Enzymernas och cytokinernas roll i patogenesen för osteoartrit

Under senare år har forskare ägnat stor uppmärksamhet åt att identifiera proteaser som är ansvariga för nedbrytningen av ledbrosk (ECM) vid artros. Enligt moderna koncept spelar matrixmetalloproteaser (MMP) en viktig roll i patogenesen av artros. Hos patienter med artros detekteras en förhöjd nivå av tre MMP - kollagenaser, stromelysiner och gelatinaser. Kollagenas ansvarar för nedbrytningen av nativt kollagen, stromelysin - typ IV-kollagen, proteoglykaner och laminin, gelatinas - för nedbrytningen av gelatin, kollagener IV, Vh XI-typer, elastin. Dessutom antas närvaron av ett annat enzym - aggrekanas, som har egenskaperna hos MMP och ansvarar för proteolysen av broskiga proteoglykanaggregat.

Tre typer av kollagenaser har identifierats i mänskligt ledbrosk, vars nivåer är signifikant förhöjda hos patienter med artros: kollagenas-1 (MMP-1), kollagenas-2 (MMP-8) och kollagenas-3 (MMP-13). Samexistensen av tre olika typer av kollagenaser i ledbrosk tyder på att var och en av dem spelar sin egen specifika roll. Faktum är att kollagenaserna-1 och -2 är huvudsakligen lokaliserade i den ytliga och övre mellanzonen av ledbrosk, medan kollagenas-3 finns i den nedre mellanzonen och i den djupa zonen. Dessutom visade resultaten av immunhistokemiska studier att allt eftersom artrosen fortskrider når nivån av kollagenas-3 en platå och minskar till och med, medan nivån av kollagenas-1 gradvis ökar. Det finns bevis för att kollagenas-1 vid artros huvudsakligen är involverat i den inflammatoriska processen i ledbrosk, medan kollagenas-3 är involverat i vävnadsombyggnad. Kollagenas-3, uttryckt i brosket hos patienter med artros, bryter ner typ II-kollagen mer intensivt än kollagenas-1.

Av representanterna för den andra gruppen av metalloproteaser har tre också identifierats i humant stromelysin: stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10) och stromelysin-3 (MMP-11). Idag är det känt att endast stromelysin-1 är involverat i den patologiska processen vid artros. Stromelysin-2 detekteras inte i synovialmembranet hos patienter med artros, men det finns i mycket små mängder i synovialfibroblaster hos patienter med reumatoid artrit. Stromelysin-3 finns också i synovialmembranet hos patienter med reumatoid artrit nära fibroblaster, särskilt i fibroszoner.

I gruppen av gelatinaser i mänsklig broskvävnad har endast två identifierats: 92 kD gelatinas (gelatinas B, eller MMP-9) och 72 kD gelatinas (gelatinas A, eller MMP-2); hos patienter med artros bestäms en ökning av nivån av 92 kD gelatinas.

Nyligen har ytterligare en grupp MMP identifierats, vilka är lokaliserade på ytan av cellmembran och kallas membrantyp-MMP (MMP-MT). Denna grupp inkluderar fyra enzymer - MMP-MT1 - MMP-MT-4. MMP-MT-uttryck har hittats i mänskligt ledbrosk. Även om MMP-MT-1 har kollagenasegenskaper, kan både enzymerna MMP-MT-1 och MMP-MT-2 aktivera gelatinas-72 kDa och kollagenas-3. Denna grupps MMP-roll i patogenesen av artros kräver ett förtydligande.

Proteinaser utsöndras i form av ett zymogen, vilket aktiveras av andra proteinaser eller organiska kvicksilverföreningar. Den katalytiska aktiviteten hos MMP:er beror på närvaron av zink i enzymets aktiva zon.

Den biologiska aktiviteten hos MMP:er kontrolleras av specifika TIMP:er. Hittills har tre typer av TIMP:er identifierats som finns i mänskliga ledvävnader: TIMP-1–TIMP-3. En fjärde typ av TIMP har identifierats och klonats, men den har ännu inte detekterats i mänskliga ledvävnader. Dessa molekyler binder specifikt till det aktiva sätet hos MMP:er, även om vissa av dem kan binda till det aktiva sätet för 72 kD progelatinas (TIMP-2, -3, -4) och 92 kD progelatinas (TIMP-1 och -3). Det finns bevis som tyder på att det vid artros finns en obalans mellan MMP:er och TIMP:er i ledbrosk, vilket resulterar i en relativ brist på hämmare, möjligen delvis på grund av en ökning av nivån av aktiva MMP:er i vävnaden. TIMP-1 och -2 finns i ledbrosk och syntetiseras av kondrocyter. Vid artros detekteras endast typ I TIMP i synovialmembranet och synovialvätskan. TIMP-3 finns exklusivt i ECM. TIMP-4 delar nästan 50 % av sin aminosyrasekvens med TIMP-2 och 38 % med TIMP-1. I andra målceller ansvarar TIMP-4 för att modulera aktiveringen av 72 kD progelatinas på cellytan, vilket indikerar en viktig roll som en vävnadsspecifik regulator av ECM-ombyggnad.

En annan mekanism för att kontrollera den biologiska aktiviteten hos MMP är deras fysiologiska aktivering. Man tror att enzymer från serin- och cysteinproteasfamiljen, såsom AP/plasmin respektive katepsin B, är fysiologiska aktivatorer av MMP. Ökade nivåer av urokinas (uAP) och plasmin har hittats i ledbrosket hos patienter med artros.

Trots att flera typer av katepsiner finns i ledvävnader anses katepsin-B vara den mest sannolika aktivatorn av MMP i brosk. Fysiologiska hämmare av serin- och cysteinproteaser har hittats i mänskliga ledvävnader. Aktiviteten hos AP-1-hämmaren (IAI-1), såväl som cysteinproteaser, är reducerad hos patienter med artros. I likhet med MMP/TIMP är det obalansen mellan serin- och cysteinproteaser och deras hämmare som kan förklara den ökade aktiviteten hos MMP i ledbrosket hos patienter med artros. Dessutom kan MMP aktivera varandra. Till exempel aktiverar stromelysin-1 kollagenas-1, kollagenas-3 och 92 kD gelatinas; kollagenas-3 aktiverar 92 kD gelatinas; MMP-MT aktiverar kollagenas-3 och gelatinas-72 kDa förstärker denna aktivering; MMP-MT aktiverar också gelatinas 72 kDa. Cytokiner kan delas in i tre grupper - destruktiva (inflammatoriska), regulatoriska (inklusive antiinflammatoriska) och anabola (tillväxtfaktorer).

Typer av cytokiner (enligt van den Berg WB et al)

Destruktiv	Interleukin-1 TNF-a Leukemihämmande faktor Interleukin-17
Regulatorisk	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzymhämmare
Anabol	Mnsulinliknande tillväxtfaktorer TGF-b Benmorfogenetiska proteiner Morfogenetiska proteiner härledda från brosk

Destruktiva cytokiner, i synnerhet IL-1, inducerar en ökning av frisättningen av proteaser och hämmar syntesen av proteoglykaner och kollagener av kondrocyter. Regulatoriska cytokiner, i synnerhet IL-4 och -10, hämmar IL-1-produktion, ökar produktionen av IL-1-receptorantagonisten (IL-1RA) och minskar nivån av NO-syntas i kondrocyter. Således motverkar IL-4 IL-1 i tre riktningar: 1) minskar produktionen och förhindrar dess effekter, 2) ökar produktionen av den huvudsakliga "fångaren" IL-1RA och 3) minskar produktionen av den huvudsakliga sekundära "budbäraren" NO. Dessutom minskar IL-4 enzymatisk nedbrytning av vävnad. In vivo uppnås den optimala terapeutiska effekten med en kombination av IL-4 och IL-10. Anabola faktorer som TGF-β och IGF-1 stör egentligen inte produktionen eller verkan av IL-1, men uppvisar motsatt aktivitet, till exempel genom att stimulera syntesen av proteoglykaner och kollagen, undertrycka aktiviteten hos proteaser, och TGF-β hämmar också frisättningen av enzymer och stimulerar deras hämmare.

Proinflammatoriska cytokiner ansvarar för ökad syntes och uttryck av MMP i ledvävnader. De syntetiseras i synovialmembranet och diffunderar sedan in i ledbrosket genom synovialvätskan. Proinflammatoriska cytokiner aktiverar kondrocyter, som i sin tur också kan producera proinflammatoriska cytokiner. I leder som drabbats av artros spelas rollen som inflammationseffektor huvudsakligen av celler i synovialmembranet. Det är synovocyter av makrofagtyp som utsöndrar proteaser och inflammatoriska mediatorer. Bland dem är IL-f, TNF-α, IL-6, leukemihämmande faktor (LIF) och IL-17 mest "involverade" i patogenesen av artros.

Biologiskt aktiva substanser som stimulerar nedbrytningen av ledbrosk vid artros

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-a
• Kolonistimulerande faktorer: makrofager (monocyter) och granulocyt-makrofager
• Substans P
• PGE ₂
• Plasminogenaktivatorer (vävnads- och urokinastyper) och plasmin
• Metalloproteaser (kollagenaser, ellastaser, stromelysiner)
• Katepsiner A och B
• Trilsin
• Bakteriella lipopolysackarider
• Fosfolipas Ag

Litteraturdata indikerar att IL-1 och eventuellt TNF-a är de huvudsakliga mediatorerna av ledvävnadsförstörelse vid artros. Det är dock fortfarande okänt om de verkar oberoende av varandra eller om det finns en funktionell hierarki mellan dem. Djurmodeller av artros har visat att IL-1-blockad effektivt förhindrar ledbroskförstörelse, medan TNF-a-blockad endast leder till en minskning av inflammation i ledvävnader. Ökade koncentrationer av båda cytokinerna hittades i synovialmembranet, synovialvätskan och brosket hos patienter. I kondrocyter kan de öka syntesen av inte bara proteaser (främst MMP och AP), utan även mindre kollagener, såsom typ I och III, och minska syntesen av kollagener typ II och IX och proteoglykaner. Dessa cytokiner stimulerar också reaktiva syreradikaler och inflammatoriska mediatorer såsom PGE2 _. Resultatet av sådana makromolekylära förändringar i ledbrosk vid artros är ineffektiviteten hos reparativa processer, vilket leder till ytterligare nedbrytning av brosk.

De ovan nämnda proinflammatoriska cytokinerna modulerar processerna för MMP-suppression/aktivering vid artros. Till exempel kan obalansen mellan TIMP-1 och MMP-nivåer i brosk vid artros medieras av IL-1, eftersom en in vitro-studie visade att en ökning av IL-1 beta-koncentrationer leder till en minskning av TIMP-1-koncentrationer och en ökning av MMP-syntes av kondrocyter. AP-syntes moduleras också av IL-1 beta. In vitro-stimulering av ledbroskkondrocyter med IL-1 orsakar en dosberoende ökning av AP-syntes och en kraftig minskning av iAP-1-syntes. IL-1:s förmåga att minska iAP-1-syntes och stimulera AP-syntes är en potent mekanism för plasmingenerering och MMP-aktivering. Dessutom är plasmin inte bara ett enzym som aktiverar andra enzymer, det deltar också i processen för brosknedbrytning genom direkt proteolys.

IL-ip syntetiseras som en inaktiv prekursor med en massa på 31 kD (pre-IL-ip), och omvandlas sedan, efter klyvning av signalpeptiden, till ett aktivt cytokin med en massa på 17,5 kD. I ledvävnader, inklusive synovialmembranet, synovialvätskan och ledbrosket, finns IL-ip i aktiv form, och in vivo-studier har visat synovialmembranets förmåga att utsöndra detta cytokin vid artros. Vissa serinproteaser kan omvandla pre-IL-ip till dess bioaktiva form. Hos däggdjur hittades sådana egenskaper endast hos ett proteas, som tillhör familjen av cystein-aspartatspecifika enzymer och kallas IL-1β-konverterande enzym (ICF, eller caspase-1). Detta enzym kan specifikt omvandla pre-IL-ip till biologiskt aktivt "moget" IL-ip med en massa på 17,5 kD. ICF är ett 45 kD proenzym (p45) som är lokaliserat i cellmembranet. Efter proteolytisk klyvning av p45-proenzymet bildas två subenheter kända som p10 och p20, vilka kännetecknas av enzymatisk aktivitet.

TNF-α syntetiseras också som en membranbunden prekursor med en massa på 26 kDa; genom proteolytisk klyvning frigörs den från cellen som en aktiv löslig form med en massa på 17 kDa. Proteolytisk klyvning utförs av TNF-α-konverterande enzym (TNF-AC), som tillhör adamalizinfamiljen. AR Amin et al. (1997) fann ökat uttryck av TNF-AC mRNA i ledbrosket hos patienter med artros.

Biologisk aktivering av kondrocyter och synovocyter av IL-1 och TNF-a medieras genom bindning till specifika receptorer på cellytan - IL-R och TNF-R. Två typer av receptorer har identifierats för varje cytokin - IL-IP typ I och II och TNF-R typ I (p55) och II (p75). IL-1PI och p55 ansvarar för signalöverföring i ledvävnadsceller. IL-1R typ I har en något högre affinitet för IL-1beta än för IL-1a; IL-1R typ II har däremot en högre affinitet för IL-1a än för IL-ip. Det är fortfarande oklart om IL-IP typ II kan mediera IL-1-signaler eller om det endast tjänar till kompetitiv hämning av associationen mellan IL-1 och IL-1R typ I. Kondroitider och synoviala fibroblaster hos patienter med artros innehåller stora mängder IL-1PI och p55, vilket i sin tur förklarar dessa cellers höga känslighet för stimulering av motsvarande cytokiner. Denna process leder till både ökad utsöndring av proteolytiska enzymer och förstörelse av ledbrosk.

IL-6:s inblandning i den patologiska processen vid artros kan inte uteslutas. Detta antagande baseras på följande observationer:

• IL-6 ökar antalet inflammatoriska celler i synovialmembranet,
• IL-6 stimulerar kondrocytproliferation,
• IL-6 förstärker effekterna av IL-1 i att öka MMP-syntesen och hämma proteoglykansyntesen.

IL-6 kan emellertid inducera produktionen av TIMP, men påverkar inte produktionen av MMP, så man tror att detta cytokin är involverat i processen att hämma den proteolytiska nedbrytningen av ledbrosk, vilket utförs via en återkopplingsmekanism.

En annan medlem av IL-6-familjen är LIF, ett cytokin som produceras av kondrocyter erhållna från patienter med artros som svar på stimulering av de proinflammatoriska cytokinerna IL-1p och TNF-a. LIF stimulerar resorption av broskproteoglykaner, såväl som MMP-syntes och NO-produktion. Denna cytokins roll vid artros har inte klarlagts helt.

IL-17 är en 20-30 kD homodimer med en IL-1-liknande effekt, men mycket mindre uttalad. IL-17 stimulerar syntesen och frisättningen av ett antal proinflammatoriska cytokiner, inklusive IL-1p, TNF-α, IL-6 och MMP i målceller, såsom humana makrofager. Dessutom stimulerar IL-17 NO-produktion av kondrocyter. Liksom LIF har IL-17:s roll i patogenesen av artros studerats dåligt.

Den oorganiska fria radikalen NO spelar en viktig roll i nedbrytningen av ledbrosk vid artros. Kondrocyter isolerade från patienter med artros producerar högre mängder NO både spontant och efter stimulering med proinflammatoriska cytokiner jämfört med normala celler. Hög NO-halt har hittats i synovialvätska och serum från patienter med artros - detta är ett resultat av ökat uttryck och syntes av inducerat NO-syntas (hNOC), enzymet som ansvarar för NO-produktion. Nyligen klonades DNA från kondrocytspecifik hNOC, och enzymets aminosyrasekvens bestämdes. Aminosyrasekvensen indikerar 50 % identitet och 70 % likhet med hNOC specifik för endotel och nervvävnad.

NO hämmar syntesen av makromolekyler i ledbroskets ECM och stimulerar syntesen av MMP. Dessutom åtföljs en ökning av NO-produktionen av en minskning av syntesen av IL-IP-antagonisten (IL-1RA) av kondrocyter. Således leder en ökning av nivån av IL-1 och en minskning av IL-1RA till hyperstimulering av NO i kondrocyter, vilket i sin tur leder till ökad nedbrytning av broskmatrixen. Det finns rapporter om den terapeutiska effekten in vivo av en selektiv hNOC-hämmare på utvecklingen av experimentell artros.

Naturliga cytokinhämmare kan direkt förhindra cytokiner från att binda till cellmembranreceptorer, vilket minskar deras proinflammatoriska aktivitet. Naturliga cytokinhämmare kan delas in i tre klasser baserat på deras verkningsmekanism.

Den första klassen av hämmare innefattar receptorantagonister som förhindrar ligandens bindning till dess receptor genom att konkurrera om bindningsstället. Hittills har en sådan hämmare endast hittats för IL-1 - detta är den ovan nämnda kompetitiva hämmaren av IL-1/ILIP-systemet IL-1 PA. IL-1 PA blockerar många effekter som observeras i ledvävnader vid artros, inklusive syntesen av prostaglandiner av synovialceller, produktionen av kollagenas av kondrocyter och nedbrytningen av benmärgen i ledbrosk.

IL-1RA finns i olika former - en löslig (rIL-1RA) och två intercellulära (μIL-lPAI och μIL-1RAP). Affiniteten hos den lösliga formen av IL-1RA är 5 gånger högre än hos de intercellulära formerna. Trots intensiv vetenskaplig forskning är den senares funktion fortfarande okänd. In vitro-experiment har visat att hämning av IL-1beta-aktivitet kräver en koncentration av IL-1RA som är 10-100 gånger högre än normalt, medan in vivo-förhållanden kräver en tusenfaldig ökning av IL-1RA-koncentrationen. Detta faktum kan delvis förklara den relativa bristen på IL-1RA och överskottet av IL-1 i synovium hos patienter med artros.

Den andra klassen av naturliga cytokinhämmare är lösliga cytokinreceptorer. Exempel på sådana hämmare hos människor som är relaterade till patogenesen av artros är rIL-1R och pp55. Lösliga cytokinreceptorer är förkortade former av normala receptorer; när de binder till cytokiner förhindrar de deras bindning till membranassocierade receptorer i målcellerna, vilket verkar genom kompetitiv antagonism.

Den huvudsakliga prekursorn till lösliga receptorer är membranbunden IL-1RP. Affiniteten hos rIL-IP för IL-1 och IL-1RA är olika. Således har rIL-1RN en högre affinitet för IL-1β än för IL-1RA, och rIL-1PI uppvisar en högre affinitet för IL-1RA än för IL-ip.

Det finns också två typer av lösliga receptorer för TNF - pp55 och pp75, liksom lösliga IL-1-receptorer bildas de genom "avsöndring". In vivo finns båda receptorerna i vävnaderna i drabbade leder. Rollen av lösliga TNF-receptorer i patogenesen av artros är omdebatterad. Det antas att de i låga koncentrationer stabiliserar den tredimensionella strukturen hos TNF och ökar halveringstiden för det bioaktiva cytokinet, medan höga koncentrationer av pp55 och pp75 kan minska TNF-aktiviteten genom kompetitiv antagonism. Förmodligen kan pp75 fungera som en TNF-bärare, vilket underlättar dess bindning till den membranassocierade receptorn.

Den tredje klassen av naturliga cytokinhämmare representeras av en grupp antiinflammatoriska cytokiner, vilka inkluderar TGF-beta, IL-4, IL-10 och IL-13. Antiinflammatoriska cytokiner minskar produktionen av proinflammatoriska och vissa proteaser, och stimulerar produktionen av IL-1RA och TIMP.