Molekylärgenetiska metoder för diagnostisering av ärftliga sjukdomar

DNA-tekniska metoder används för att bestämma lokaliseringen av en mutantgen i en specifik kromosom, som är ansvarig för ursprunget till vissa former av ärftlig patologi. Eftersom en gen är en del av DNA, och en genmutation är skada på DNA:ts primärstruktur (mutation förstås som alla förändringar i DNA-sekvensen, oavsett deras lokalisering och inverkan på en individs livskraft), är det möjligt att, genom att undersöka preparat av metafaskromosomer hos en patient med en ärftlig sjukdom, fastställa lokaliseringen av den patologiska genen. Molekylärgenetiska metoder skapar möjligheter att diagnostisera sjukdomar på nivån av förändrad DNA-struktur, de tillåter oss att bestämma lokaliseringen av ärftliga sjukdomar. Molekylärgenetiska metoder kan identifiera mutationer associerade med ersättningen av även en enda bas.

Det viktigaste steget i genidentifiering är dess isolering. DNA kan isoleras från alla typer av vävnader och celler som innehåller kärnor. Stegen i DNA-isolering inkluderar: snabb lys av celler, avlägsnande av fragment av cellulära organeller och membran genom centrifugering, enzymatisk destruktion av proteiner och deras extraktion från lösning med fenol och kloroform, koncentrering av DNA-molekyler genom utfällning i etanol.

I genetiska laboratorier isoleras DNA oftast från blodleukocyter, varvid 5–20 ml venöst blod tas från patienten till ett sterilt provrör med en antikoagulerande lösning (heparin). Därefter separeras leukocyterna och bearbetas enligt ovanstående steg.

Nästa steg i att förbereda materialet för forskning är att "skära" DNA i fragment i områden med en strikt specifik bassekvens, vilket utförs med hjälp av bakteriella enzymer - restriktionsendonukleaser (restriktionsenzymer). Restriktionsenzymer känner igen specifika sekvenser av 4-6, mer sällan 8-12 nukleotider i en dubbelsträngad DNA-molekyl och delar upp den i fragment på platserna för dessa sekvenser, kallade restriktionsställen. Antalet resulterande restriktionsfragment av DNA bestäms av frekvensen av förekomsten av restriktionsställen, och storleken på fragmenten bestäms av arten av fördelningen av dessa ställen längs den ursprungliga DNA-molekylen. Ju oftare restriktionsställena är belägna, desto kortare blir DNA-fragmenten efter restriktion. För närvarande är mer än 500 olika typer av restriktionsenzymer av bakteriellt ursprung kända, och vart och ett av dessa enzymer känner igen sin egen specifika nukleotidsekvens. I framtiden kan restriktionsställen användas som genetiska markörer för DNA. DNA-fragmenten som bildas som ett resultat av restriktion kan ordnas efter längd genom elektrofores i en agaros- eller polyakrylamidgel, och därmed kan deras molekylvikt bestämmas. Vanligtvis identifieras DNA i en gel genom specifik färgning (vanligtvis etidiumbromid) och genom att betrakta gelen i transmitterat ultraviolett ljus. DNA-lokaliseringsställena är färgade röda. Men hos människor, när DNA bearbetas av flera restriktionsenzymer, bildas så många fragment av olika längder att de inte kan separeras med elektrofores, dvs. det är inte möjligt att visuellt identifiera enskilda DNA-fragment på elektroforesen (enhetlig färgning erhålls längs hela gelens längd). För att identifiera de önskade DNA-fragmenten i en sådan gel används därför hybridiseringsmetoden med märkta DNA-prober.

Alla enkelsträngade segment av DNA eller RNA kan binda (hybridisera) med en komplementär sträng, där guanin alltid binder till cytosin och adenin till tymin. Så här bildas en dubbelsträngad molekyl. Om en enkelsträngad kopia av en klonad gen märks med en radioaktiv märkning erhålls en sond. Sonden kan hitta ett komplementärt segment av DNA, vilket sedan lätt identifieras med hjälp av autoradiografi. En radioaktiv sond som tillsätts till en beredning av sträckta kromosomer gör att genen kan lokaliseras på en specifik kromosom: med hjälp av en DNA-sond kan specifika områden identifieras under Southern blotting. Hybridisering sker om DNA-sektionen som testas innehåller en normal gen. I det fall där en onormal nukleotidsekvens finns, dvs. motsvarande kromosomstrukturer innehåller en mutantgen, kommer hybridisering inte att ske, vilket gör att lokaliseringen av den patologiska genen kan bestämmas.

För att erhålla DNA-prober används genkloningsmetoden. Kärnan i metoden är att ett DNA-fragment motsvarande en gen eller en sektion av en gen sätts in i en kloningspartikel, vanligtvis en bakterieplasmid (ringformigt extrakromosomalt DNA som finns i bakterieceller och bär på antibiotikaresistensgener), och sedan multipliceras bakterierna med plasmiden med den insatta humana genen. Tack vare syntesprocesserna i plasmiden kan miljarder kopior av den humana genen eller dess sektion erhållas.

De resulterande DNA-kopiorna, märkta med en radioaktiv märkning eller fluorokromer, används sedan som sonder för att söka efter komplementära sekvenser bland den studerade poolen av DNA-molekyler.

För närvarande finns det många olika typer av metoder som använder DNA-prober för att diagnostisera genmutationer.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]