Diagnos av herpes

Diagnos av herpes baseras på klassisk virusisolering på känsliga cellkulturer, immunofluorescens- och serologiska metoder, kolposkopisk undersökning och användning av moderna molekylärbiologiska metoder (PCR, punkthybridisering), vilket möjliggör diagnos av hela gruppen av herpesvirus, inklusive typerna HHV-6 och HHV-7.

Laboratoriediagnostiska metoder för herpesinfektion

De viktigaste metoderna som syftar till att isolera HSV eller detektera viruspartiklar och/eller deras komponenter	Hjälpmetoder som syftar till att detektera antikroppar mot HSV i biologiska vätskor i människokroppen
Isolering av HSV i känsliga cell- och djurkulturer Direkt och immun elektronmikroskopi Direkta och indirekta varianter av IPA IFA Molekylärbiologiska metoder Latexagglutinationsreaktion	Neutraliseringsreaktion RSC Bestämning av antikroppar mot icke-strukturella proteiner av HSV-1,2

Det visades att hos 76 % av patienterna orsakas genital herpes (GH) av HSV-2, och hos 24 % av HSV-1. Dessutom förekom GH som en monoinfektion endast hos 22 % av patienterna, och i 78 % av fallen upptäcktes mikrobiella samband. Hos 46 % av individerna upptäcktes parasitocenos orsakad av två patogener, inklusive klamydia i 40 % av fallen. Gardnerella, trichomonas och gonokocker upptäcktes mer sällan i utstryk.

Hos 27 % av patienterna representerades parasitocenosen av tre patogener, hos 5,2 % av fyra patogener. Dessutom noterades oftast en kombination av klamydia med gardnerella och Candida-svampar. Dessa data styrker behovet av en grundlig bakteriologisk undersökning av patienter med GH för att identifiera kombinationer av patogener, samt en djupgående studie av patogenesen vid blandinfektioner i urogenitalkanalen, vilket möjliggör differentierad komplex behandling av herpesinfektion.

Material som studerats för isolering av HSV beroende på lokaliseringen av herpeslesioner

Lokalisering av lesioner	Vesikelinnehåll	Cellskrapning				CSF	Bronkial aspirat	Biopsi	Blod
		1	2	3	4
Läder	+								+
Ögon			+						+
Genitalier				+					+
Anus	+				+				+
Mun	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Lungor		+					+		+
Lever								+	+
Medfödd herpes	+	+	+				+		+

Metoder för laboratoriediagnostik av cytomegalovirusinfektion

Metoder	Tid som krävs för att få resultat	Anteckningar
VIROLOGISK
Elektronmikroskopi	3 timmar	Inte särskilt lättillgängligt
Virusisolering i cellkultur (VCI)	4–20 dagar	Standard, Långsam
Immunofluorescensfärgning av tidig AG med användning av monoklonala antikroppar	6 timmar	Mindre specifik
CYTOLOGISK	2–3 timmar	Mindre specifik
SEROLOGISK
RSC	2 dagar	Standard
RGA	1 dag	Arbetsintensiv
REV	6 timmar	Enkel, specifik
NRIF	6 timmar	Svår
RIMP	6 timmar	Svår
ELISA (IgM, DO)	6 timmar	Snabbt, enkelt
Immunoblot	6 timmar	Dyr
MOLEKYLÄKBIOLOGISK
MG	5–7 dagar	Dyrt, arbetsintensivt
PCR	3 timmar	Dyr

Metoder för diagnostik av herpes zostervirus

Diagnostiska metoder	Laboratorietekniker
INDIREKT
Urval	Vävnadskultur, kycklingembryon, försöksdjur, samodling med permissiva celler eller hjälparvirus
Identifiering av isolat	Neutralisationsreaktion, RSC, IF, PIEF, reaktion av isolater, utfällning, agglutination, IF
DIREKT
Cytologi	Utstryk: färgimmunofluorescens
Histologi	Cellens patomorfologi
Strukturera	Embryonal mikroskopi, immunoelektronmikroskopi
Bestämning av antigener	IF, PIEF, RIM, IFA
Bestämning av lokal antikroppsproduktion	IgM, IgG, IgA: ELISA, RIA
Molekylärbiologiska metoder	Molekylär hybridisering, PCR

Laboratoriediagnostik av infektion orsakad av herpes zostervirus

Diagnostiska problem	Metoder	Förväntade resultat
Akut primärinfektion	1	Detektion på 2 timmar
	2	Antikroppsnivåerna stiger långsamt
	3	Förekommer 3 dagar efter infektion
Akut reaktiverad infektion	1	Detektion av UUU efter 2 timmar
	2	Antikroppsnivåerna stiger långsamt
	4	Förekommer 4 dagar efter att utslaget uppträder

1. bestämning av VEGF-vesiklar i vätska;
2. serologi: CSC, ELISA, inriktad på detektion
3. serologi: ELISA som syftar till att detektera IgM;
4. serologi: ELISA som syftar till att detektera IgA, IgM.

Metoder för att indikera immunsvaret mot herpes zostervirusinfektion

Närma sig	Metod
Detektion av en ökning av antikroppstiter i det andra serumet	RSK, RTGA, RPGA, IF-neutraliseringsreaktion, RIM, ELISA
Detektion av Ig G- och Ig A-klassspecifika antikroppar i det första serumprovet	ELISA, IF, RIM, latexagglutination

Tolkning av resultaten av serologisk undersökning av patienters serum för herpesvirusinfektioner (ELISA)

Namn på infektion/markör	Genomsnittliga tröskelvärden för infektioner
	Resultat av analysen	Tolkning
Cytomegali Anti-CMV IgG (1–20 U/ml) Anti-CMV IgM (100–300 %)	Positiv 1–6 Positiv 6–10 Positiv >10 Negativ Positiv 100–300 Negativ <90 Tveksam 90–100	Remission Försämring av sjukdomen Akut fas av sjukdomen Ingen infektion (sjukdom) Akut fas av sjukdomen Upprepa analysen om 2–3 veckor
Herpes simplex 1,2 serotyper Anti-HSV 1/2 totalt (100–900 %)	Positiv 100–400 Positiv 400–800 Positiv >800 Negativ <100	Remission Försämring av sjukdomen Akut fas av sjukdomen Ingen infektion (sjukdom)

Tabellen presenterar de viktigaste metoderna för laboratoriediagnostik av herpesvirusinfektioner, samt rekommenderade biologiska material som undersöks vid isolering av HSV, med hänsyn till lokaliseringen av herpesskador.

Tillförlitlig isolering av herpes simplex- och CMV-virus genom infektion av känsliga cellkulturer. Således isolerades HSV i 23 fall (88,4%) på en känslig Vero-cellkultur under virologisk undersökning av 26 patienter under återfallsperioden. Infekterade kulturer uppvisade en bild av cytopatisk verkan typisk för HSV - bildandet av flerkärniga jätteceller eller en ansamling av rundade och förstorade celler i form av kluster. I 52,1% av fallen kunde fokus för cytopatisk verkan av viruset detekteras redan 16–24 timmar efter infektion. Vid 48–72 timmars inkubation av infekterade kulturer ökade andelen material som orsakar specifik cellförstörelse till 87%. Och endast i 13% av fallen detekterades positiva resultat 96 timmar efter infektion eller mer eller under upprepad passage.

Metoder för laboratoriediagnostik av generaliserad herpesinfektion

De viktigaste metoderna som syftar till att detektera (isolera) herpesvirus, deras partiklar och deras komponenter	Hjälpmetoder som syftar till att detektera antikroppar mot herpesvirus i biologiska vätskor, detektera enzymatiska förändringar i blodserum
Isolering av herpesvirus på känsliga cell- och djurkulturer Direkt och immun elektronmikroskopi Direkta och indirekta varianter av immunoperoxidasmetoden Direkta och indirekta varianter av fluorescerande antikroppsmetod Varianter av fastfas-enzymimmunanalys Varianter av molekylär (DNA-DNA) hybridiseringsmetod Polymeraskedjereaktion Latexagglutinationsreaktion	Neutraliseringstest Komplementfixeringstest Latexagglutinationstest Indirekt version av fluorescerande antikroppsmetoden Indirekt version av immunoperoxidasmetoden Varianter av fastfasenzymimmunanalys Immunblottingmetod Radiell komplementfixeringsmetod Bestämning av alanin- och aspartataminotransferasnivåer

Serologiska metoder används för att diagnostisera infektiös mononukleos (en infektion orsakad av EBV). Paul-Bunnell-reaktionen med röda blodkroppar från bagge, en diagnostisk titer på 1:28 eller högre i ett enda blodserumtest, eller en 4-faldig ökning av antikroppar vid undersökning av parade serum. Hoff-Bauer-reaktionen med en 4% suspension av formaliserade röda blodkroppar från häst används. Resultatet beaktas efter 2 minuter; vid infektiös mononukleos är reaktionen mycket specifik.

För närvarande utvecklas en enzymimmunoanalysmetod (EIA) för att diagnostisera infektiös mononukleos. I detta fall bestäms IgG- och IgM-antikroppar i patientens serum genom inkubation med lymfoblaster infekterade med EBV, följt av behandling med fluorescerande antikroppar. Under sjukdomens akuta period bestäms antikroppar mot det virala kapsidantigenet i en titer av 1:160 och högre.

Vid användning av ett antal importerade kommersiella testsystem kan ELISA detektera: antikroppar mot EBV-höljesantikroppar, antikroppar mot EBV:s tidiga antigen, totala antikroppar mot EBV:s tidiga antigen, bestämda i sjukdomens akuta fas både i kärnan och i cellcytoplasman, och begränsade antikroppar mot tidig EBV, bestämda i sjukdomens akuta fas både i kärnan och i cellcytoplasman, begränsade antikroppar mot EBV:s tidiga antigen, bestämda endast vid sjukdomens höjdpunkt i cellcytoplasman, och antikroppar mot EBV:s nukleära antigen. Användningen av dessa testsystem möjliggör differentialdiagnostik av ett antal sjukdomar associerade med EBV.

Efter ett positivt ELISA-test som avslöjar antikroppar mot EBV utförs en bekräftande immunoblottingreaktion, som bestämmer närvaron av antikroppar mot enskilda EBV-markörproteiner (p-proteiner): p23, p54, p72 (närvaron av detta protein indikerar möjligheten till EBV-reproduktion), p 138. Ovanstående laboratoriemetoder används också för att övervaka behandlingens effektivitet.

Känsligheten hos virologiska metoder är 85–100 %, specificiteten är 100 % och studietiden är 2–5 dagar. Direkt immunofluorescensmetod (DIF) med polyklonala eller monoklonala antikroppar mot HSV-1 och HSV-2 används ofta i praktiskt arbete. DIF-metoden är ganska lätt reproducerbar i ett vanligt kliniskt laboratorium, är inte dyr, känsligheten är över 80 % och specificiteten är 90–95 %. Immunofluorescensmikroskopi avslöjade förekomsten av cytoplasmatiska inneslutningar, morfologiska egenskaper och andelen infekterade celler i utstryk från urinröret, livmoderhalskanalen, livmoderhalsen och ändtarmen.

PIF-metoden ger en uppfattning om cellernas morfologiska egenskaper och förändringar i lokaliseringen av HSV-antigener. Förutom direkta tecken på cellskador orsakade av herpesvirus (detektering av specifik luminescens) finns det indirekta tecken på herpesinfektion enligt PIF-data:

• aggregering av kärnämne, lossning av karyolemma;
• närvaron av så kallade "hål"-kärnor, när endast ett karyolemma återstår från cellkärnan;
• närvaron av intranukleära inneslutningar - Cowdry-kroppar.

Vid utförande av PIF får läkaren inte bara en kvalitativ utan även en kvantitativ bedömning av de infekterade cellernas tillstånd, vilket vi använde för att bedöma effektiviteten av den antivirala behandlingen med aciklovir (AC). Således undersöktes 80 patienter med enkel genital herpes (GH) med hjälp av PIF-metoden dynamiskt. Det visades att om 88 % av patienterna före behandling med aciklovir hade en hög andel infekterade celler (50–75 % och högre) i utstryk, så upptäcktes friska celler i utstryk hos 44 % av patienterna efter en aciklovirkur, i 31 % av fallen noterades enskilda infekterade celler och hos 25 % av patienterna fanns upp till 10 % infekterade celler.

Innehåll av infekterade celler i utstryk (PIF-reaktion) hos patienter med genital herpes behandlade med aciklovir

Sjukdomsperioder	Procentuellt innehåll i utstryk
	Infekterade celler					Normala celler
	Mer än 75 %	50–75 %	40–50 %	10 %	Enskilda celler i synfältet
Återfall (före behandling)	25 %	63 %	12 %
	(20)	(50)	(10)
Remission (efter behandling)				25 %	31 %	44 %
				(20)	(25)	(35)

Med hjälp av PIF och dot-hybridiseringsmetoden under många år har det noterats att resultaten av studien överensstämmer i nästan 100 % av fallen. Det bör noteras att för att öka tillförlitligheten i diagnosen herpes, särskilt i fall av subkliniska och lågmanifesterande former av herpes, rekommenderas det att använda 2-3 metoder för laboratoriediagnostik i arbetet, särskilt vid undersökning av gravida kvinnor, kvinnor med en ogynnsam obstetrisk historia och personer med en ospecificerad gynekologisk diagnos.

Vid PCR-diagnostik av virus- och bakterieinfektioner i urogenitalkanalen är det därför nödvändigt att utvärdera de positiva resultaten med hänsyn till anamnesen och förekomsten (eller frånvaron) av specifika kliniska symtom på sjukdomen. Om klamydia detekteras med PCR finns det i detta fall en hög sannolikhet för infektion och behandlingsfrågorna kan lösas därefter. Vid detektion av mykoplasmer (ureaplasmer), vilka är opportunistiska mikroorganismer, krävs ytterligare kulturstudier för att bekräfta diagnosen, dvs. sådd av material från patienten på känsliga cellkulturer. Endast om positiva resultat erhålls vid kulturanalysen kan vi tala om laboratoriebekräftelse av diagnosen mykoplasmos. Samma metod gör det möjligt att, vid behov, bestämma känsligheten hos de isolerade mykoplasmerna för ofta använda doseringsformer (antibiotika, fluorokinoloner, etc.).

Samtidig infektion med flera virus av familjen Herpesviridae är möjlig. Vi upptäckte ofta infektion hos en patient med HSV-1-, HSV-2- och CMV-virus. Patienter med kliniska och laboratoriemässiga manifestationer av sekundär IDS (onkohematologiska, onkologiska, HIV-infekterade patienter) var signifikant oftare infekterade med flera herpesvirus. Det har således visats att kliniska och immunologiska störningar som progredierar vid HIV-infektion åtföljs av en ökning av antalet herpesvirus som detekteras med molekylär hybridiseringsmetod. I detta fall kan den mest prognostiskt signifikanta betraktas som den komplexa samtidiga detektionen av HSV-1-, CMV- och HHV-6-typ-DNA.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]