella läkemedel. M. xenopi och M. malmoense orsakar främst kroniska lungsjukdomar. De kan kontaminera varm- och kallvattenförsörjningssystem. M. malmoens livsmiljö är inte helt fastställd. M. xenopi uppvisar ganska god känslighet för antituberkulosbehandling. M. malmoense uppvisar ganska hög känslighet för antibiotika in vitro, men konservativ behandling är ofta ineffektiv och till och med dödlig. M. fortuitum och M. chelonae är erkända som orsaker till ben- och mjukdelssjukdomar på grund av direkt kontaminering av ett sår under trauma, kirurgi och penetrerande skador. De orsakar upp till 10 % av lungmykobakterierna. Det uppstår som en kronisk destruktiv bilateral lesion, ofta dödlig. Antituberkulosläkemedel och bredspektrumantibiotika är inte aktiva eller har liten aktivitet mot dessa typer av mykobakterier.

I de södra regionerna är mykobakterier i hud och mjukvävnad orsakade av M. leprae, M. ulceranse utbredda. Identifiering av icke-tuberkulösa mykobakterier utförs i laboratorierna vid landets ledande anti-tuberkulosinstitutioner. Detta kräver höga kvalifikationer och god laboratorieutrustning.