Stamceller och regenerativ plastisk medicin

Idag finns det få praktiserande läkare som inte känner till utvecklingen av en ny riktning inom behandlingen av de allvarligaste sjukdomarna, som tidigare varit obotliga med traditionell och alternativ medicin. Vi talar om regenerativ-plastisk medicin, baserad på användningen av stamcellernas regenerativa potential. En exempellös vetenskaplig diskussion och pseudovetenskaplig hype har uppstått kring utvecklingsriktningen, till stor del skapad tack vare informationshyperbolerna på World Wide Web. På mycket kort tid har laboratoriestudier av stamcellernas terapeutiska förmågor gått bortom experimentet och har börjat aktivt introduceras i praktisk medicin, vilket har gett upphov till en mängd problem av vetenskaplig, etisk, religiös, juridisk och lagstiftande karaktär. Statliga och offentliga institutioner har uppenbarligen visat sig vara oförberedda på hastigheten i övergången av stamceller från petriskålar till system för intravenös administrering, vilket inte är fördelaktigt för vare sig samhället som helhet eller en specifik lidande person. Det är inte lätt att förstå den ofattbara mängden information om stamcellernas förmågor, både i kvantitet och kvalitet, även för specialister (som det inte finns några av, eftersom alla försöker bemästra den nya vetenskapliga trenden på egen hand), för att inte tala om läkare som inte är direkt involverade i regenerativ plastikmedicin.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Varför behövs sådana experiment och behövs de överhuvudtaget?

Vid första anblicken är skapandet av cellulära interspecieschimärer frukten av den ohämmade fantasin hos en fanatisk forskare som har glömt bioetik. Det är dock denna metod som avsevärt har utökat vår grundläggande kunskap om embryogenes, eftersom den har gjort det möjligt att beräkna antalet celler som är nödvändiga för organogenes (bildandet av lever, hjärna, hud och immunsystemets organ). Dessutom (kanske är detta det viktigaste inom ESC-biologi) har genetiker fått ett unikt verktyg till sitt förfogande, med hjälp av vilket genernas funktionella syfte kan fastställas under chimeriseringen av embryon. Först används en speciell dubbel knockout-teknik för att "stänga av" det studerade genparet i ESC. Sedan introduceras sådana ESC i en blastocyst och de förändringar som sker i kroppen hos det utvecklande chimära embryot övervakas. På detta sätt fastställdes funktionerna hos generna sf-1 (utveckling av binjurarna och könsorganen), urt-l (njuranlage), muoD (skelettmuskulaturutveckling), gata-l-4 (anlage av erytropoes och lymfopoes). Dessutom kan mänskliga gener som ännu inte har studerats introduceras (transfekteras) i ESC hos försöksdjur för att bestämma deras funktion med hjälp av ett chimärt embryo.

Men som regel finner man inte stöd från en bred publik för att rättfärdiga ett experiment genom att erhålla ny grundläggande kunskap. Låt oss ge ett exempel på den tillämpade betydelsen av chimerisering med hjälp av ESC:er. Först och främst är detta xenotransplantation, det vill säga transplantation av djurorgan till människor. Teoretiskt sett tillåter skapandet av chimärer från mänskliga grisceller oss att få ett djur som är mycket närmare ESC-donatorns antigeniska egenskaper, vilket i olika kliniska situationer (diabetes mellitus, levercirros) kan rädda livet på en sjuk person. Det är sant att för detta måste vi först lära oss hur man återställer totipotensegenskapen till genomet hos en mogen somatisk cell, varefter den kan introduceras i ett utvecklande grisembryo.

Idag används embryonala stamcellers förmåga att dela sig nästan oändligt under speciella odlingsförhållanden för att producera totipotent cellmassa med efterföljande differentiering till specialiserade celler, såsom dopaminerga neuroner, vilka sedan transplanteras till en patient med Parkinsons sjukdom. I detta fall föregås transplantationen nödvändigtvis av riktad differentiering av den erhållna cellmassan till specialiserade celler som behövs för behandling och rening av de senare från odifferentierade cellulära element.

Som det senare visade sig var hotet om cancerutveckling långt ifrån det enda hindret för celltransplantation. Spontant differentierar ESC i embryoidkroppar heterogent, det vill säga de bildar derivat av en mängd olika cellinjer (neuroner, keratinocyter, fibroblaster, endoteliocyter). I mikroskopets synfält sticker kardiomyocyter i detta fall ut bland celler av olika fenotyper, som var och en kontraherar i sin egen rytm. För att behandla en patient är det dock nödvändigt att ha rena cellpopulationer: neuroner - vid stroke, kardiomyocyter - vid hjärtinfarkt, β-celler i bukspottkörteln - vid diabetes mellitus, keratinocyter - vid brännskador, etc.

Nästa steg i utvecklingen av celltransplantation var förknippat med utvecklingen av tekniker för att erhålla ett tillräckligt antal (miljontals celler) av sådana rena cellpopulationer. Sökandet efter faktorer som orsakar den riktade differentieringen av ESC var empirisk till sin natur, eftersom sekvensen av deras syntes under embryogenesen förblev okänd. Först fastställdes det att bildandet av gulesäcken induceras genom att tillsätta cAMP och retinsyra till ESC-kulturen. Hematopoetiska cellinjer bildades i närvaro av 1L-3, SCF, fibroblasttillväxtfaktor (FGH), insulinliknande tillväxtfaktor (IGF-1), 1L-6 och granulocytkolonistimulerande faktor (G-СSF) i odlingsmediet. Nervsystemceller bildades från ESC efter avlägsnande av LIF och fibroblastskiktet, som fungerade som en matare. Efter behandling med retinsyra i närvaro av fetalt serum började ESC att differentieras till neuroner, och kardiomyocyter erhölls genom att tillsätta dimetylsulfoxid (DMSO), vilket ger riktad leverans av hydrofoba signalmolekyler till cellkärnan. I detta fall bidrog ackumuleringen av aktiva syreradikaler i odlingsmediet, såväl som elektrisk stimulering, till bildandet av mogna kontraktila kardiomyocyter.

Enorma ansträngningar och resurser lades ner på att hitta förutsättningar för differentiering av ESC till insulinproducerande celler i bukspottkörteln. Det blev dock snart klart att ett antal specialiserade cellinjer (pankreatiska β-celler, immun- och endokrina celler, adipocyter) inte uppstår från ESC när de stimuleras enligt principen "en stimulerande faktor - en cellinje". Denna princip visade sig endast vara giltig för ett begränsat antal cellinjer. I synnerhet kan bildandet av neuroner induceras av retinsyra, muskelcellinjer - av transformerande tillväxtfaktor-β (TCP-β), erytroida linjer - 1L-6, monocytisk-myeloid linje - 1L-3. Dessutom visade sig effekterna av dessa faktorer på differentieringen av ESC vara strikt dosberoende.

Steget med att söka efter kombinationer av tillväxtfaktorer som skulle kunna föra embryogenesen till senare stadier med bildandet av mesoderm (källan till kardiomyocyter, skelettmuskler, renal tubuli-epitel, myeloerytropoies och glatta muskelceller), ektoderm (epidermis, neuroner, näthinna) och endoderm (tunntarmens epitel och sekretoriska körtlar, pneumocyter) började. Naturen tycktes tvinga forskare att gå vidare längs embryogenesens väg, upprepa dess steg i en petriskål, utan att ge möjlighet att omedelbart och enkelt uppnå önskat resultat. Och sådana kombinationer av tillväxtfaktorer hittades. Activin A i kombination med TGF-β visade sig vara en kraftfull stimulator för bildandet av mesodermala celler från embryogenesen, samtidigt som den blockerade utvecklingen av endoderm och ektoderm. Retinsyra och en kombination av benmärgsmorfogenetiskt protein (BMP-4) och epidermal tillväxtfaktor (EGF) signaler aktiverar bildandet av ekto- och mesodermceller, vilket stoppar utvecklingen av endoderm. Intensiv celltillväxt av alla tre groddlager observeras med samtidig effekt av två faktorer på ESC:er - hepatocyttillväxtfaktor (HGF) och nervcellstillväxtfaktor.

För att erhålla de nödvändiga cellinjerna är det således nödvändigt att först överföra embryonala stamceller till stadiet för bildning av celler i ett visst groddlager, och sedan välja en ny kombination av tillväxtfaktorer som kan inducera den riktade differentieringen av ekto-, meso- och endoderm till specialiserade celler som är nödvändiga för transplantation till patienten. Antalet kombinationer av tillväxtfaktorer idag är i tusentals, de flesta av dem är patenterade, vissa är inte alls offentliggjorda av bioteknikföretag.

Det var dags att rena de erhållna cellerna från odifferentierade cellulära föroreningar. De celler som differentierats i kulturen märktes med markörer från mogna cellinjer och passerade genom en höghastighetslaserimmunofenotypisk sorterare. Laserstrålen hittade dem i det allmänna cellflödet och styrde dem längs en separat bana. Försöksdjur var de första som fick det erhållna renade cellmaterialet. Det var dags att utvärdera effektiviteten av att använda ESC-derivat på modeller av sjukdomar och patologiska processer. En av sådana modeller var experimentell Parkinsons sjukdom, som reproduceras väl hos djur med kemiska föreningar som förstör dopaminerga neuroner. Eftersom sjukdomen hos människor är baserad på en förvärvad brist på dopaminerga neuroner, var användningen av ersättningscellterapi i detta fall patogenetiskt motiverad. Hos djur med experimentell hemiparkinsonism rotade sig ungefär hälften av de dopaminerga neuronerna som erhållits från ESC och introducerats i hjärnstrukturerna. Detta var tillräckligt för att avsevärt minska sjukdomens kliniska manifestationer. Försök att återställa funktionen hos skadade CNS-strukturer vid experimentella stroke, skador och till och med ryggmärgsrupturer har visat sig vara ganska framgångsrika.

Det bör dock noteras att nästan alla fall av framgångsrik användning av differentierade ESC-derivat för korrigering av experimentell patologi genomfördes under den akuta perioden av den simulerade patologiska situationen. Resultaten av fjärrbehandling var inte lika betryggande: efter 8–16 månader försvann eller minskade den positiva effekten av celltransplantation kraftigt. Orsakerna till detta är ganska tydliga. Differentiering av transplanterade celler in vitro eller in loco morbi leder oundvikligen till uttryck av cellulära markörer för genetisk främmande karaktär, vilket provocerar fram en immunattack från mottagarens kropp. För att lösa problemet med immunologisk inkompatibilitet användes traditionell immunsuppression, parallellt med vilken kliniska prövningar började inse potentialen för transdifferentiering och genetisk korrigering av autologa hematopoetiska och mesenkymala stamceller som inte orsakar en immunkonflikt.

Vad är regenerativ plastikmedicin?

Evolutionen har identifierat två huvudalternativ för slutet av en cells liv - nekros och apoptos, vilka på vävnadsnivå motsvarar processerna för proliferation och regenerering. Proliferation kan betraktas som ett slags offer, när utfyllnaden av defekten i skadad vävnad sker på grund av dess ersättning med bindvävselement: samtidigt som kroppen bibehåller strukturell integritet förlorar den delvis funktionen hos det drabbade organet, vilket avgör den efterföljande utvecklingen av kompensationsreaktioner med hypertrofi eller hyperplasi av de strukturella och funktionella element som förblir intakta. Kompensationsperiodens längd beror på volymen av strukturella lesioner orsakade av faktorer som primär och sekundär förändring, varefter i de allra flesta fall dekompensation inträffar, en kraftig försämring av kvaliteten och minskning av den mänskliga livslängden. Fysiologisk regenerering säkerställer ombyggnadsprocesser, det vill säga ersättning av åldrande och döende celler genom mekanismerna för naturlig celldöd (apoptos) med nya som härrör från människokroppens stamcellsreserver. Processerna för reparativ regenerering involverar även cellresurserna i stamutrymmena, vilka emellertid mobiliseras under patologiska förhållanden i samband med sjukdom eller vävnadsskada, vilket initierar celldöd genom nekrosmekanismer.

Den stora uppmärksamheten från forskare, läkare, press, tv och allmänheten på problemet med att studera embryonala stamcellers (ESC) biologi beror först och främst på den höga potentialen hos cellulär eller, som vi kallar det, regenerativ-plastisk terapi. Utvecklingen av metoder för att behandla de allvarligaste mänskliga sjukdomarna (degenerativ patologi i centrala nervsystemet, ryggmärgs- och hjärnskador, Alzheimers och Parkinsons sjukdomar, multipel skleros, hjärtinfarkt, arteriell hypertoni, diabetes mellitus, autoimmuna sjukdomar och leukemi, brännskador och neoplastiska processer utgör en långt ifrån komplett lista) bygger på stamcellernas unika egenskaper, som möjliggör skapandet av nya vävnader för att ersätta, som man tidigare trodde, irreversibelt skadade vävnadsområden hos en sjuk organism.

Framstegen inom teoretisk forskning inom stamcellsbiologi under de senaste 10 åren har realiserats genom spontant framväxande områden inom den framväxande regenerativ-plastiska medicinen, vars metod inte bara är ganska mottaglig för systematisering, utan också kräver det. Det första och snabbast växande området för praktisk användning av stamcellernas regenerativa potential har blivit ersättningsterapi för regenerativ-plastisk behandling. Dess väg är ganska lätt att spåra i den vetenskapliga litteraturen - från djurförsök med myokardnekros till de senaste årens arbeten som syftar till att återställa brist på kardiomyocyter efter infarkt eller kompensera för förlusten av β-celler i bukspottkörteln och dopaminerga neuroner i centrala nervsystemet.

Celltransplantation

Grunden för substitutiv regenerativ-plastisk medicin är celltransplantation. Den senare bör definieras som ett komplex av medicinska åtgärder, under vilka patientens kropp har direkt kontakt med livskraftiga celler av auto-, allo-, iso- eller xenogent ursprung under en kort eller lång tidsperiod. Metoden för celltransplantation är en suspension av stamceller eller deras derivat, standardiserad efter antalet transplantationsenheter. En transplantationsenhet är förhållandet mellan antalet kolonibildande enheter i kulturen och det totala antalet transplanterade celler. Metoder för celltransplantation: intravenös, intraperitoneal, subkutan administrering av en suspension av stamceller eller deras derivat; administrering av en suspension av stamceller eller deras derivat i hjärnans ventriklar, lymfkärl eller cerebrospinalvätska.

Allo- och autolog celltransplantation använder två fundamentalt olika metodologiska tillvägagångssätt för att implementera stamcellernas pluri-, multi- eller polypotenta potential - in vivo eller in vitro. I det första fallet genomförs införandet av stamceller i patientens kropp utan deras preliminära differentiering, i det andra - efter reproduktion i kultur, riktad differentiering och rening från odifferentierade element. Bland de många metodologiska teknikerna för ersättningscellterapi skiljer sig tre grupper av metoder ganska tydligt åt: ersättning av benmärg och blodceller, ersättning av organ- och mjukvävnadsceller, ersättning av stela och fasta delar av kroppen (brosk, ben, senor, hjärtklaffar och kapacitiva kärl). Den senare inriktningen bör definieras som rekonstruktiv och regenerativ medicin, eftersom stamcellernas differentieringspotential realiseras på en matris - en biologiskt inert eller absorberbar struktur formad som det ersatta området av kroppen.

Ett annat sätt att öka intensiteten av regenerativ-plastiska processer i skadade vävnader är att mobilisera patientens egna stamresurser genom att använda exogena tillväxtfaktorer, såsom granulocyt- och granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktorer. I detta fall leder bristning av stromala kopplingar till en ökad frisättning av hematopoetiska stamceller i den allmänna blodomloppet, vilka i området med vävnadsskada på grund av sin inneboende plasticitet tillhandahåller regenereringsprocesser.

Således syftar metoderna inom regenerativ medicin till att stimulera processerna för återställande av förlorad funktion - antingen genom mobilisering av patientens egna stamreserver eller genom att införa allogent cellmaterial.

Ett viktigt praktiskt resultat av upptäckten av embryonala stamceller är terapeutisk kloning baserad på förståelse av de utlösande faktorerna för embryogenes. Om den initiala signalen för embryogenesens början är pre-mRNA-komplexet som finns i oocytcytoplasman, då bör införandet av kärnan från en somatisk cell i det enukleerade ägget utlösa embryoutvecklingsprogrammet. Idag vet vi redan att cirka 15 000 gener deltar i genomförandet av embryogenesprogrammet. Vad händer med dem senare, efter födseln, under perioderna av tillväxt, mognad och åldrande? Svaret på denna fråga gavs av fåret Dolly: de bevaras. Med hjälp av de modernaste forskningsmetoderna har det bevisats att kärnorna i vuxna celler behåller alla koder som är nödvändiga för bildandet av embryonala stamceller, groddlager, organogenes och restriktionsmognad (utgång till differentiering och specialisering) av cellinjer av mesenkymalt, ekto-, endo- och mesodermalt ursprung. Terapeutisk kloning som riktning bildades redan i de tidigaste stadierna av celltransplantationens utveckling och möjliggör återföring av totipotens till patientens egna somatiska celler för att erhålla genetiskt identiskt transplantatmaterial.

Upptäckten av stamceller började "från slutet", eftersom termen som introducerades i biologi och medicin av A. Maksimov hänvisade till benmärgsstamceller, vilka ger upphov till alla mogna cellulära element i perifert blod. Hematopoetiska stamceller, liksom celler i alla vävnader i en vuxen organism, har dock också sina egna, mindre differentierade föregångare. Den gemensamma källan för absolut alla somatiska celler är den embryonala stamcellen. Det bör noteras att begreppen "embryonala stamceller" och "embryostamceller" inte på något sätt är identiska. Embryonala stamceller isolerades av J. Thomson från blastocystens inre cellmassa och överfördes till långlivade cellinjer. Endast dessa celler har en faksimil av "ESC". Leroy Stevens, som upptäckte embryonala stamceller i experiment på möss, kallade dem "embryonala pluripotenta stamceller", med hänvisning till ESC:ernas förmåga att differentiera till derivat av alla tre groddlager (ekto-, meso- och endoderm). Emellertid är alla celler i embryot i senare utvecklingsstadier också stamceller, eftersom de ger upphov till ett stort antal celler som utgör kroppen hos en vuxen. För att definiera dem föreslår vi termen "embryonala pluripotenta progenitorceller".

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Typer av stamceller

Den moderna klassificeringen av stamceller bygger på principen om deras uppdelning genom deras förmåga (potens) att ge upphov till cellinjer, vilket definieras som toti-, pluri-, multi-, poly-, bi- och unipotens. Totipotens, det vill säga förmågan att återskapa en genetiskt programmerad organism som helhet, innehas av zygotceller, blastomerer och embryonala stamceller (celler i blastocystens inre massa). En annan grupp av totipotenta celler, som bildas i senare stadier av embryonal utveckling, representeras av primära germinala celler i den embryonala genitalzonen (genitala tuberkler). Pluripotens, vilket är förmågan att differentiera till celler i vilket organ eller vävnad som helst, är inneboende i embryonala celler i de tre groddskikten - ekto-, meso- och endoderm. Man tror att multipotentitet, dvs. förmågan att bilda vilka celler som helst inom en specialiserad linje, är karakteristisk för endast två typer av celler: de så kallade mesenkymala stamcellerna, som bildas i neuralkammen och är föregångare till alla celler i kroppens bindvävsbas, inklusive neurogliaceller, såväl som hematopoetiska hematopoetiska stamceller, som ger upphov till alla blodcellslinjer. Dessutom utmärks bi- och unipotenta stamceller, i synnerhet föregångarcellerna till myeloid-, lymfoid-, monocytisk- och megakaryocytisk hematopoetisk spira. Förekomsten av unipotenta stamceller har tydligt bevisats med hjälp av exemplet leverceller - förlusten av en betydande del av levervävnaden kompenseras av den intensiva delningen av differentierade polyploida hepatocyter.

Under utvecklingen bildas alla organ och vävnader som ett resultat av proliferation och differentiering av blastocystens inre cellmassa, vars celler i strikt bemärkelse är totipotenta embryonala stamceller. Det första arbetet med isolering av embryonala stamceller utfördes av Evans, som visade att blastocyster implanterade i möss hjärna ger upphov till teratokarcinom, vars celler, när de klonas, bildar linjer av pluripotenta embryonala stamceller (det ursprungliga namnet på dessa celler - embryonala karcinomceller eller i förkortningen ECС - används för närvarande inte). Dessa data bekräftades i ett antal andra studier där embryonala stamceller erhölls genom odling av blastocystceller från möss och andra djurarter, såväl som människor.

Under senare år har litteraturen i allt högre grad rapporterat om stamcellers plasticitet, vilket inte bara betraktas som deras förmåga att differentiera till olika typer av celler i olika utvecklingsstadier, utan också att genomgå dedifferentiering (transdifferentiering, retrodifferentiering). Det vill säga, den grundläggande möjligheten att återföra en somatisk differentierad cell till stadiet av embryonal utveckling med rekapitulering (återföring) av pluripotens och dess implementering i upprepad differentiering med bildandet av celler av en annan typ erkänns. I synnerhet rapporteras det att hematopoetiska stamceller är kapabla till transdifferentiering med bildandet av hepatocyter, kardiomyoblaster och endoteliocyter.

Vetenskapliga debatter om stamcellers uppdelning enligt deras plasticitet fortsätter, det vill säga att terminologin och ordlistan för celltransplantation håller på att bildas, vilket har direkt praktisk betydelse, eftersom de flesta metoder inom regenerativ plastikmedicin är baserade på användningen av plastiska egenskaper och stamcellernas förmåga att differentiera till olika cellinjer.

Antalet publikationer inom området grundläggande och tillämpade problem inom regenerativ-plastisk medicin ökar snabbt. En rad olika metodologiska tillvägagångssätt som syftar till att utnyttja stamcellernas regenerativ-plastiska potential på bästa sätt har redan beskrivits. Kardiologer och endokrinologer, neurologer och neurokirurger, transplantationsläkare och hematologer har identifierat sina områden av angeläget intresse. Oftalmologer, lungläkare, nefrologer, onkologer, genetiker, barnläkare, gastroenterologer, terapeuter och barnläkare, kirurger och obstetrikare-gynekologer letar efter en lösning på angelägna problem med stamcellernas plastiska förmåga – alla representanter för modern medicin hoppas få möjlighet att bota sjukdomar som tidigare ansågs vara dödliga.

Är celltransplantation nästa "universemedel"?

Denna fråga uppstår med rätta hos alla eftertänksamma läkare och forskare som analyserar den medicinska vetenskapens nuvarande tillstånd. Situationen kompliceras av det faktum att på ena sidan av den vetenskapliga konfrontationen finns "friska konservativa", på den andra sidan - "sjuka fanatiker" av celltransplantation. Sanningen ligger uppenbarligen, som alltid, mellan dem - i "ingenmansland". Utan att beröra frågor om juridik, etik, religion och moral, låt oss överväga för- och nackdelarna med de utpekade områdena inom regenerativ-plastisk medicin. Den "lätta brisen" från de första vetenskapliga rapporterna om de terapeutiska möjligheterna hos embryonala stamceller förvandlades till en "byvind" ett år efter deras upptäckt, som virvlade runt till en "informationstornado" 2003. Den första publikationsserien handlade om frågor om odling av embryonala stamceller, deras reproduktion och riktad differentiering in vitro.

Det visade sig att för obegränsad reproduktion av embryonala stamceller i kultur är det nödvändigt att strikt följa ett antal villkor. Tre faktorer måste vara närvarande i det konditionerade mediet: interleukin-6 (IL-6), stamcellsfaktor (SCF) och leukashämmande faktor (LIF). Dessutom måste embryonala stamceller odlas på ett substrat (matarlager av celler) av embryonala fibroblaster och i närvaro av fetalt kalvserum. Om dessa villkor är uppfyllda växer ESC i kultur som kloner och bildar embryoidkroppar - aggregat av suspensionskloner av sfäriska celler. Det viktigaste kännetecknet för ESC-klonen är att embryoidkroppen i kultur slutar växa när 50-60, maximalt 100 celler ackumuleras i aggregatet. Under denna period inträffar ett jämviktstillstånd - celldelningshastigheten inuti klonen är lika med apoptoshastigheten (programmerad celldöd) i dess periferi. Efter att en sådan dynamisk jämvikt uppnåtts genomgår de perifera cellerna i embryoidkroppen spontan differentiering (vanligtvis med bildandet av endodermala fragment av gulesäcken, angioblaster och endoteliocyter) med förlust av totipotens. För att erhålla en tillräcklig mängd totipotent cellmassa måste därför embryoidkroppen disaggregeras varje vecka genom transplantation av individuella embryonala stamceller till ett nytt näringsmedium - en ganska arbetsintensiv process.

Upptäckten av embryonala stamceller besvarade inte frågan om exakt vad och hur som utlöser embryogenesprogrammen som är krypterade i zygot-DNA. Det är fortfarande oklart hur genomprogrammet utvecklas under mänskligt liv. Samtidigt gjorde studiet av embryonala stamceller det möjligt att utveckla ett koncept för mekanismerna för att upprätthålla toti-, pluri- och multipotensen hos stamceller under deras delning. Det viktigaste kännetecknet för en stamcell är dess förmåga att självreproducera sig. Detta innebär att en stamcell, till skillnad från en differentierad cell, delar sig asymmetriskt: en av dottercellerna ger upphov till en specialiserad cellinje, och den andra behåller genomets toti-, pluri- eller multipotens. Det förblev oklart varför och hur denna process sker i de tidigaste stadierna av embryogenesen, när blastocystens delande inre cellmassa är helt totipotent, och ESC-genomet är i ett vilande (sovande, hämmat) tillstånd. Om dupliceringsprocessen nödvändigtvis föregås av aktivering och uttryck av ett helt komplex av gener under delning av en vanlig cell, så sker detta inte under ESC-delningen. Svaret på frågan "varför" erhölls efter upptäckten av redan existerande mRNA (pre-mRNA) i ESC, av vilka en del bildas i follikulära celler och lagras i cytoplasman i ägget och zygoten. Den andra upptäckten besvarade frågan "hur": speciella enzymer som kallas "editaser" hittades i ESC. Editaser utför tre viktiga funktioner. För det första tillhandahåller de alternativ epigenetisk (utan deltagande av genomet) läsning och duplicering av pre-mRNA. För det andra implementerar de processen för pre-mRNA-aktivering (skarvning - utskärning av introner, det vill säga inaktiva sektioner av RNA som hämmar processen för proteinsyntes på mRNA), varefter sammansättningen av proteinmolekyler börjar i cellen. För det tredje främjar editaser bildandet av sekundära mRNA, som är repressorer av genuttrycksmekanismer, vilket upprätthåller den täta packningen av kromatin och genernas inaktiva tillstånd. Proteinprodukter som syntetiseras på sådana sekundära mRNA och kallas silencerproteiner eller genomskyddare finns i mänskliga äggceller.

Så här presenteras mekanismen för bildandet av odödliga cellinjer av embryonala stamceller idag. Enkelt uttryckt kommer signalen för att starta embryogenesprogrammet, vars inledande steg består av bildandet av totipotent cellmassa, från äggets cytoplasma. Om blastocystens interna cellmassa, dvs. ESC, i detta skede isoleras från ytterligare regleringssignaler, sker processen för cellernas självreproduktion i en sluten cykel utan deltagande av cellkärnans gener (epigenetiskt). Om en sådan cell förses med näringsämnen och isoleras från externa signaler som främjar differentiering av cellmassan, kommer den att dela sig och reproducera sin egen sort på obestämd tid.

De första resultaten av experimentella försök att använda totipotenta celler för transplantation var ganska imponerande: införandet av embryonala stamceller i vävnaderna hos möss med ett immunförsvar försvagat av immunsuppressiva medel ledde till utveckling av tumörer i 100 % av fallen. Bland cellerna i neoplasmen, vars källa var ESC, fanns differentierade derivat av det totipotenta exogena cellmaterialet, särskilt neuroner, men tillväxten av teratokarcinom reducerade värdet av de erhållna resultaten till ingenting. Samtidigt, i L. Stevens verk, bildade ESC som infördes i bukhålan stora aggregat där embryonala muskler, hjärta, hår, hud, ben, muskler och nervvävnad bildades fragmentariskt. (Kirurger som öppnade dermoidcystor bör vara bekanta med denna bild). Intressant nog beter sig suspenderade musembryoblastceller på exakt samma sätt: deras införande i vävnaderna hos vuxna immunsupprimerade djur orsakar alltid bildandet av teratokarcinom. Men om en ren linje av ESC isoleras från en sådan tumör och introduceras i bukhålan, bildas återigen specialiserade somatiska derivat av alla tre groddlager utan tecken på karcinogenes.

Nästa problem som behövde lösas var alltså att rena cellmaterialet från föroreningar från odifferentierade celler. Men även med en mycket hög effektivitet av riktad celldifferentiering behåller upp till 20 % av cellerna i kulturen sin totipotenta potential, vilket tyvärr in vivo realiseras i tumörtillväxt. Ännu ett "slangbella" av naturen – på skalan av medicinsk risk balanserar garantin för patientens tillfrisknande med garantin för hans död.

Sambandet mellan tumörceller och embryonala pluripotenta progenitorceller (EPPC), vilka är mer avancerade i utveckling än ESC, är ganska tvetydigt. Resultaten av våra studier har visat att införandet av EPPC i olika transplanterbara tumörer hos råttor kan leda till sönderfall av tumörvävnad (G), en snabb ökning av tumörmassa (D), dess minskning (E-3), eller inte påverkar storleken på spontan central fokal nekros av neoplastisk vävnad (I, K). Det är uppenbart att resultatet av interaktionen mellan EPPC och tumörceller bestäms av den totala uppsättningen cytokiner och tillväxtfaktorer som produceras av dem in vivo.

Det är anmärkningsvärt att embryonala stamceller, som svarar med cancerframkallande effekt på kontakt med vuxna vävnader, assimileras perfekt med embryots cellmassa och integreras i alla embryots organ. Sådana chimärer, som består av embryots egna celler och donator-ESC, kallas allofena djur, även om de i själva verket inte är fenotypiska chimärer. Det hematopoetiska systemet, huden, nervvävnaden, levern och tunntarmen genomgår maximal cellulär chimerisering när ESC introduceras i ett tidigt embryo. Fall av chimerisering av könsorganen har beskrivits. Den enda zonen som är okränkbar för ESC är primära könsceller.

Det vill säga att embryot behåller sina föräldrars genetiska information, vilket skyddar renheten och fortsättningen av både släktet och arten.

Under förhållanden där celldelningen i det tidiga embryot blockeras med hjälp av cytoklazin leder införandet av embryonala stamceller i blastocysten till utvecklingen av ett embryo vars primära könsceller, liksom alla andra, bildades från donatorembryonala stamceller. Men i detta fall är själva embryot helt donator och genetiskt främmande för surrogatmoderns kropp. Mekanismerna för en sådan naturlig blockering av potentialen att blanda egen och främmande ärftlig information har ännu inte klarlagts. Det kan antas att i detta fall realiseras apoptosprogrammet, vars bestämningsfaktorer ännu inte är kända för oss.

Det bör noteras att embryogenesen hos djur av olika arter aldrig koordineras: när donatorprogrammet för organogenes implementeras i mottagarens embryos kropp av xenogena embryonala stamceller, dör embryot i livmodern och resorberas. Därför bör förekomsten av chimärer "råtta-mus", "gris-ko", "människa-råtta" förstås som cellulär, men inte morfologisk mosaik. Med andra ord, när ESC från en däggdjursart introduceras i blastocysten hos en annan art, utvecklas alltid avkommor från moderarten, där inneslutningar finns bland sina egna celler i nästan alla organ, och ibland kluster av strukturella och funktionella enheter bestående av genetiskt främmande material av ESC-derivat. Termen "humaniserad gris" kan inte uppfattas som en beteckning på något slags monster utrustad med intelligens eller yttre egenskaper hos en människa. Detta är helt enkelt ett djur, vars kroppsdelar härstammar från mänskliga ESC som introducerats i blastocysten hos en gris.

Utsikter för användning av stamceller

Det har länge varit känt att sjukdomar associerade med genotaptologi hos hematopoetiska och lymfoida celler ofta elimineras efter allogen benmärgstransplantation. Ersättning av egen hematopoetisk vävnad med genetiskt normala celler från en besläktad donator leder till partiell och ibland fullständig återhämtning hos patienten. Bland de genetiska sjukdomar som behandlas med allogen benmärgstransplantation är det värt att notera kombinerat immunbristsyndrom, X-länkad agammaglobulinemi, kronisk granulomatos, Wiskott-Aldrichs syndrom, Gauchers och Hurlers sjukdomar, adrenoleukodystrofi, metakromatisk leukodystrofi, sicklecellanemi, talassemi, Fanconis anemi och AIDS. Det största problemet med användningen av allogen benmärgstransplantation vid behandling av dessa sjukdomar är förknippat med valet av en HbA1c-kompatibel besläktad donator, för vilken framgångsrik sökning krävs i genomsnitt 100 000 prover av typad donatorvävnad.

Genterapi möjliggör korrigering av en genetisk defekt direkt i patientens hematopoetiska stamceller. Teoretiskt sett ger genterapi samma fördelar vid behandling av genetiska sjukdomar i det hematopoetiska systemet som allogen benmärgstransplantation, men utan alla möjliga immunologiska komplikationer. Detta kräver dock en teknik som möjliggör effektiv överföring av en fullfjädrad gen till hematopoetiska stamceller och bibehåller den erforderliga nivån av dess uttryck, vilken vid vissa typer av ärftlig patologi kanske inte är särskilt hög. I detta fall ger även en liten påfyllning av proteinprodukten från den bristfälliga genen en positiv klinisk effekt. I synnerhet vid hemofili B är 10–20 % av den normala nivån av faktor IX fullt tillräcklig för att återställa den interna mekanismen för blodkoagulering. Genetisk modifiering av autologt cellmaterial har visat sig framgångsrik vid experimentell hemiparkinsonism (ensidig destruktion av dopaminerga neuroner). Transfektion av råttembryonala fibroblaster med en retroviral vektor innehållande tyrosinhydroxylasgenen säkerställde syntesen av dopamin i centrala nervsystemet: intracerebral administrering av transfekterade fibroblaster minskade kraftigt intensiteten av kliniska manifestationer av en experimentell modell av Parkinsons sjukdom hos försöksdjur.

Möjligheten att använda stamceller för genterapi av mänskliga sjukdomar har inneburit många nya utmaningar för kliniker och försöksledare. De problematiska aspekterna av genterapi är förknippade med utvecklingen av ett säkert och effektivt system för gentransport in i målcellen. För närvarande är effektiviteten av genöverföring till stora däggdjursceller mycket låg (1%). Metodiskt löses detta problem på olika sätt. In vitro-genöverföring innebär transfektion av genetiskt material in i patientens celler i kultur, med deras efterföljande återföring till patientens kropp. Denna metod bör erkännas som optimal när man använder gener som introduceras i benmärgsstamceller, eftersom metoderna för att överföra hematopoetiska celler från kroppen till kultur och tillbaka är väl etablerade. Retrovirus används oftast för genöverföring till hematopoetiska celler in vitro. Emellertid är huvuddelen av hematopoetiska stamceller i ett vilande tillstånd, vilket komplicerar transporten av genetisk information med hjälp av retrovirus och kräver en sökning efter nya sätt för effektiv gentransport in i vilande stamceller. För närvarande används genöverföringsmetoder som transfektion, direkt mikroinjektion av DNA i celler, lipofektion, elektroporation, "genpistol", mekanisk koppling med glaspärlor, transfektion av hepatocyter med receptorberoende DNA-koppling till asialoglykoprotein och aerosolintroduktion av transgenen i cellerna i lungornas alveolära epitel. Effektiviteten för DNA-överföring med dessa metoder är 10,0–0,01 %. Med andra ord, beroende på metoden för att introducera genetisk information kan framgång förväntas hos 10 patienter av 100 eller hos 1 patient av 10 000 patienter. Det är uppenbart att en effektiv och samtidigt säker metod för att överföra terapeutiska gener ännu inte har utvecklats.

En fundamentalt annorlunda lösning på problemet med avstötning av allogent cellmaterial vid celltransplantation är användningen av höga doser av embryonala pluripotenta progenitorceller för att uppnå effekten av återinstallation av antigenhomeostaskontrollsystemet hos en vuxen organism (Kukharchuk-Radchenko-Sirman-effekten), vars kärna ligger i induktionen av immunologisk tolerans genom att skapa en ny bas av immunkompetenta celler med samtidig omprogrammering av antigenhomeostaskontrollsystemet. Efter administrering av höga doser av EPPC fixeras de senare i vävnaderna i tymus och benmärg. I tymus differentierar EPPC, under påverkan av en specifik mikromiljö, till dendritiska, interdigitata celler och epitelial-stromala element. Under differentieringen av EPPC i mottagarens tymus, tillsammans med mottagarens egna molekyler i det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC), uttrycks MHC-molekyler som är genetiskt bestämda i donatorceller, det vill säga en dubbelstandard för MHC-molekyler etableras, enligt vilken positiv och negativ selektion av T-lymfocyter realiseras.

Således sker förnyelsen av effektorlänken i mottagarens immunsystem genom de kända mekanismerna för positiv och negativ selektion av T-lymfocyter, men genom dubbelstandarden för MHC-molekyler - mottagar- och donator-EPPC:erna.

Omprogrammering av immunförsvaret med hjälp av EPPC möjliggör inte bara celltransplantation utan efterföljande långvarig användning av immunsuppressiva medel, utan öppnar också upp helt nya möjligheter inom behandling av autoimmuna sjukdomar och ger ett fotfäste för utvecklingen av nya idéer om den mänskliga åldrandeprocessen. För att förstå åldrandets mekanismer har vi föreslagit en teori om utarmning av kroppens stamutrymmen. Enligt huvuddelen av denna teori är åldrande en permanent minskning av storleken på kroppens stamutrymmen, vilket förstås som en pool av regionala ("vuxna") stamceller (mesenkymala, neuronala, hematopoetiska stamceller, progenitorceller i huden, matsmältningskanalen, endokrina epitel, pigmentceller i ciliärvecken, etc.), som ersätter cellförlusterna hos motsvarande vävnad i processen för kroppsombyggnad. Kroppsombyggnad är förnyelsen av cellkompositionen hos alla vävnader och organ på grund av stamutrymmesceller, vilket fortsätter under hela en flercellig organisms livstid. Antalet celler i stamutrymmena bestäms genetiskt, vilket bestämmer den begränsade storleken (proliferativa potentialen) för varje stamutrymme. Storleken på stamutrymmena bestämmer i sin tur åldrandetakten hos enskilda organ, vävnader och kroppssystem. Efter utarmningen av stamutrymmenas cellreserver bestäms intensiteten och åldrandetakten hos en flercellig organism av mekanismerna för åldrande hos somatiska differentierade celler inom Hayflick-gränsen.

Därför kan expansionen av stamutrymmen i det postnatala ontogenesstadiet inte bara avsevärt öka livslängden, utan också förbättra livskvaliteten genom att återställa kroppens ombyggnadspotential. Expansionen av stamutrymmen kan uppnås genom att introducera stora doser av allogena embryonala pluripotenta progenitorceller, förutsatt att mottagarens immunförsvar samtidigt omprogrammeras, vilket avsevärt ökar livslängden för gamla möss i experimentet.

Teorin om utarmning av stamcellsutrymmet kan förändra befintliga idéer inte bara om åldrandets mekanismer, utan också om sjukdomen, såväl som konsekvenserna av dess läkemedelsinducerade behandling. Sjukdomen kan i synnerhet utvecklas som ett resultat av patologi hos stamcellsceller (onkopatologi). Utarmning av den mesenkymala stamcellsreserven stör processerna för bindvävsremodellering, vilket leder till uppkomsten av yttre tecken på åldrande (rynkor, slapphet i huden, celluliter). Utarmning av stamcellsreserven hos endotelceller orsakar utveckling av arteriell hypertoni och ateroskleros. Den initialt lilla storleken på tymusstamutrymmet avgör dess tidiga permanenta åldersrelaterade involution. För tidigt åldrande är en konsekvens av den initiala patologiska minskningen av storleken på alla kroppens stamutrymmen. Läkemedels- och icke-läkemedelsstimulering av stamcellsreserver förbättrar livskvaliteten genom att minska dess varaktighet, eftersom det minskar storleken på stamutrymmena. Den låga effektiviteten hos moderna geroprotektorer beror på deras skyddande effekt på åldrande differentierade somatiska celler, och inte på kroppens stamutrymmen.

Sammanfattningsvis vill vi återigen påpeka att regenerativ plastisk medicin är en ny inriktning inom behandling av mänskliga sjukdomar baserad på användningen av stamcellernas regenerativ plastiska potential. I detta fall förstås plasticitet som förmågan hos exogena eller endogena stamceller att implanteras och ge upphov till nya specialiserade cellgroddar i skadade vävnadsområden hos en sjuk organism. Syftet med regenerativ plastisk medicin är dödliga mänskliga sjukdomar som för närvarande är obotliga, ärftlig patologi, sjukdomar där traditionella medicinska metoder endast uppnår en symptomatisk effekt, samt anatomiska defekter i kroppen, vars återställande är målet med rekonstruktiv plastisk regenerativ kirurgi. Enligt vår mening är det för tidigt att betrakta de första försöken att återskapa hela och funktionellt kompletta organ från stamceller som ett separat område inom praktisk medicin. Ämnet för regenerativ plastisk medicin är stamceller, som, beroende på varifrån de kommer, har olika regenerativ plastisk potential. Metodiken för regenerativ plastisk medicin är baserad på transplantation av stamceller eller deras derivat.