Corynebakterium

Difteri är en akut infektionssjukdom som främst drabbar barn och som manifesterar sig som djup förgiftning av kroppen med difteritoxin och karakteristisk fibrinös inflammation vid patogenens lokaliseringsplats. Sjukdomens namn kommer från det grekiska ordet difteri - hud, hinna, eftersom en tät, gråvit hinna bildas vid patogenens reproduktionsplats.

Det orsakande medlet för difteri - Corynebacterium diphtheriae - upptäcktes först 1883 av E. Klebs i filmsnitt och erhölls i renkultur 1884 av F. Leffler. År 1888 upptäckte E. Roux och A. Yersin dess förmåga att producera ett exotoxin, vilket spelar en viktig roll i etiologin och patogenesen av difteri. Produktionen av antitoxiskt serum av E. Behring 1892 och dess användning sedan 1894 för behandling av difteri gjorde det möjligt att avsevärt minska dödligheten. En framgångsrik attack mot denna sjukdom började efter 1923 i samband med utvecklingen av en metod för att erhålla difteri-anatoxin av G. Raion.

Det orsakande medlet för difteri tillhör släktet Corynebacterium (klass Actinobacteria). Morfologiskt kännetecknas det av att cellerna är klubbformade och förtjockade i ändarna (grekiska coryne - klubba), bildar grenar, särskilt i gamla kulturer, och innehåller granulära inneslutningar.

Släktet Corynebacterium omfattar ett stort antal arter, som är indelade i tre grupper.

• Corynebakterier är parasiter hos människor och djur och patogena för dem.
• Corynebakterier som är patogena för växter.
• Icke-patogena korynebakterier. Många arter av korynebakterier lever normalt i huden, slemhinnorna i svalget, nasofarynx, ögonen, luftvägarna, urinröret och könsorganen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfologi av korynebakterier

C. diphtheriae är raka eller lätt böjda icke-rörliga stavar, 1,0-8,0 μm långa och 0,3-0,8 μm i diameter; de bildar inte sporer eller kapslar. De har ofta svullnader i ena eller båda ändarna och innehåller ofta metakromatiska granuler - volutinkorn (polymetafosfater), som får en blåaktig-lila färg när de färgas med metylenblått. En speciell Neisser-färgningsmetod har föreslagits för deras detektion. I detta fall färgas stavarna halmgula, och volutinkornen är mörkbruna och är vanligtvis belägna vid polerna. Corynebacterium diphtheriae färgas väl med anilinfärgämnen, är grampositiv, men i gamla kulturer blir den ofta missfärgad och har en negativ färgning enligt Gram. Den kännetecknas av uttalad polymorfism, särskilt i gamla kulturer och under påverkan av antibiotika. G+C-halten i DNA är cirka 60 mol%.

Biokemiska egenskaper hos korynebakterier

Difteribacillen är en aerob eller fakultativ anaerob bakterie, den optimala temperaturen för tillväxt är 35-37 °C (tillväxtgränser är 15-40 °C), det optimala pH-värdet är 7,6-7,8. Den är inte särskilt krävande för näringsmedier, men växer bättre på medier som innehåller serum eller blod. Ostar av typen Roux eller Loeffler är selektiva för difteribakterier , tillväxt på dem uppträder efter 8-12 timmar i form av konvexa kolonier stora som ett knappnålshuvud, gråvita eller gulaktigt krämfärgade. Deras yta är slät eller något kornig, i periferin är kolonierna något mer transparenta än i mitten. Kolonierna smälter inte samman, vilket resulterar i att kulturen får utseendet av shagreenläder. På buljongen manifesterar sig tillväxten som jämn grumlighet, eller så förblir buljongen transparent, och en fin film bildas på dess yta, som gradvis tjocknar, smular sönder och lägger sig i flingor till botten.

Ett kännetecken för difteribakterier är deras goda tillväxt på blod- och serummedier som innehåller sådana koncentrationer av kaliumtellurit att de hämmar tillväxten av andra typer av bakterier. Detta beror på att C. diphtheriae reducerar kaliumtellurit till metalliskt tellurium, vilket, när det deponeras i mikrobiella celler, ger kolonierna en karakteristisk mörkgrå eller svart färg. Användningen av sådana medier ökar andelen difteribakterier som sår.

Corynebacterium diphtheriae fermenterar glukos, maltos och galaktos med bildning av syra utan gas, men fermenterar (som regel) inte sackaros, har cystinas, har inte ureas och bildar inte indol. Enligt dessa egenskaper skiljer de sig från de koryneformade bakterier (difteroider) som oftast finns på ögats slemhinna (Corynebacterium xerosus) och nasofarynx (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) och från andra difteroider.

I naturen finns det tre huvudvarianter (biotyper) av difteribacillen: gravis, intermedin och mitis. De skiljer sig åt i morfologiska, kulturella, biokemiska och andra egenskaper.

Indelningen av difteribakterier i biotyper gjordes med hänsyn till de former av difteri hos patienter från vilka de isoleras med störst frekvens. Gravis-typen isoleras oftast från patienter med en allvarlig form av difteri och orsakar grupputbrott. Mitis-typen orsakar mildare och sporadiska fall av sjukdomen, och intermedius-typen intar en mellanliggande position mellan dem. Corynebacterium belfanti, som tidigare tillskrivits mitis-biotypen, isoleras som en oberoende, fjärde, biotyp. Dess huvudsakliga skillnad från gravis- och mitis-biotyperna är förmågan att reducera nitrater till nitriter. Corynebacterium belfanti-stammar har uttalade vidhäftningsegenskaper, och både toxigena och icke-toxigena varianter finns bland dem.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Antigenisk struktur hos korynebakterier

Corynebacterium är mycket heterogen och mosaikartad. Flera dussin somatiska antigener har hittats i alla tre typer av difterapatogener, enligt vilka de delas in i serotyper. I Ryssland har en serologisk klassificering antagits, enligt vilken 11 serotyper av difteribakterier urskiljs, varav 7 är huvudserotyper (1-7) och 4 är ytterligare, sällan förekommande serotyper (8-11). Sex serotyper (1, 2, 3, 4, 5, 7) tillhör gravis-typen, och fem (6,8,9,10,11) tillhör mitis-typen. En nackdel med serotypningsmetoden är att många stammar, särskilt icke-toxigena, har spontan agglutination eller polyagglutinabilitet.

[ 11 ]

Fagtypning av Corynebacterium diphtheriae

Olika fagtypningsscheman har föreslagits för att differentiera difteribakterier. Enligt MD Krylovas schema, med hjälp av en uppsättning av 9 fager (A, B, C, D, F, G, H, I, K), är det möjligt att typa de flesta toxigena och icke-toxigena stammar av gravis-typen. Med hänsyn till känslighet för de specificerade fagerna, såväl som kulturella, antigena egenskaper och förmågan att syntetisera coryciner (bakteriedödande proteiner), identifierade MD Krylova 3 oberoende grupper av corynebakterier av gravis-typen (I-III). Var och en av dem innehåller undergrupper av toxigena och deras icke-toxigena analoger av difterapatogener.

Corynebacterium-resistens

Corynebacterium diphtheriae uppvisar hög resistens mot låga temperaturer, men dör snabbt vid höga temperaturer: vid 60 °C - inom 15-20 minuter, vid kokning - efter 2-3 minuter. Alla desinfektionsmedel (lysol, fenol, kloramin, etc.) i den vanligtvis använda koncentrationen förstör den på 5-10 minuter. Difteribakterien tolererar dock torkning väl och kan förbli livskraftig under lång tid i torkat slem, saliv och dammpartiklar. I en fin aerosol förblir difteribakterier livskraftiga i 24-48 timmar.

Patogenicitetsfaktorer för corynebakterier

Corynebacterium diphtheriaes patogenicitet bestäms av närvaron av ett antal faktorer.

Faktorer för vidhäftning, kolonisering och invasion

De strukturer som ansvarar för vidhäftning har inte identifierats, men utan dem skulle difteribacillen inte kunna kolonisera celler. Deras roll utförs av vissa komponenter i patogenens cellvägg. Patogenens invasiva egenskaper är associerade med hyaluronidas, neuraminidas och proteas.

En toxisk glykolipid som finns i patogenens cellvägg. Det är en 6,6'-diester av trehalos som innehåller korynemykolsyra (C32H64O3) och korynemykolsyra (C32H62O3) i ekvimolära förhållanden (trehalos-6,6'-dikorynemikolat). Glykolipiden har en destruktiv effekt på vävnadsceller vid platsen för patogenens reproduktion.

Exotoxin, som avgör patogenens patogenicitet och sjukdomens patogenes. Icke-toxigena varianter av C. diphtheriae orsakar inte difteri.

Exotoxinet syntetiseras som en inaktiv prekursor - en enda polypeptidkedja med en molekylvikt på 61 kD. Det aktiveras av själva bakterieproteaset, som delar polypeptiden i två peptider sammanlänkade med disulfidbindningar: A (mw 21 kD) och B (mw 39 kD). Peptid B utför en acceptorfunktion - den känner igen receptorn, binder till den och bildar en intramembrankanal genom vilken peptid A penetrerar cellen och implementerar toxinets biologiska aktivitet. Peptid A är ett ADP-ribosyltransferasenzym, vilket säkerställer överföringen av adenosindifosfatribos från NAD till en av aminosyraresterna (histidin) i proteinförlängningsfaktorn EF-2. Som ett resultat av modifieringen förlorar EF-2 sin aktivitet, och detta leder till att proteinsyntesen av ribosomer undertrycks i translokationsstadiet. Toxinet syntetiseras endast av de C. diphtheriae som bär generna för den måttligt omvandlande profagen i sin kromosom. Operonet som kodar för syntesen av toxinet är monocistroniskt, det består av 1,9 tusen nukleotidpar och har en toxP-promotor och 3 regioner: toxS, toxA och toxB. ToxS-regionen kodar för 25 aminosyrarester av signalpeptiden (den säkerställer frisättningen av toxinet genom membranet in i bakteriecellens periplasmatiska utrymme), toxA - 193 aminosyrarester av peptid A och toxB - 342 aminosyrarester av peptid B av toxinet. Förlust av profagen av cellen eller mutationer i toxoperonet gör cellen något toxigen. Tvärtom förvandlar lysogenisering av icke-toxigena C. diphtheriae av den konverterande fagen dem till toxigena bakterier. Detta har bevisats entydigt: difteribakteriernas toxigena egenskaper beror på deras lysogenisering av toxkonverterande korynefager. Korynefager integreras i kromosomen hos korynebakterier med hjälp av mekanismen för platsspecifik rekombination, och stammar av difteribakterier kan innehålla 2 rekombinationsställen (attB) i sina kromosomer, och korynefager integreras i var och en av dem med samma frekvens.

Genetisk analys av ett antal icke-toxigena stammar av difteribakterier, utförd med hjälp av märkta DNA-prober som bär fragment av korynefagens toxoperon, visade att deras kromosomer innehåller DNA-sekvenser homologa med korynefagens toxoperon, men de kodar antingen för inaktiva polypeptider eller befinner sig i ett "tyst" tillstånd, dvs. inaktiva. I detta avseende uppstår en mycket viktig epidemiologisk fråga: kan icke-toxigena difteribakterier omvandlas till toxigena under naturliga förhållanden (i människokroppen), liknande vad som händer in vitro? Möjligheten till en sådan omvandling av icke-toxigena kulturer av korynefakter till toxigena med hjälp av fagomvandling demonstrerades i experiment på marsvin, kycklingembryon och vita möss. Huruvida detta sker under den naturliga epidemiprocessen (och i så fall hur ofta) har dock ännu inte fastställts.

På grund av att difteritoxin i patienters kropp har en selektiv och specifik effekt på vissa system (främst påverkas det sympatiska binjuresystemet, hjärtat, blodkärlen och perifera nerver) är det uppenbart att det inte bara hämmar proteinbiosyntesen i celler, utan också orsakar andra störningar i deras ämnesomsättning.

Följande metoder kan användas för att detektera toxiciteten hos difteribakterier:

• Biologiska djurförsök. Intradermal infektion av marsvin med ett filtrat från en buljongkultur av difteribakterier orsakar nekros vid injektionsstället. En minimal dödlig dos toxin (20–30 ng) dödar ett marsvin som väger 250 g vid subkutan injektion på 4–5:e dagen. Den mest karakteristiska manifestationen av toxins verkan är skador på binjurarna, som är förstorade och kraftigt hyperemiska.
• Infektion av kycklingembryon. Difteritoxin orsakar deras död.
• Infektion av cellkulturer. Difteritoxin orsakar en tydlig cytopatisk effekt.
• En fastfas-enzymlänkad immunosorbentanalys med peroxidasmärkta antitoxiner.
• Användning av en DNA-sond för direkt detektion av toxoperonen i kromosomen hos difteribakterier.

Den enklaste och vanligaste metoden för att bestämma toxiciteten hos difteribakterier är dock serologisk - gelfällningsmetoden. Dess kärna är följande. En remsa sterilt filterpapper som mäter 1,5 x 8 cm fuktas med antitoxiskt antidifteri-serum innehållande 500 AE i 1 ml och appliceras på ytan av näringsmediet i en petriskål. Skålen torkas i en termostat i 15-20 minuter. Testkulturerna sås med plack på båda sidor av pappret. Flera stammar sås på en skål, varav en, uppenbarligen toxisk, fungerar som kontroll. Plattorna med kulturerna inkuberas vid 37 °C, resultaten beaktas efter 24-48 timmar. På grund av motdiffusionen av antitoxin och toxin i gelen bildas en tydlig utfällningslinje vid platsen för deras interaktion, som övergår i utfällningslinjen för den toxigena kontrollstammen. Ospecifika utfällningsband (de bildas om, utöver antitoxinet, andra antimikrobiella antikroppar finns i små mängder i serumet) uppträder sent, uttrycks svagt och smälter aldrig samman med utfällningsbandet hos kontrollstammen.

Postinfektiös immunitet

Starka, ihållande, praktiskt taget livslånga, upprepade fall av sjukdomen observeras sällan - hos 5-7% av dem som har haft sjukdomen. Immuniteten är huvudsakligen antitoxisk till sin natur, antimikrobiella antikroppar är av mindre betydelse.

Schick-testet användes tidigare flitigt för att bedöma nivån av anti-difteriimmunitet. För detta ändamål injicerades 1/40 av marsvinstoxinet i en volym av 0,2 ml intradermalt i barn. I avsaknad av antitoxisk immunitet uppträder rodnad och svullnad med en diameter på mer än 1 cm på injektionsstället efter 24–48 timmar. En sådan positiv Schick-reaktion indikerar antingen en fullständig avsaknad av antitoxin eller att dess innehåll är mindre än 0,001 AE/ml blod. En negativ Schick-reaktion observeras när antitoxinhalten i blodet är högre än 0,03 AE/ml. Om antitoxinhalten är lägre än 0,03 AE/ml men högre än 0,001 AE/ml kan Schick-reaktionen vara antingen positiv eller ibland negativ. Dessutom har själva toxinet en uttalad allergiframkallande egenskap. För att bestämma nivån av anti-difteriimmunitet (kvantitativt innehåll av antitoxin) är det därför bättre att använda RPGA med en erytrocytdiagnostik sensibiliserad med difteritoxoid.

Epidemiologi för difteri

Den enda smittkällan är en person - en sjuk person, en tillfrisknande person eller en frisk bärare av bakterien. Infektion sker genom luftburna droppar, luftburet damm och genom olika föremål som används av sjuka eller friska bärare: tallrikar, böcker, linne, leksaker etc. Vid kontaminering av livsmedelsprodukter (mjölk, krämer etc.) är infektion möjlig via matsmältningsvägen. Den mest massiva utsöndringen av patogenen sker i den akuta formen av sjukdomen. Personer med latenta, atypiska former av sjukdomen är dock av största epidemiologiska betydelse, eftersom de ofta inte läggs in på sjukhus och inte upptäcks omedelbart. En patient med difteri är smittsam under hela sjukdomsperioden och en del av återhämtningsperioden. Den genomsnittliga tiden för bakteriebärande hos tillfrisknande personer varierar från 2 till 7 veckor, men kan vara upp till 3 månader.

Friska bärare spelar en särskild roll i difteriepidemiologin. Vid sporadisk sjuklighet är de de huvudsakliga distributörerna av difteri och bidrar till att bevara patogenen i naturen. Den genomsnittliga bärartiden för toxigena stammar är något kortare (cirka 2 månader) än för icke-toxigena (cirka 2-3 månader).

Orsaken till bildandet av frisk bärare av toxigena och icke-toxigene difteribakterier har inte helt klarlagts, eftersom även en hög nivå av antitoxisk immunitet inte alltid säkerställer fullständig befrielse av kroppen från patogenen. Kanske har nivån av antibakteriell immunitet en viss betydelse. Av primär epidemiologisk betydelse är bäraren av toxigena stammar av difteribakterier.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Symtom på difteri

Människor i alla åldrar är mottagliga för difteri. Patogenen kan penetrera människokroppen genom slemhinnorna i olika organ eller genom skadad hud. Beroende på processens lokalisering urskiljs difteri i svalget, näsan, struphuvudet, örat, ögat, könsorganen och huden. Blandade former är möjliga, till exempel difteri i svalget och huden, etc. Inkubationsperioden är 2-10 dagar. Vid den kliniskt uttryckta formen av difteri utvecklas en karakteristisk fibrinös inflammation i slemhinnan vid patogenens lokaliseringsplats. Toxinet som produceras av patogenen påverkar först epitelcellerna och sedan de närliggande blodkärlen, vilket ökar deras permeabilitet. Det utgående exsudatet innehåller fibrinogen, vars koagulering leder till bildandet av en gråvit filmliknande beläggning på slemhinnans yta, som är tätt sammansmält med den underliggande vävnaden och, när den rivs av, orsakar blödning. Konsekvensen av skador på blodkärlen kan vara utveckling av lokalt ödem. Difteri i svalget är särskilt farligt, eftersom det kan orsaka difteri-krupp på grund av ödem i slemhinnan i struphuvudet och stämbanden, varav 50-60% av barn med difteri tidigare dog till följd av kvävning. Difteritoxin, som kommer in i blodet, orsakar allmän djup förgiftning. Det drabbar främst hjärt-kärlsystemet, det sympatiska binjuresystemet och perifera nerver. Symtomen på difteri består således av en kombination av lokala tecken beroende på lokaliseringen av ingångsporten, och allmänna symtom orsakade av förgiftning med toxinet och manifesteras i form av adynami, letargi, blek hud, lågt blodtryck, myokardit, förlamning av perifera nerver och andra störningar. Difteri hos vaccinerade barn, om det observeras, förlöper vanligtvis i mild form och utan komplikationer. Dödligheten under perioden före användning av seroterapi och antibiotika var 50-60%, nu är den 3-6%.

Laboratoriediagnostik av difteri

Den enda metoden för mikrobiologisk diagnostik av difteri är bakteriologisk, med obligatorisk testning av den isolerade kulturen av korynebakterier för toxicitet. Bakteriologiska studier för difteri utförs i tre fall:

• för diagnos av difteri hos barn och vuxna med akuta inflammatoriska processer i svalget, näsan och nasofarynx;
• enligt epidemiologiska indikationer från personer som varit i kontakt med källan till difteripatogenen;
• personer som nyligen intagits på barnhem, förskolor, internatskolor och andra specialinstitutioner för barn och vuxna, i syfte att identifiera möjliga bärare av difteribacillen bland dem.

Materialet för studien är slem från svalget och näsan, film från tonsillerna eller andra slemhinnor, vilka är ingångspunkter för patogenen. Sådd sker på telluritserum eller blodmedium och samtidigt på koagulerat serum Roux (koagulerat hästserum) eller Loeffler (3 delar bovint serum + 1 del sockerbuljong) media, på vilket korynebakterietillväxt uppträder efter 8-12 timmar. Den isolerade kulturen identifieras genom en kombination av morfologiska, kulturella och biokemiska egenskaper, med hjälp av sero- och fagtypningsmetoder när det är möjligt. I samtliga fall är ett toxicitetstest med en av ovanstående metoder obligatoriskt. De morfologiska egenskaperna hos korynebakterier studeras bäst med tre metoder för färgning av ett utstrykspreparat: Gram, Neisser och metylenblått (eller toluidinblått).

Behandling av difteri

En specifik behandling för difteri är användning av antitoxiskt serum mot difteri som innehåller minst 2000 IE per 1 ml. Serumet administreras intramuskulärt i doser från 10 000 till 400 000 IE beroende på sjukdomens svårighetsgrad. En effektiv behandlingsmetod är användning av antibiotika (penicilliner, tetracykliner, erytromycin etc.) och sulfonamider. För att stimulera produktionen av sina egna antitoxiner kan anatoxin användas. För att bli av med bakteriebäraren bör antibiotika användas som den givna stammen av korynebakterier är mycket känslig för.

Specifik profylax mot difteri

Den huvudsakliga metoden för att bekämpa difteri är planerad massvaccination av befolkningen. För detta ändamål används olika vaccinalternativ, inklusive kombinerade, dvs. som syftar till att samtidigt skapa immunitet mot flera patogener. Det mest utbredda vaccinet i Ryssland är DPT. Det är en suspension av kikhostebakterier adsorberade på aluminiumhydroxid, dödade av formalin eller timerosal (20 miljarder i 1 ml), och innehåller difteritoxoid i en dos av 30 flockulerande enheter och 10 enheter stelkrampstoxoidbindning i 1 ml. Barn vaccineras från 3 månaders ålder, och sedan utförs revaccinationer: den första efter 1,5-2 år, nästa vid 9 och 16 års ålder, och sedan vart 10:e år.

Tack vare massvaccinationen, som började i Sovjetunionen 1959, minskade incidensen av difteri i landet år 1966, jämfört med 1958, med 45 gånger, och dess indikator år 1969 var 0,7 per 100 000 invånare. Den efterföljande minskningen av vaccinationsvolymen på 1980-talet ledde till allvarliga konsekvenser. Åren 1993-1996 sveptes Ryssland av en difteriepidemi. Vuxna, främst de som inte hade vaccinerats, och barn blev sjuka. År 1994 registrerades nästan 40 tusen patienter. I samband med detta återupptogs massvaccinationen. Under denna period vaccinerades 132 miljoner människor, inklusive 92 miljoner vuxna. Åren 2000-2001 var täckningen av barn med vaccinationer inom den fastställda perioden 96 %, och med revaccination - 94 %. På grund av detta minskade incidensen av difteri år 2001 med 15 gånger jämfört med 1996. För att minska incidensen till isolerade fall är det dock nödvändigt att vaccinera minst 97–98 % av barnen under deras första levnadsår och säkerställa massvaccination under de följande åren. Det är osannolikt att difteri kommer att elimineras helt under de kommande åren på grund av den utbredda spridningen av toxigena och icke-toxigena difteribakterier. Det kommer också att ta lite tid att lösa detta problem.