Embryonala stamceller

Upptäckten av embryonala stamceller - det fanns ingen tillfällighet, och dök upp på den förberedda jord forskning inom utvecklingsbiologisk forskning. Termen "stamcell" infördes i medicin 1908 vid Society of Hematology Congress i Berlin ansökte Alexander Maximov till hematopoetiska celler. Långt innan isolering och framställning av stabila linjer av pluripotenta embryonala stamceller i den tidiga utvecklingen av forskningen process som används skaft terato- (embryo-karcinomceller med vilka studerade de okända mekanismer av embryogenes, inklusive sekvensen för uttrycket av tidiga gener och proteinprodukter av deras arbete.

Men är totipotencyen hos det humana genomet förlorat i omvärlden i utvecklingsprocessen? Nej, och embryogenes är bevis. Om så är fallet, då kommer i princip den andra vägen för evolutionär utveckling att realiseras? Förmodligen när en person lämnar kosmos, där miljöförhållandena kommer att vara relativt konstanta under ganska lång tid. Benförlust (bendemineralisering i ett viktlöst tillstånd) mycket långsamt mottagliga ombyggnad och regenerering kan anses vara det första steget till anpassningsprocess människa som art av existens i rymden. Betalningen för den andra vägen för evolutionär utveckling kommer dock att vara annorlunda - sterilitet kommer att vara priset att betala tillbaka till alla celler av totipotency och absolut plasticitet. Så multiplicera i denna värld av "evolutionära kameleoner" kommer inte ha någon meiosis, otpochkovaniem. Men vi kommer att leva länge. Telomeras odödlighet är odödligheten hos amoeba. I en multicellulär organism är stamceller substratet för kvantitativ och kvalitativ livslängd.

[1], [2], [3], [4]

Källor av embryonala stamceller

Idag källor av embryonala stamceller för laboratorietester är Linje murina teratokarcinom (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) och humant teratokarcinom (NTERA-2, TERA-2 , H-9 klon), liksom linjerna i ESC Trauneone. Emellertid närvaron detaljerade cellulära pass indikerande immun fenotyp, kromosom analysresultat av mRNA-expressionsprofiler exponerade receptorer och protein intracellulär signalering kompenserar inte för betydande nackdelar teratokartsinomnyh linjer ESC - snabb förlust av totipotency och omöjligheten av applikation i de kliniska prövningarna, och blandades differentiering i odling är mycket svårt att isolera ren specialiserad linje från en heterogen population av celler. Därför, vanligtvis en källa ESC linjer produceras för kliniska ändamål, tjänar som den inre cellmassan av blastocysten, embryon individuella blastomerer av 8-cellstadiet i utvecklingen, celler morula senare skeden, och primära könscell.

Det bör noteras att teratokarcinomceller, även om de har egenskapen för pluripoten, har en signifikant lägre pluripotent potential jämfört med ESC. Deras integration med embryonala celler leder sällan till bildandet av chimärer, där dessutom aldrig gameter med en genotyp av teratokarcinomceller bildas. Man tror att detta beror på det frekventa utseendet av kromosomala avvikelser vid odling av teratokarcinceller: en förlust av Y-kromosomen, en mängd trisomi, deletioner eller translokationer.

Försök att skilja den mänskliga ESC-linjen har gjorts många gånger, men den här uppgiften kunde inte lösas, eftersom normala mänskliga blastocyster är svåra att komma åt objekt. Dessutom är frekvensen av kromosomala abnormiteter hos människor högre än hos embryogenesen hos djur. Den övervägande majoriteten av tidiga humana embryon erhållna efter in vitro fertilisering uppvisar kaotisk kromosomal mosaik och ofta finns det numeriska och strukturella avvikelser. Ännu senare består blottocyststeget endast av 20-25% av mänskliga embryon av celler med normal karyotyp. Det var nästan omöjligt att använda sådana embryon för att skapa en ESC, eftersom zygoter vanligtvis odlades till stadierna av två eller fyra blastomerer och transplanterades sedan i livmodern. Bara relativt nyligen var en tillförlitlig teknik utvecklad för odling av befruktad mänsklig ägglossning till blastocyststeget. Införandet av denna teknik i praktiken av in vitro-fertilisering ökade inte bara frekvensen av framgångsrikt implanteringsutfall, men gjorde också normala blastocyster ett mer tillgängligt objekt.

Annan pluripotenta stamcellkälla är de primära könsceller, vilka, i motsats till de mer avancerade föregångarpopulationer germenativnogo epitel, är inte på ytan av beta-integrin, men uttrycker hög aktivitet shelochnoy fosfatas. Det bör noteras att i experimentet har populationen av stamceller, som bildades från primära sexceller, studerats sedan 80-talet av förra seklet. Samtidigt utvecklades en teknik för isolering av primära bakterieceller från rudimentet av mus-embryongonaden. De första misslyckade resultatet av odling av primordiala könsceller in vitro tyder på det meningslösa i dessa ansträngningar, eftersom cellerna, men överlevde, men inte föröka sig och dog inom den första dagen. Senare visade sig att primärkiemceller från mus reproducerar in vitro endast i närvaro av lösliga och membranbundna specifika polypeptidtillväxtfaktorer i odlingsmediet. Talrika studier har indikerat att det är nödvändigt närvaron i odlingsmediet inte bara LIF, men membrannosvyazannyh och stål-löslig faktor (SIF) för överlevnad och proliferation av primordiala könsceller. Dessa peptider produceras av somatiska celler av embryon homozygota för Stålmutationen, och en av dem är en ligand av proto-onkogen cKit.

Primärkiemceller av däggdjur och människor är av extragonadalt ursprung och är källan till den klonala utvecklingen av könscellslinjen. Utgångslinje primordial könsceller, såväl som alla vävnader i embryot och extraembryonic mesoderm ger epiblast (primär ektoderm) tidiga embryon som har mosaik strukturella organisationen. Den mikrokirurgiska avlägsnandet av olika delar av det tidiga embryot etablerade en lokaliseringszon i epiblastet av en klon av engagerade prekursorer av primära bakterieceller. Med hjälp av rhodamin dextran, som användes som cellmarkör, fastställdes att prekursorerna hos de primära sexuella cellerna ligger i den proximala epiblastregionen, bredvid den extra-embryonala ektodermen. Den primära sexuella cellinjen kommer från 45-cellskloonen, vars tilldelning sker i början av gastruleringen. Därefter uppträder klonsegregationen, och under gastrering kommer de primära sexcellerna in i det extraembryoniska mesodermen och finns i basen av allantoisknoppen bakom primärbandet. Därifrån migrerar de primära bakteriecellerna mot endokervixendodermens ventrala ände och rör sig sedan aktivt längs mesenterin, och lägger genitalrullarna i slutet av migreringen. Under migrationsprocessen, liksom de första 2-3 dagarna av lokalisering i gonadrudimentet, prolifererar de primära sexuella cellerna aktivt och genomgår åtta replikativa cykler. Om i början av migrationen finns cirka 50 primära bakterieceller, så är antalet primära sexceller i reproduktiva cyster av musembryon med tolv dagars utveckling över 25 000.

Den funktionella likheten mellan ESC och primordiala könsceller visar fullständig integrering av den senare i ersättnings blastocysten inre cellmassan och efterföljande fullständig utveckling av embryot, vävnad som består endast av ättlingar primordiala könsceller. Enligt andra kännetecken murina primära könsceller PGCs var också identiska, visar förmågan att differentiera till olika riktningar, för att bilda embryoidkroppar in vitro, en in vivo bildar teratom när injicerade subkutant i möss med immunbrist som liknar spontana teratom testikel möss linje 129 / ter.

Det fastställs att, vid tillsats till LIF-medium, och löslig membrannosvyazannogo SIF isolerade primära könsceller av 8-dagars murina embryon överleva och proliferera i kultur under 4 dagar men sedan dö. Dessutom, den period när kulturen döds observerade primordiala könsceller sammanfaller med utvecklingsstadium av musembryon (12,5-13,5 dagar), när knopparna primära gonadala kvinnliga könsceller anger meios, och i de manliga primordiala könsceller är blockerade mitotiska division. Men om du lägger till miljön inte bara tillväxtfaktorer LIF och SIF, men även FGF2 de primära könsceller fortsätter proliferirovat och subkulturer bildas cellkolonier kan återge även efter att ha avlägsnats från omgivningen av tillväxtfaktorer (SIF och FGF). Sådana celler kan odlas under lång tid på det embryonala fibroblast-substratet utan tillsats av löslig tillväxtfaktor LIF. Det är dessa stabila cellinjer härledda från primära bakterieceller som föreslogs kallas embryonala bakterieceller. Denna term kan inte anses framgångsrik som när odlade EG-celler inte kan erhållas embryonala könsceller, med förmåga att utföra efterföljande stadier av oogenes eller spermatogenes. Detta beror på det faktum att de EG-cellinjer, även om härledda från primordiala könsceller, men i kulturen av förvärva egenskaperna hos embryonala pluripotenta stamceller förlorar sin förmåga att begå germenativnye linjen. Med andra ord förlorar primära sexceller egenskaperna hos gametprekursorer vid odling och transformeras till ESC-liknande pluripotenta celler.

Det noteras att när immunförsvarliga EG-möss administreras uppstår inte teratom. Det antas att förlusten av förmågan hos humana EG-celler att initiera teratom beror på det faktum att dessa linjer inte skapades direkt från odlade primära bakterieceller men erhölls från celler isolerade från embryoidkroppar. Därför är det möjligt att de är efterkommande av pluripotenta, men redan begåvade celler.

Det bör noteras att det finns grundläggande skillnader mellan EG-celler och primära bakterieceller. Den senare gör det inte möjligt att erhålla chimära musembryon, vilket indikerar bristen på förmåga hos primära bakterieceller att integrera i den inre cellmassan eller trophektodermen. Egenskaperna hos populationen av primära sexceller liknar de engagerade linjerna av somatiska celler av senare embryon, vars introduktion till blastocyst leder inte heller till bildandet av chimära embryon.

Modifiering odla de embryoidkroppar erhållna med EG-aggregation av celler som tillåts av selektion på selektiva media för att ta emot en annan population av pluripotenta celler, kallade "celler härledda från embryoidkroppar (embryoid body härledda celler - EBD-celler). Förmågan hos EBD-celler att multiplicera under en lång tid i kulturen gjorde det möjligt att skapa stabila cellinjer av engagerade celler. Kloner av celler som uttrycker ett brett spektrum av mRNA och proteinmarkörer av specialiserade celler erhölls. Detta tillvägagångssätt som ett resultat visat att de primära köns humana pluripotenta celler, och differentiera in vitro till olika celltyper: neuroner, glia, vaskulärt endotel, hematopoetiska celler, muskel och endodermala celler.

Alternativa källor till embryonala stamceller

Alternativ källa för humana ESC-linjer kan vara hybridceller. Implantering i livmodern hos pseudogravida kor geterogenomnoy struktur erhållen när sammanslagning via elektroporering fetusa humana somatiska celler med ägget kor, som tidigare hade tagits bort från pronukleus, gör det möjligt att ta emot den inre cellmassan av pre-implantation embryo artificiella utvecklingsstadier. För detta erhålls blastocysten från ägget hos koen med den transplanterade kärnan i den mänskliga cellen i det första steget.

I andra etappen extraheras embryoblast från blastocysten och från det - ESC enligt Thomson-metoden. Det är anmärkningsvärt att de bästa resultaten i separations ESC linjer genom denna metod erhölls med användning av kärnor av follikulära celler eller primordiala könsceller som fortfarande existerar i den mänskliga kroppen i ett tillstånd av dvala. Detta beror på det faktum att en kos ägg transplanterade humana celler nucleus neukorochennye bör ha hög aktivitet och telomer telomeazy som undviker för tidigt åldrande ESC kloner härledda från hybrid ägg (Repin, 2001). Det är känt att de viktigaste intracellulära markör-EGF-proteinerna är okt3, okt4, tcf, groucho, som hör till de så kallade kromatin-ljuddämpande proteinerna. Ljuddämpare ger särskilt kompakt packning av heterochromatin, vilket förhindrar bildandet av öglor av eukromatin. Kromatinförpackningen medierad av dessa proteiner korrelerar med totipotency av ESC-genomet. Hittills har det fastställts att mogna ägglingar av nötkreatur och människor är den enda typen av specialiserade celler som innehåller höga koncentrationer av ljuddämpande proteiner i cytoplasman. På denna grundval utvecklades en metod för produktion av hybrid-ESC genom att överföra somatiska cellkärnor till icke-nukleära äggkorv av kor. Preliminära in vitro-studier har visat att cytoplasman hos äggcellerna hos kor återställer totipotency hos det humana somatiska cellkärn-genomet i 12-24 timmar odling.

Av särskilt intresse är data om egenskaperna vid preimplantationsutveckling av humana embryon, vilket indikerar en senare ersättning av totipotenta celler av en population av pluripotenta celler än hos möss. Studien av celltransformationer visade att celler i den inre cellmassan hos den humana blastocysten, förutom ESC, också genererar trofoblastceller, vilket indikerar deras totala potens.

Det är känt att vid blastocystens stadium finns det två olika begåvade cellpopulationer. En av dem är det yttre skiktet av blastocysten, trofektoderm, härledd från trofoblastceller och andra embryonala placentakomponenter. Den andra populationen av celler är grupperad i en tät massa som kommer i kontakt med trophektodermens inre yta. Cellpopulationen i den inre cellmassan härrör från alla vävnader och bakterier i embryoorganen. Vid den sena blastocystens stadium bildas en extra-embryonal endoderm från den inre cellmassan och en epiblast bildas (den primära ektodermen). Samtidigt behåller epiblastceller pluripoten, medan förmågan att differentiera celler i den extra-germinala endodermen är begränsad.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Erhålla mänskliga embryonala stamceller

Tills nyligen trodde man att trofoblaster erhållits från omöjliga hESCs. Emellertid diploida linje trofektoderm stamceller isolerade från blastocysten i ett medium som innehåller, i stället för LIF och FGF2 heparin, prolifererar och transformeras in i stamceller. Om du tar bort från mitt i FGF2, trophectoderm cellerna slutar avel, de börjar endoreduplikation av kromosomer och cellulära element trofektodermalnye gradvis omvandlas till en jätte trofoblastceller. Troligen, inte LIF inte stimulera proliferation av trofektoderm celler på grund av det faktum att FGF2 utlöser en mekanism transsignalizatsii som FGF2, bindning till cytoplasmisk receptor (FGFR2), aktivera MAP-kinas i cytoplasman - ERK1 och ERK2. Följaktligen, när de införlivas i cellerna av blastocysten av en signalväg (LIF - gpl30 - JAK-kinas - STAT3) inre cellmassan celler omvandlas till pluripotenta hESCs, medan aktivering av den andra mekanismen av transmembransignalering (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaser ERK1 / ERK2) stamceller i blastocysten trofektoderm bildas. Val av signalväg, i sin tur, beror på aktiviteten av genen Oct4. Denna gen tillhör POU-domänen, beläget vid lokuset t 17 autosomer och uttrycks under oogenes, i krossningsperiod såväl som i celler från den inre cellmassan av blastocysten, och i primordiala könsceller. Funktionell roll Oct4-genen som kodar för en transkriptionsfaktor som är nödvändig för uppträdandet av pluripotenta celler, deras differentiering och dedifferentiering.

Uttrycket av okt4-genen i ESC varierar beroende på interaktionen mellan denna transkriptionsfaktor och kofaktorerna. En riktningsreglering av okt4-uttryck i blastocyster visade att när dess aktivitet minskar bildar hälften av cellerna en trophektoderm, medan övervägande ESC med en ökning av inducerad expression av okt4 uppträder.

I experimentet kan ESC inte omvandlas till en linje vid odling av totipotenta blastomerer vid krossningsskedet, liksom vid gastrulationsstadiet och senare stadier av embryonal utveckling. Mus ESCs vanligtvis allokera åtmin 3,5-4,5 dagar gestation, vilket motsvarar den sjätte (enkelt skikt av blastocysten) och det sjunde stadiet (två skikt av blastocysten - en tidig ägg cylinder) normal embryogenes. Uppenbarligen, bara i preimplantationsperioden innehåller embryon av möss cellulära populationer som kan transformeras till ESC. Följaktligen är isoleringen av ESC-linjer endast möjlig vid vissa steg av embryogenes. Totitipotent, ur synvinkel av möjligheten att utveckla ett livskraftigt embryo med embryonala membraner och placentan, är zygoten och de blastomerer som uppstår vid krossning. Förlusten av den totala potensen hos kimcellcellerna börjar vid det sena morula-steget, när ytterligare blastomererfyllning beror på deras plats. Tidiga morelblomerer behåller totipotency, eftersom experimentella manipulationer med förändringar i deras läge, till exempel inversion av deras plats, inte hindrar utvecklingen av ett fullständigt embryo.

Det visade sig att effektiviteten av frisättningen av ESC i linjen påverkas av blastocysternas tillstånd vid tidpunkten för deras explantation. Användningen av blastocyster efter en sju dagars simulering av diapaus i könsorganen hos möss, äggstockar vid 3,5 dagars dräktighet och behandlas med progesteron, bidrar till en mer framgångsrik separation av rader av embryonala stamceller. Det antas att under sådana förhållanden ökar antalet blastomerer som bildar den inre cellmassan. Det är också möjligt att cellcykeln sträcker sig och de flesta blastomerer går in i G0-fasen.

Dessutom, att skapa stabila pluripotenta hESC linjer beror på genotyp embryon: ganska lätt skiljas från ESCs Murine blastocyster linje 129, är betydligt svårare att erhålla dem genom att använda möss CS7BL / 6 och praktiskt taget omöjligt att isolera ledningen från hESCs blastocyster CBA / Ca-möss. Uppenbarligen har tidiga embryon vissa genetiska egenskaper som påverkar utvecklingen av den pluripotenta ESC-linjen. Emellertid, när de odlas epiblast isolerad, såväl som genom den selektiva urvalet differentiera hESCs cellinje från tidiga embryon CBA / Ca-möss fortfarande allokeras.

En beprövad standardteknik för att erhålla ESK-linjer från blastocyster ges i laboratoriehandböcker om tekniken för experiment med tidiga embryon. Experimentella ESK-linjer kan också erhållas genom odling av en isolerad epiblast (primär ektoderm) av 4,5-dagars musembryon med en ganska komplex mikrokirurgisk teknik och modifierade odlingsbetingelser. Komplexiteten i detta förfarande är motiverat, eftersom frekvensen av bildandet av ESC-linjer var mycket högre än vid arbete med blastocystens interna cellmassa.

För att isolera ESC-linjerna överförs varje klon till en mikrobrunn, ett aggregat av 40-60 celler odlas, det är igen dispergerat. Flera upprepningar av detta förfarande gör det möjligt att erhålla immortaliserade ESK linje med maximala proliferation rate normokariotipnyh celler fästa vid plasten, som genom kanaler 50-100 bibehåller totipotency och hög telomerasaktivitet. I processen att stödja rader ESC den största faran är förorenings eller serum bakteriella endotoxiner - även spår av endotoxin-koncentration i odlingsmediet orsakade massdöd av omogna könsceller. Med noggrann kontroll av linjär tillväxt och att i tid dispersion av ESCs i odling har förmåga att symmetriska fission, i vilken båda dotterceller förblir pluripotenta och kan utföra ett obegränsat antal cellcykler, upprätthålla en diploid karyotyp och den totala potensen.

Val av en ren population av humana ESC kan utföras efter transfektion i deras genom av rekombinanta DNA-molekyler innehållande en gen som kodar för syntesen av ett grönt fluorescerande protein (GFP). GFP-uttrycket ökar med tillväxt av ESC under betingelser som stöder deras proliferation, medan med början av differentiering reduceras expressionsnivån för denna gen, vilket möjliggör selektion av rena stabila pluripotenta cellinjer på ett selektivt medium. När de odlas med GFP-selektion av ESC, ökar frekvensen av kolonier avsevärt, eftersom de kraftiga antiproliferativa effekterna av differentierade celler elimineras vid betingelserna för urvalsgrödor.

Översättning av humana embryonala stamceller i linje med hjälp av deras metod för isolering av preimplantationsembryon (steg 80-120 celler), vilka återstår efter provrörsbefruktning i. För detta är de artificiellt erhållna "överflödiga" embryonerna dispergerade mekaniskt i Delbecco-Needle-miljön. När cellerna är märkta med selektiva monoklonala antikroppar med en fluorescerande etikett isoleras cellerna i embryoblasten. Embryoblastet dispergeras i individuella celler med användning av en blandning av disaspas-kollagenas. Dissocierade celler odlades i ett speciellt medium (80% Delbekko medium + 20% fetalt kalvserum i närvaro av 500 ug / ml av IL-6, LIF och SCF) på monoskikt av embryonala fibroblaster matar 3 första passager. I detta fall stöds överlevnaden och proliferationen av stam- och stamceller genom exponering för IL-6, LIF och SCF. I en sådan miljö växer ESC-celler genom upphängningskloner av icke-anslutna skrapade celler, vilka måste dissocieras genom försiktig multipelpipettering. Nya kloner förekommer i den suspenderade kulturen 5: e-7: e dagen. Den maximala tillväxthastigheten för ESC uppnås genom upprepad dissociering av kloner vid 10-15-cellerna. Sedan överförs varje klon till en mikrocell och odlas till ett aggregat av 40-50 celler. Förfarandet upprepas många gånger i passager, vilket ökar volymen av kultur till en densitet av 5-10 miljoner celler per 6-centimeter kopp. Genom att använda en sådan Thomson passage den isolerades 10 kloner odödliga humana ESCs som genom kanaler 100 bibehåller hög telomerasaktivitet, förmågan att intensiv proliferation och fenotypiska egenskaper minimal total potens, med differentiering i något av de 350 specialiserade cellinjer som är härledda ekto-, meso- - och endoderm. Differentiering av humana ESC startade (vid byte av medium, addition och eliminering av serum LIF) med cellvidhäftning till substratet, vilket indikerar utvecklingen av cytoskelettet och expression av adhesionsreceptorer. Det är viktigt att med en obegränsad spridning av mänskliga ESC-värden bevarades en normal karyotyp.

Den andra metoden för isolering av humana ESC-linjer är baserad på användningen av primära sexceller. Experimentella studier har visat att Eu-cellinjer kan erhållas från könsplakorna av 12,5-dagars gamla embryon från möss. I dessa fall var emellertid frekvensen för bildning av progenitorcellinjer signifikant lägre än vid experiment med tidigare embryon. Samtidigt är primära könceller från gonader av musembryon med 13,5-dygns gestationsålder generellt oförmögna att omvandla till linjer.

De första stabila linjerna av pluripotenta humana EG-celler erhölls från primära gonocyter isolerade från könsorganen från 5-9 veckors gamla embryon. Isolerade celler odlades på ett substrat av inaktiverat mus embryonala fibroblaster i DMEM-medium med fetalt serum, till vilket sattes merkaptoetanol, forskolin, såväl som rekombinanta humana tillväxtfaktorer (FGF och LIF). Efter 7-12 dagar uppträdde multicellulära kolonier i odling, enligt morfologiska särdrag och molekylära markörer som motsvarar humana EG-celler. Efter aggregering bildade dessa celler embryoidkroppar, med den vidare utvecklingen av vilka specialiserade celler uppträdde, karakteristiska för derivaten av alla tre embryonala blad. Under 10-20 passager behöll EG-cellinjer normal karyotyp och förlorade inte pluripoten.

Det visas också att den kombinerade effekten av LIF, membranbundna och lösliga Stålfaktorer, såväl som TGF-b, modifierar programmet för utveckling av primära bakterieceller. I stället för att stoppa de mitotiska delarna och börjar skilja sig mot oogenes eller spermatogenes, fortsätter de primära könscellerna att proliferera. Efter flera ytterligare mitotiska cykler blir de liknande epiblastceller och förlorar egenskaperna hos prekursorer av bakterieceller, transformeras till pluripotenta embryonala stam EG-celler.

Således isolerades odödliga linjer av primära sexuella celler först 1998 från det sexuella rudimentet av humant fetalt obduktionsvävnad. Den embryogenes av humana primära könsceller visas i gulesäcken i den tredje veckan i utveckling och på 4-5 veckor, dessa celler migrerar in i området sexuell knöl, där de bildar en population av primära dormantnye gonocytes. I det inaktiva tillståndet förblir primära bakterieceller i knoppen till födseln. Primära könscellinjer extraherades från de fetala genital tuberkel 5-9 veckor gamla embryon hämtas ex tempore tyg som är behandlade med en blandning av kollagenas typ IV-V, hyaluronidas och DNas för kvantitativ och kvalitativ ökning cellutbyte. Primärkimceller i vävnaderna hos det fosterala könsorganet är omgivna av Sertoli stromal (mesenkymala) celler. Funktionellt syfte av Sertoliceller är produktionen av anti-apoptotiska faktorer (Fas-ligand), mitogener och immunundertryckande medel som skyddar sexuella stamceller från immunangrepp av kroppen. Dessutom spelar den stromala mikromiljön hos könsorganet en viktig roll i mognad av gameter. De isolerade primära bakteriecellerna planteras i odlingen över matarstromalskiktet bestående av fostrets fibroblaster från de tre första passagerna. Den mest effektiva kombinationen av mitogener är ett komplex bestående av LIF, FGF och forskolin (ett stimulant för bildandet av cAMP). Proliferations primordiala könsceller in vitro kräver tillsats av fetalt serum, i närvaro av en primär reproduktions gonocytes i odlings kloner som åtföljs av bildandet av globulära, icke-adherenta celler till substratet.

Den amerikanska National Institutes of Health på grundval av att sammanfatta befintlig information om metoder för tilldelning av humana ESC linjer från blastocyster gjordes en preliminär slutsats att den framgångsrika fördelningen av ESC är mest sannolikt när odlade blastocyster med välformade inre cellmassan (Stamceller: vetenskapliga framsteg och framtida forskningsinriktningar Nat. Inst, of Health USA). Ur denna synvinkel, att den bästa källan för ekonomiska och sociala råd skapa linjer är mänsklig blastocyst 5: e dagen av utveckling, varav fördelningen av den inre cellmassan bör noggrant bort trophectoderm. Isolerade inre cellmassan som består i detta skede av 30-35 celler måste odlas på ett substrat murina embryonala fibroblaster, vilket är en avgörande förutsättning för bildningen av kolonier i kultur hESCs.

Analysen av fenotypiska egenskaper hos embryonala stamceller

Av särskilt intresse är den interspecifika jämförande analysen av fenotypiska egenskaper hos ESC. Det konstaterades att de mänskliga ESK kolonier - en tät kluster av tillplattade epitelceller-celler, medan möss embryoid kalv består av löst konglomerat av rundade celler. I mänsklig ESC är indexet för kärn-plasma-förhållandet lägre än i ESK-mus. Embryonala stamceller av apor bildar mer platta cellkolonier med ojämna kanter. I tidiga kloner av ESC-primater kan enkla celler lätt ses. Prolifererande hESCs alla djurarter inte uttrycker MHC klass I och II. På samma gång, mänskliga ESCs ger ett positivt svar på antikroppar TERA 1-60 och GCTM-2, vilket indikerar närvaro på deras yta keratin / kondroitinsulfatproteoglykaner, karakteristisk för embryonal (teratom) -kartsinomnyh stamceller. Expression i hESCs alla slags djur Oct4-genen tyder på att, trots de fenotypiska skillnaderna i människa och mus ESC, uppenbarligen aktiveras av samma uppsättning av gener som är ansvariga för upprätthållande av pluripotens (Peru, 2001). Dessutom ESC linjer som härrör från embryonala råttor, grisar, kaniner, primater, och boskap, har liknande morfologiska egenskaper, en liknande uppsättning av molekylär identifiering av markörer och en nästan identisk molekylär mekanism för genomförandet av embryogenes program som låter dig ta en ny titt på xenotransplantation fråga .

Till skillnad från normal embryogenes in vivo, är in vitro proliferation av hESCs inte åtföljs av bildandet av germinala skikten och fortsätter till blocket homeotiska Nohgenov bakgrund, dvs utan organogenes. Eftersom segmente gener inte fungerar i kultur hESCs omöjligt att reproducera sådana perioder embryogenes som flik somit segmentering av cellkärnan, bildandet av gulesäcken, allantois provisorisk och andra organ och vävnader. Odlings-ESC: erna frystes i början av bildningen av 350 restriktionslinjer av specialiserade celler. Sålunda, klon dotter progenitorceller och centralt lokaliserade PGCs är enda modellen embryo under utveckling där olika vävnadsområdena bildas i ett steg är olika från specialiserade celler härledda emellertid av gemensamma prekursorer. Även om den miniminivå av receptorer på ytan av hESCs, de bibehåller förmågan att utföra primitiva morfogenetiska processer som simulerar den största delen av tidiga embryot struktur: flyt hESCs i kultur och aggregat bildar en struktur som liknar blastocyst eller till och med senare embryon (ägg flaskor). Sådana suspensionsaggregat benämns lämpligen enkla och komplexa embryoidkroppar.

När de blandas differentiera till olika celler hos embryoid kropp samtidigt uttryckta av tidiga gener ektoderm (oct3, FGF-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), kardiogen mesoderm (PKH-2,5), neurala röret (msx3 ) och hemopoies (elkf). Med användning av olika kombinationer av cytokiner och tillväxtfaktorer för inriktning bildandet av grodden skiktsceller in vitro i ett antal fall var det möjligt att erhålla embryoidkroppar, vilka företrädesvis uttryckta gener ektoderm eller mesoderm, vilket öppnar vägen till modellering av gastrulation och tidig organogenes fasen.

Klonal tillväxt av hESCs är bevis för asymmetrisk celldelning i vilka endast en av ESC i centrum klonen behåller icke begränsande reproduktionsförmågan, medan den andra dottercellen ger upphov till generering av progenitorceller, är differentiering redan kommer in. Därför är graden av multiplikation av klonen vid periferin hos embryoidkroppen högre än i mitten. Marginalcellerna i den växande klonen genomgår spontan oordnad differentiering, migrera eller dö av mekanismerna för apoptos. Dessa händelser bestämma ödet för klonen om proliferationshastigheten överskrider hastigheten av migration och apoptotisk celldöd, klon storlekar fortsätter att öka, uppträder stabilisering med lika apoptos och hastigheten för bildning av nya cellhastighet, regression - den omvända förhållandet av dessa processer. Progenitorceller dela symmetriskt, dvs båda dotterceller därefter differentieras till mogna specialiserade cellinjer. Förhållandet av ESC / progenitorceller varierar, men är alltid antalet PSC är endast en bråkdel av en procent av populationen av progenitorceller. Därför bara en grundlig och tid pipettering Uppdelnings kloner kan öka antalet ekonomiska och sociala råd i kultur. Uppdelnings kloner uppträdde i steg 10-12 celler mest effektiv för att erhålla en maximal hESCs avkastning. Riktningen och graden av differentiering av celler i embryoidkroppen beror på deras placering. Yttre embryoida kroppens celler inte uttrycka genen och Oct4 genomgår differentiering i primära endoderm celler från vilka därefter bildade epitelioida celler och parietal extraembryonic visceral endoderm. De inre cellerna i embryoidkroppen uttrycker okt4-genen och bibehåller pluripoten i 48 timmars odling. Men sedan den morfologiska omorganisationen sker i epitel monolagerkultur börjar och uttryck av gener som styr utvecklingen av primär ektoderm. Sedan börjar processen med total oordnad cytodifferentiering med utseendet av olika celltyper som är derivaten av alla tre germina arken. I processen för spontan differentiering av de embryoidkroppar kroppens celler först uppstår aggregat endoderm markörer i form av fragment (cystor) gulesäcken. Vidare uppträder angioblaster och endotelceller från odlingskapillärer i dessa strukturer. I slutskedet av spontan differentiering av de interna cellerna hos embryoid kroppen utvecklar olika terminalt differentierade celler, inklusive nervceller, gliaceller element, kardiomyocyter, makrofager och erytrocyter. I vissa approximation (väger den rumsliga inversion av arken, som bildar embryonal vävnad) via de embryoidkroppar in vitro kan utforska morfogenetiska processer och analysera de molekylära mekanismerna för embryonala cytodifferentiation inledande period, och fastställa rollen av specifika gener i genomförandet av dessa processer.

Således är det i klon celler där olika genetiska utvecklingsprogram upptäcks - ESC, tidiga progenitorer och differentierande progenitorpopulationer. Odlingen av ESC med metoderna för en hängande droppe eller masskultur utan matarskikt och utan tillsats av LIF i mediet leder oundvikligen till bildandet av embryoidkroppar. Morfologin hos cellerna i de yttre och inre skikten av embryoidkroppen är annorlunda. Det yttre skiktet består av stora processceller. Deras yta, vänd mot miljön, är täckt med många mikrovilli. Det yttre skiktet av celler separeras från det inre basala membranet som liknar Reichert-membranet, medan cellerna i det inre skiktet av embryoidkropparna är ett cylindriskt epitel. Morfologiskt, det inre skiktet, även om det innehåller många delande celler, påminner mer om odifferentierade ESC-kolonier.

Funktioner av mänskliga embryonala stamceller

Frånvaro av parenkyma-mesenkymala interaktioner vid bakgrundssignalblockerings gener homeosis orsakar oordnad tillväxt av PGCs i odling, eftersom denna flik är bruten och de bildande infrastruktur provisorisk organ. Unorganized tillväxt och oordnade spontan differentiering av hESCs i kultur på grund av bristande mesenkymala märkning stromal ramen för framtida organ: in vitro är det möjligt att bilda miljontals hepatocyter, men du kan inte få någon segment i levern, inklusive sådana strukturella och funktionella element, såsom bihålorna, loppet av Disse och Kupfferceller.

Det förmodas att den pluripotens av ESCs realiseras uteslutande i embryogenes för att bilda vävnader och organ i embryot, medan navelsträngen och moderkakan är härledda trofoblast. Innesluten i ett skal trofektodermalnuyu ESK konsekvent generera cellkloner provisorisk förverkliga utvecklingsprogram genom kombinatoriska mRNA bulk Nohteyaov topografiska matris, vilket förutbestämma rymdarrangemang, form, dimensioner, antal preliminära och slutgiltiga organceller och parenkymet aggregatet i strukturell och funktionell enhet. Samtidigt ESK är den enda celltypen i vilken den molekylära mekanismen för förverkligandet av deras potentialer fullständigt dissocierad från den genetiska program för utveckling och ESCO själva berövas möjligheten till samverkan med andra celler på grund av blockering av båda receptor uppfattningar och transsignalizatsii system. Dock är tillräckliga aktiverings ESC resulterar i en gradvis utbyggnad embryogenes program slutar födelse helt bildas och redo att extrauterin liv av en organism som består av miljarder celler. I denna korta tid, men otänkbart skuld i den cellulära utrymmet vägen oundvikliga förekomsten av fel i de molekylära mekanismer som ger vitala funktioner av celler, och i de program som styr deras proliferation, differentiering och specialisering. Därför, i moderna farmakogenomik behandlas separat sjukdom molekylära enheter, och sjukdom cellprogrammering. Och effekten av majoriteten av nya läkemedel som syftar till att korrigera namnet på programmet för differentiering, förökning och organ samt förnyelse av organ och vävnader. I den vuxna organismen via ESCs blir det möjligt att kontrollera beteendet hos stam / ursprungscellerna transplanterade in i hjärnan, lever, mjälte, benmärg och andra organ i människa för att reparera en skadad mottagare parenkymala organ på grund av differentiering och specialisering donator mesenkymala celler bevarade matris. I huvudsak är totipotency program lanserar en annan äggcellen genomnivå, zygoter och blastomeres, men dessa celler är ännu inte möjligt att klona och passe i de kvantiteter som behövs för behoven av upplevelse och praktisk medicin. Därför är ESK en unik källa till genetisk information som innehåller den tredimensionella linjära restriktionskartan av embryot och koder för specialiserade cellinjer under gastrulation.

Praktiskt taget obegränsade möjligheter av regenerativ ESC på grund av det faktum att deras genom, i motsats till den genetiska apparat av differentierade somatiska celler, bibehåller pluripotens. En manifestation av vilande tillstånd rotad i ESCs genetisk information är den så kallade minimi fenotyp - på ytan av ESC att uttrycka ett begränsat antal receptorer, och därför utvecklas väldigt få program för att interagera transsignalizatsii kärn apparaten cellen med dess mikromiljö. Mot bakgrund av viloläge gener ansvariga för begränsning av specialiserade cellinjer och differentiering av celler, aktiveras endast cirka 30 av de 500 gener vars produkter ger kommunikationsceller med den omgivande mikromiljö. Användning av metoden enligt serieanalys av genuttryck visat att det generella i de viktigaste funktionella genomet lådor reglerar energi och metabolism i somatiska celler och ESCs i sista bestämmas extremt låg mängd av mRNA av receptorer, G-proteiner, andra budbärare, transkriptaser, kofaktorer expression och repression det vill säga, den regulatoriska signal hela systemet transmembran in i cellen. Detta beror på bristande eller mycket lågt uttryck gener transsignalizatsii. Under differentier induceras i genomet av ESC 18 operationen stoppas synkront fungerande gener för bakgrundsaktivering transsignalizatsii 61 gen som styr syntesen av celladhesionsreceptorer, extracellulära matriskomponenter, transkriptaser restriktions messendzhernyh element och signalöverföringssystem för en kärnkraftsenhet med plasmacellmembranreceptorer. Samtidigt blockerad expressionen av gener som är ansvariga för syntes av proteiner ljuddämpare, samt genexpression koingibitorov tillhandahålla totipotency genom hESCs.

För celler av alla tre germinallager genetiska markörer hittats. Identifiering ektodermal cellskikt som bärs på expressionen av gener nodal, oct3 och FGF-5, mesodermala celler - gen brachyury, zeta-globin, endoderm - vid gata-4-genexpression. Vid normal embryogenes, under gastrulation observerade en aktiv migration av omogna populationer av stam- och stamfaderceller, lokalt designerar områden av ansikts skallben, vissa delar av hjärnan, perifera nervsystemet, hjärtledningssystemet och tymus vävnad som bildas av kloner förskjutna celler. Cellmärknings tidiga gener groddblad gör det lättare för topografisk analys av migration av progenitorceller i det utvecklande embryot. Det visar sig i synnerhet att cellerna i aggregaten embryocarcinoma P19 uttryck av den första genen mesoderm brachyury startar under reduktionen av genuttrycket av vävnadsplasminogenaktivator, en-fetoprotein, keratin 8, och keratin 19, vilka är markörer för tidiga mesoderm flyttande populationer. Följaktligen börjar bildandet av vävnader av mesodermalt ursprung först efter processen för migrations- och sedimenteringspunkts mesodermala stamceller.

Med extremt begränsade fenotypiska egenskaper och frånvaron av de flesta av blocken transsignalizatsii ESC ändå uttrycker vissa receptormolekyler som kan användas för att identifiera dem. Det är anmärkningsvärt att antigenerna är markörer för ESC hos människor och primater var vanliga. Oftast för märknings hESCs märkta antikroppar till antigener membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unika lipid antigener representerar komplex glykolipid GL7 med sialinsyra), såväl som höga polymer glykoproteiner TRA-1-81, TRA-1-60. Vidare hESCs uttrycka specifika embryonala antigen SSEA-1 och endogent alkaliskt fosfatas, såväl som en specifik transkriptionsfaktor Oct4. Det senare behövs för att bibehålla hESCs spridningsmekanismer - specifik transkriptionsfaktor Oct4-genen aktiverar uttrycket av fibroblasttillväxtfaktor 4 genuttryck och stabiliserar boxning ansvarig för icke-begränsande DNA reduplication i omogna celler. De viktigaste intracellulära markörproteiner är Oct3, Oct4 TCF och Groucho, i samband med proteiner av kromatin-ljuddämpare.

Nästan omedelbart efter de långsiktiga odlade ESCs försök misslyckas och organismen framställdes först genom odling av stamceller som isolerats från musblastocyster, och primära könscellskultur, började scen ESC pluripotens kapacitetsstudier när det administreras i de tidiga stadierna av embryoutveckling. Det visades att vid morula och blastocyst PGCs kan bilda chimära embryon, i vilka donator PGCs ättlingar detekteras i alla somatiska vävnader och även i könsceller. Således, i Developmental Biology använder ESC skript "bro" mellan de experimentella studier in vivo och in vitro, vilket väsentligt ökade möjligheten att studera processer bokmärken primära vävnader och organ, deras differentiering och embryonala organogenes.

Det är väl etablerat att ESK in vivo under embryogenes integreras i cellmassa tidiga embryot, och deras derivat finns i alla organ och vävnader. PGCs koloniserar könsceller av en chimär könsceller, avkomma av vilka bildar hela ägg och sperma. Embryonala stamceller är klonogena - enkel PGCs kan skapa genetiskt identisk med en koloni av celler med molekylära markörer, som inkluderar Oct4 genexpression och alkaliskt fosfatas, hög telomerasaktivitet, samt uttryck av specifika embryonala antigener.

Att studera mekanismerna för embryogenes med användning av tekniken enligt hESCs chimerisering morula genom att skapa en biologisk struktur, som är belägen utanför skikt tetraploida blastomerer mottagar- och donator PGCs administreras i. Sålunda, trofoblast bildad av ättlingar blastomerer tetraploid mottagaren som möjliggör implantation och placentation, och givar PGCs som verkar som den inre cellmassan, vilket är bildat av en livskraftig könscellinjen av de primära kropps och stamfader gameter. Studie ESC värde ligger inte bara i att när manipulation in vitro med sitt genom bibehållen pluripotens, men också i det faktum att medan bevara förmågan att delta i bildandet av hESCs primordial könsceller hos chimära embryot. Det visas att endast en avkomma av genetiskt modifierade PGCs kolonisera alla primära och bakterier som bildar tyget chimärt embryo som erhållits genom aggregation eller samodling av cellerna med 8-cell embryo. Vid transplantation in i möss morula ESCs transfekterade med grönt fluorescerande protein-genen, var fluorescerande ättlingar till de celler som finns i alla undersökta vävnader i det utvecklande embryot (Shimada, 1999). Transplantation av ESC i morula kan skapa livskraftiga möss kropp som består enbart av ättlingar donerade ESC, vilket öppnar möjligheter för en mängd olika terapeutisk kloning alternativ. Nu så metodiskt tillvägagångssätt har framgångsrikt tillämpats för att studera problemen med utvecklingsbiologi, i synnerhet, kan det analysera genetiska mekanismerna för inaktivering av X-kromosomen eller epigenetisk instabilitet hESCs. Transplantation av ESC i det tidiga embryot används i jordbruks bioteknik, liksom i experimentell genterapi.

Transplantationer av genetiskt modifierade ESC används för att testa målcellerna av mutanta gener. In vitro odlade ESC används i bioteknik för att skapa knockout-möss. För detta ändamål, genom homolog rekombination för att tas bort från ESCs studie genen (knockout) och selektiva medier utsöndrar celler som saknar denna gen. Därefter injiceras knockout ESC i blastocysten eller aggregeras med blastomerer av morula. De sålunda erhållna chimära tidiga embryon transplanteras i en mottagande hona och nyfödda möss valda bland individer med könsceller, nullizigotnymi av denna gen. Enligt denna teknik skapat många rader av knockoutmöss, som ofta används i experimentell biologi och experimentell medicin. Vid dessa biologiska modeller studerat värdet av vissa gener i embryonal utveckling, liksom deras roll i mekanismerna för sjukdomar och patologiska tillstånd hos människor. Dessutom har knockoutdjur linje som används under steget av preklinisk testning av nya metoder för genterapi. Exempelvis med användning av den gen transfektion i ESK normal allel av den muterade genen hantera effektivt korrigerade mutation, träffar hematopoetiska systemet. Införandet av främmande gener i ESC möjliggör snabbt skapa linjer homozygota transgena försöksdjur. Det bör dock noteras att tekniken riktad rekombination gendeletion tillförlitligt fungerat som ännu endast relativt ESC möss. Med användning av murina ESCs dubbelknockout installerad funktionell roll område kluster av gener på kromosom 7 (kopiera genomregion 19 minuter human kromosom), och den proximala delen av den 11: e kromosomen (kopiera humant 5d kromosom) - deletion av dessa gener i ESK-möss fick utvärdera funktionen av deras analoger hos människor.

De kapacitet funktionsstudier av mänskliga embryonala gener, transfektion i gen som försöksdjur tillåtna hESCs särskilt krypto klargöra rollen av genen i fliken och bildar kardiogen mesoderm, pax-6-genen - i embryogenes ögat. Utgör den första expression av gener i omogna prolifererande kort ESC teratokarcinom och blastocyst möss bekräftade överväldigande förtryck i ESK transsignalizatsii gener. Kombinationen av muterade ESC 60-80 och 20-30 celler i normala preimplantatorisk musembryon leder till utveckling av chimära embryon som bokmärken kroppar består av givar- och mottagarceller, som tillåter oss att bestämma rollen av okända gener i gastrulation och organogenesen. Funktionell karta över genen utvecklar musembryon förstorade detaljer av den roll som genen sf-en flik i binjuren och genital primordia, wt-1-genen - i njurar fliken MyoD familj gener - i fliken av skelettmuskel genfamiljen GATA-1-4 - i restriktions mognaden rudiment av erytro- och lymfopoisis.

Riktad bort av moderns och faderns alleler av gener i hESCs använder vektor rekombinas tjänade till att klargöra funktioner olika gener under tidig embryogenes och teknik med inriktning på mänskliga okända gener i mus ESC bidrar till upptäckten av nya muterade gener som är ansvariga för utvecklingen av allvarliga ärftliga sjukdomar. Med användning av knockout Metoden definierad obligat betydelse vissa gener för läggning embryonala vävnader: gata-4 - för infarkt, gata-1 - till erytroida hemopoietisk vävnad, MyoD - skelettmuskel, brachyury - för mesoderm restriktions transkriptaser hnf3 och HNF4 - för leverstamceller, rag-2 - bokmärken för kloner av T och B-lymfocyter (Repin, 2001). Dubbel radering av gener i hESCs har öppnat tillgång till studiet av den funktionella rollen av gener i germinal lager, segmentering och homeosis och ESC transplantation ges möjlighet att få livskraftiga interhybridembryon. Med förbättrade metoder för transplantation av donator PGCs på en enda 8-cell embryo bevisat att chimerisering på cellnivå av många organ hos mottagaren embryot. Observera att cell groddar finns i humana vävnads recipientmöss organ efter administrering av humana hematopoietiska stamceller i en blastocyst. Det konstaterades att i musembryon under bildandet av blodkroppar cirkulerande pluripotenta hESCs. Det är möjligt att deras biologiska funktion är att organisera det framtida fosterimmunsystemet. Med ESC in vitro reproduceras adekvata modeller av human genetisk sjukdom: dubbel knockout-modeller dystrofingen i möss av Duchennes muskeldystrofi, avstängning atm genen (styrsignalsynteskinas kromatin) - ataxi-teleangektaziyu. I detta fall, en dödlig ärftlig sjukdom hos barn på grund av defekter i DNA-reparations utvecklar degenerering av Purkinje-celler i cerebellum, vilken åtföljs av en involution av tymus på grund av död av de prolifererande celler. Clinic, patofysiologi och patomorfologija ataxi-teleangek- tazii återges via införsel till ESC onormal genetisk information från möss chimärer motsvarar de hos människa. Dessutom ataxi-teleangektazii användning PGCs och knockoutmöss utvecklat experimentell modell, vissa ärftliga homozygota humana sjukdomar associerade med rubbningar i kolhydrat och lipidmetabolism, katabolism av aminosyror, avlägsnande av koppar och bilirubin, vilket avsevärt ökade möjligheten av experimentell medicin för preklinisk testning av nya metoder för att behandla relevanta sjukdomar person.

[12], [13], [14], [15]

Användningen av stamceller cytohybrid

Hybridcellerna som erhållits genom att fusera somatiska celler från hESCs, är tillräckliga och lovande modell för att studera stamcells pluripotens och omprogrammering av differentierade cellkromosomer. Tsitogibridy erhållet genom sammanslagningen av ESC med differentierade celler av det vuxna djuret, ge en möjlighet att studera förhållandet mellan genomen hos olika "åldrar": utvecklar en unik situation där de homologa kromosomer härledda från celler från olika stadier av differentiering och varierande grad av mognad, är i samma kärna, där de kan enkelt transdeystvuyuschimi delar regulatoriska signaler. Det är svårt att förutse hur reagerar tsisregulyatornye epigenetiska systemet av homologa kromosomer existerande under yn dividual utveckling, som svar på de slag transdeystvuyuschih signalerna från embryonala relaterade genom. Dessutom i hybridcellerna sker segregation av föräldrakromosom som gör det möjligt att studera interaktionen av genomen vid separat kromosomnivå, d.v.s. Potentiellt identifiera den del av specifika kromosomer i underhållet av pluripotens, eller Tvärtom, en produktion i differentiering.

Som den första försöksmodell för att studera interaktionen av genomen av olika "historia av utveckling" används tsitogibridy erhålles genom att slå samman teratokartsinomnyh pluripotenta och differentierade somatiska celler. I vissa fall behöll sådana hybridceller pluripotenta egenskaper på en tillräckligt hög nivå. I synnerhet, har in vivo somatisk hybrid teratokartsinomno-celler inducerad utveckling av sanna teratom innehållande derivat av alla tre germinallager, en in vitro i suspensionskulturer bildade embryoidkroppar. Även i denna typ av mellan arter tsitogibridov noterades närvaron av fetala antigener i de fall där somatisk partner i fusionen med teratokarcinomceller var lymfocyter eller tymocyter. Det är anmärkningsvärt att tsitogibridy genom sammanslagningen teratokartsinomnyh cellerna med fibroblaster, som överensstämmer med fenotypen av fibroblaster.

Det viktigaste är att ett etablerat faktum att i-teratokartsinomno somatiska hybridceller uppträdde tecken genomet omprogrammering av differentierade celler, kännetecknad av en reaktivering av enskilda gener eller inaktiva X-kromosomen somatisk partner. Således, resultatet av forskning om typ tsitogibridah teratokartsinomno-somatiska celler indikerar att hybridceller behöll ofta pluripotens och omprogrammering av genomet, det finns tecken på somatisk partner.

I experimenten för att erhålla embryonala intraspecifika hybridceller genom sammansmältning av splenocyter med mus ESCs vuxna djuret studerade egenskaper såsom tsitogibridov, segregation analys av föräldra kromosomer och bedömas pluripotens hybrid genome. För de interspecifika hybridcellerna som produceras av fusion teratokarcinomceller med somatiska celler, i allmänhet kännetecknas av låg segregation av kromosomer med tetraploida eller nära-tetraploida karyotyp. Sådan kromosomal tsitogibridah komposition observerades i fusions primordiala könsceller till lymfocyter. På samma gång, de interspecifika hybridcellerna som erhållits som ett resultat av fusionen av mus lymfocytcellinje teratokartsinomnyh mink, det var intensiv segregering av kromosomer somatisk partner.

En kvalitativt ny fas i studien av segregering av föräldra kromosomer i interspecifika hybrider kom efter utvecklingen av mikrosatellitanalys-metoden med användning av polymeraskedjereaktion, varvid varje mus kromosom hittat ett par hundra markörer, vilket möjliggör tillförlitligt särskilja mellan vilket som helst par av homologa kromosomer i hybridcellerna.

Genom att slå samman ESK (med användning av HM-1-celler som lider brist på gipoksantinfosforiboziltransferazy aktivitet, 2n = 40, XY, isolerad från blastocyster musstammen 129 / 01a) med splenocyter från möss kongena linjen DD / c misslyckades med att ta emot uppsättningen av hybridkloner hade morfologiskt likhet med hESCs. Alla kloner isolerades på selektivt medium, där tillväxt är möjlig endast med den aktiva cellen gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforetisk analys avslöjade närvaron av alla kloner allelvariant gipoksantinfosforiboziltransferazy karakteristisk möss DD / c. Med hjälp av cytogenetisk analys konstaterades det att fyra hade tre hybrid kloner okolodiploidny uppsättning kromosomer. En nära-tetraploid klon innehöll två populationer av hybridceller, av vilka en var tetraploida och det andra, mindre - diploid.

Analys av mikrosatellit gör det möjligt att diskriminera något par av homologa kromosomer mus 129 / 01A och DD / c, i de hybridkloner med okolodiploidnym uppsättning visade att klonerna inträffade i två distinkta preferentiell eliminering autosomer somatisk partner. De flesta autosomala kloner HESS2 och HESS3 hade markörer linje 129 / 01a, dvs pluripotenta partner. Undantaget var kromosom 1 och I: kloner HESS2 och HESS3, tillsammans med markörer av HM-1-celler, ett litet antal markörer närvarande somatisk partner. Dessa resultat kan avspegla ofullständig segregationen av kromosomer 1 och och somatisk partner och är i överensstämmelse med cytogenetiska data som trisomi av kromosomer som förekommer i 30-40% HESS2 och HESS3 cellkloner. HESS4 klon skilde sig signifikant i kromosomal sammansättning: många autosomer Denna klon härstammar från genomet ESK (kromosomer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 och 17), men kromosomer 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 och 19 representerades av homologer från båda föräldrarna. Dessa homologa kromosomer det kvantitativa förhållandet av mikrosatellitmarkörer motsvarade ungefär 1: 1. Detta gjorde det möjligt för författarna att föreslå att en homolog är härledd från genomet av ESK och den andra - från differentierade celler. I vissa subkloner av klon HESS4 observerades endast token närvaro av kromosomer 18 och 19 somatisk partner. Resultaten indikerar att cellerna klona HESS4, utöver segregeringen av kromosomer somatisk partner, fanns elimineringen av en eller båda homologerna av ovanstående kromosomen pluripotenta genomet, dvs det var en dubbelsidig segregation av kromosomer från båda föräldrarna - fenomenet är ganska ovanligt, eftersom tsitogibridov karakteristisk segregation av kromosomer endast en av föräldrarna.

Dessutom, efter den 20: e passagen, alla kloner av hybridceller innehåller endast de X kromosommarkörer av den somatiska partner, det vill säga i klonerna ersattes X-kromosom ESC på X-kromosomen hos somatiska partnern. Detta bekräftas av in situ hybridiseringsdata med användning av en FITC-märkt sond specifik för mus-X-kromosomen: en positiv signal detekterades endast på en kromosom. Det bör noteras att vid tidigare kultiveringsstadier (upp till 15: e passagen), enligt cytogenetiska data, var det i många celler två X-kromosomer. Följaktligen gör användningen av selektiva medier det möjligt att manipulera den kromosomala kompositionen hos hybridceller och selektivt rikta kloner som bär enkla kromosomer från den somatiska partnern mot bakgrunden av ESC-genomet.

Som en unik funktion av genomet tsitogibridov är lokaliseringen av föräldra genomen i en enda kärna, naturligtvis, väcker frågan om att bibehålla egenskaperna hos pluripotenta embryonala genomet ESC-somatiska cellhybrider i villkoren för nära kontakt med genomet av differentierade celler. Morfologiskt liknade cytohybriden av ESC och somatiska celler ESC: s föräldra linje. Kvalificerings pluripotens visade att samtliga kloner okolodiploidnym set av kromosomer kunde bildas i suspensionsodlingar av embryoidkroppar i vilka derivaten av de tre groddblad närvarande.

De flesta hybridceller innehöll ECMA-7-antigenet, en markörskaraktäristik för tidiga musembryon och hade också en hög aktivitet av alkaliskt fosfatas. De mest övertygande uppgifterna om hybridcellernas höga pluripotenta egenskaper erhölls i experiment för att erhålla en serie injektionschimärer involverande hybridceller i klonen HESS2. En analys av biokemiska markörer visade att ättlingar av donorhybridceller hittades i de flesta chimärvävnader. Därför behåller hybridceller erhållna genom fusion av ESC och somatiska differentierade celler pluripoten på en hög nivå, innefattande förmågan att bilda chimärer när de sätts in i blastocystkaviteten.

Kloner HESS2 och HESS4 skilde sig signifikant i sammansättningen av moderkromosomerna, men de hade liknande pluripotenta egenskaper. Man skulle kunna tro att plyuripotentnostv 'i hybrid genomet yttrar sig som en dominerande tecken, men det är möjligt att inte alla de embryonala genomet kromosomer är involverade i upprätthållandet av pluripotens. Om detta antagande är korrekt kan man förvänta sig att eliminering av några kromosomer från den pluripotenta partnern från hybridomgenomet inte kommer att åtföljas av en förändring i deras pluripotenta status. I detta fall skulle en analys av segregeringen av föräldrakromosomer i embryonala hybridceller möjliggöra en nära inställning till identifieringen av kromosomer som är ansvariga för att styra pluripotency hos embryonala celler.

Serov O. Et al (2001) finns bland de 50 avkommor erhölls från korsningar av chimärerna med normala möss, sådana som skulle ha genotypen möss 129 / 01a, och som uppbär X-kromosomen DD möss. Författarna ser orsaken till detta vid reduktionen av pluripoten i hybridceller under påverkan av det somatiska genomet. En alternativ förklaring kan vara den negativa effekten av trisomi på vissa autosomer och obalanser i sexkromosomer (XXY observerades i celler upp till 15: e avsnittet) i hybridceller när de passerade meios. Det är känt att celler av XXY inte kan passera genom meios och bilda gameter. Trisomi är också i stånd att orsaka en minskning av proliferativ aktivitet av hybridceller, vilket resulterar i en selektiv fördel i utvecklingen av chimärer kan tillhöra cellerna hos mottagaren embryot. Följaktligen är det nödvändigt att erhålla hybridkloner med en normal diploid uppsättning kromosomer för att på ett adekvat sätt utvärdera hybridcellens pluripotenta potential.

I experiment Serova O. Et al (2001) visade första möjligheten att omprogrammera X-kromosomen i genomet hos en somatisk cellhybridcell. Denna slutsats följer av författarna analysera uttrycket av chimärer hprt-genen (X-kromosommarkör): närvaron av alleliska varianter hprt DD / c-möss detekterades i alla vävnader som analyserats chimär. Det bör understrykas att efter införandet av hybridceller i blastocyst hålighet tsitogibridy faller i icke-selektiva betingelser och bevarandet av X-kromosomen i genomet hos hybridcellerna innebär att det har blivit en obligat komponent i dess genom och diskriminerar inte den från Y-kromosomen pluripotenta partner.

Sammanfattning av resultaten av analys av interaktionen av somatiska och pluripotenta embryonala genomet i hybridcellerna, författarna menar att, i vissa tsitogibridah pluripotens visas som en dominant egenskap. Hybridgenen kan individuella kromosomer programmera differentierade celler, vilket emellertid inte hindrar den omvända effekten på den somatiska genomet pluripotens av embryonala genomet. Vid odling av hybridceller sker induktion av differentiering mycket oftare än i ESC NM-1: s ursprungliga moderlinje. En liknande effekt observeras i bildandet av primära kolonier: många primära kolonier av embryonala hybridceller differentierade i de tidiga stadierna av utbildning med stor förlust av kloner under deras uppfödning och fortplantning.

Sålunda, tsitogibridy genom en sammanslagning av ESC med somatiska celler, trots den nära kontakten med genomet av differentierade celler bibehåller pluripotens som en unik egenskap hos den embryonala genomet. Vidare är det i sådana hybridceller möjligt att omprogrammera individuella kromosomer härrörande från de diffunderade cellerna. Det är fortfarande oklart hur väl bevarade plyu- ripotentnye egenskaperna hos embryonala genomet i hybridcellerna, i synnerhet, deras förmåga att delta i bildningen av könslinjen chimärer. För detta är det nödvändigt att erhålla embryonala hybridceller med en normal karyotyp. I varje fall kan de pluripotenta embryonala hybridceller vara en riktig modell för genetisk identifiering av kromosomer involverade i upprätthållandet av pluripotens eller hennes kontroll som bilateral segregering av föräldra kromosomer ger potentiellt en sådan möjlighet.

Inte mindre attraktiva är fenomenet av studien, vilket Serov G. Et al (2001) definieras som "kromosomal minne." I hybrid genomet homologa kromosomer är två alternativa konfigurationer: homologer somatisk partner en gång genomgått differentiering, medan homologer pluripotenta partner, denna process precis börjat. Därför upprätthålla höga pluripotenta egenskaperna hos hybridceller indikerar att "pluripotenta" konfigurationshomologer ESC ganska stabila i hybrid genomen, trots effekterna av transdeystvuyuschih faktorer som härrör från den somatiska partner. De ovan beskrivna egenskaperna hos omprogrammering differentierade homolog genom kromosomer under utveckling av chimärer utesluter inte möjligheten att de första stegen i bildandet in vitro och odling tsitogibridov de behåller sin status som förvärvats under differentiering in vivo. Enligt de senaste uppgifterna vid överföringen av embryonala hybridcellerna i icke-selektivt medium, i vilket det finns en intensiv endast eliminerings kromosomer somatisk partner, dvs genomet hos hybridceller diskriminerar lätt homologer efter in vitro-odling i 10-15 passager. Sålunda, embryonala hybridceller representerar en lovande experimentell modell för studien inte bara av de grundläggande egenskaperna hos embryonala genomet som pluripotens, men också dess alternativ - embryonal differentiering.

Terapeutisk effekt av embryonal stamcellstransplantation

Innan vi analyserar den terapeutiska effekten av ESC-transplantation och deras derivat sammanfattar vi ovanstående material. Funktioner ESC när det gäller ett fullständigt genomförande av embryogenes in vitro är otillräckliga på grund av brister i det här fallet på grund av frånvaron av mesenkymala stamceller som förekommer i kroppen självständigt och oberoende av hESCs. Genetisk styrkan ESK mindre genetiska potential zygoter därför direkt för kloning embryon ESC används inte. ESC: s unika biologiska potential som de enda cellerna i vilka utvecklingsprogrammen distribueras i full följd finns i studier om generens funktion. Med hjälp av ESC, dechiffreras de första kombinationerna av signaler som aktiverar uttrycket av tidiga och sena gener som kodar för utveckling av tre embryoniska lakan. Bevara genomet pluripotens av ESCs in vitro gör dem unikt verktyg för reparation regenerering som automatiskt kan kompensera för cellförluster skadade organ och vävnader. I en idealisk hypotetisk utförande kan anta att "... Vid transplantation av givar PGCs i mottagarorganismen överförs kompakt förpackade program som under gynnsamma förhållanden realiseras i byggandet av nya tkani'7 kan" ... Effektivt integreras i mottagarens kropp som morfologiska, både funktionella och funktionella. "

Naturligtvis, efter att ha utvecklat metoder för monodifferentiering av ESC, började in vivo-studien av den funktionella aktiviteten hos celler erhållna in vitro från en enda specialiserad klon. ESCs prolifererande klon befolkningen genererar migrerande stamceller, kan faktiskt aktivt införlivas i mottagaren vävnadsskada zon som används i regenerativ medicin och plast. Det har fastställts att transplantation av Dopa-neuroner i substantia nigra minskar kliniska manifestationer i experimentell hemiparkinsonism. Regionala transplantationer av donor-neurala stamceller minskar graden av motoriska störningar som orsakas av trauma eller kontusion av ryggmärgen och hjärnan. Mottagna och de första positiva resultaten av stamcellstransplantation vid demyeliniserande sjukdomar. Det verkar som om ESC: arnas regenererande-plastpotential öppnar obegränsade möjligheter att använda celltransplantation i praktiskt läkemedel. Men när de transplanteras i ektopiska zoner, omvandlas ESC oundvikligen till tumörer. När subkutan injektion av ESC i immundefekt möss teratom bildas. När ESK-suspensionen transplanteras under testikelns kapsel i syngene möss bildas också ett teratom bestående av olika vävnader, vars celler härrör från alla tre embryonala broschyrer. I sådana teratomer är processerna med reducerad organogenes extremt sällsynta.

I ett antal studier ger information om de positiva resultaten av tidiga transplantations derivat ESC djur med experimentellt ex-patologi. Cellneurotransplantation med användning av derivat av PGCs utvecklas ytterligare i experimentet och de första kliniska prövningar av korrigering av funktionsstörningar i hjärnan och ryggmärgstrauma, behandling av syringomyelia och multipel skleros (Repin, 2001). Med tillkomsten av tekniken neyronogeneza ESCs in vitro, istället för att använda embryonala hjärnvävnadstransplantationstekniker som utvecklats derivat av neurosfärer, erhållna från kulturer av embryonala neural vävnad. Sådana transplantationssuspensioner är mycket mer homogena och innehåller engagerade neuronala och neurogliaprekursorer.

Utöver den normalt odlingsmedium med retinsyra vid en dos av 10 ug / ml i 6 veckor i embryonala linjer (teratom) NTERA-2 humant -kartsinomy bildas över 80% av post-mitotiska neuroner. Den fullständiga homogenitet neuronala befolkningen uppnås genom flödessortering märkta immunophenotypic markörer för mogna nervceller som kan bli av med resterna teratokartsinomnyh och omogna celler. Efter transplantation i olika regioner i hjärnan hos försöksdjur överlever sådana neuroner inte bara, men är också inbyggda i regionala neurala nätverk. I djur med experimentella modeller av lokala defekter CNS neurotransplantation reducerar kliniska manifestationer av human patologi såsom effekterna av kraniocerebralt trauma, stroke, demyeliniserande sjukdomar, ärftliga cerebellära defekter utveckling, sjukdomar avsättning av lipider och polysackarider.

För att optimera regenereringsprocesserna i degenerativa sjukdomar i centrala nervsystemet utvecklas tekniker för framställning av myelinproducerande oligodendrocyter från ESK. Det första steget involverar traditionellt spridningen av ESC med multiplikationen av antalet celler som är nödvändiga för transplantation. I det andra steget utförs riktad differentiering av celler till en population av myelinproducerande oligodendrocytprekursorer, vilken styrs av selektiva markörantigener.

Vissa utsikter öppnas för använda derivat ekonomiska och sociala råd att utveckla metoder för korrigering av immun orsakas av genetiska defekter i mognaden av tymus. I studier på knockout (rag 1) möss med inducerad gendefekt - överträdelse rekombination mekanism V (D) J-genloci TCR, som leder till förlust av funktion av T-lymfocyter, transplantations tidiga derivat av PGCs i tymus djur återvinner mognad av normala populationer av immunkloner som är ansvariga för cellulär immunitet. Kliniska försök med transplantation av förformad in vitro-ESK för behandling av dödlig ärftlig anemi hos barn utförs.

Invändningar mot den snabba införandet av stamcellstransplantation i kliniken är motiverade av ett begränsat antal stabila linjer av mänskliga embryonala stamceller och behovet av standardisering. För att öka renheten hos standardiserade ESC-linjer, såväl som vuxna stamceller, föreslås det att använda metoden för linjevaluta baserat på molekylärgenetisk analys av korta tandemrecept av DNA. Det är också nödvändigt att kontrollera ESC-linjerna för närvaro av små kromosomala omarrangemang och genetiska mutationer, den potentiella möjligheten att deras förekomst under betingelser av cellodling är tillräckligt hög. Thesis sträcker obligatoriskt att testa egenskaperna hos alla typer av PGCs och regionala pluripotenta stamceller, eftersom deras utbredning in vitro kan ge upphov till nya egenskaper inte inneboende i embryonala stamceller för att definitivt eller vävnader. I synnerhet är det antas att långsiktig odling i media med cytokiner HESS närmare tumörcellerna, eftersom de förekommer liknande förändrings vägar som reglerar cellcykeln med förvärvet av förmågan att genomföra ett obegränsat antal celldelningar. Vissa författare, på grundval av potentialen för tumörutveckling, anser att mänsklig transplantation av tidiga derivat av embryonala stamceller som hänsynslöshet. Enligt deras åsikt är det mycket säkrare att använda ESC: s anförda ättlingar, det vill säga linjerna för förfäderna för differentierade celler. En tillförlitlig teknik för att erhålla stabila humana cellinjer som skiljer sig åt i rätt riktning har emellertid ännu inte utvecklats.

Således finns i litteraturen allt fler data om den positiva terapeutiska effekten av transplantation av humana embryonala stamcellderivat. Men många av dessa arbeten är föremål för revision och kritik. Vissa forskare tror att resultaten av tidiga kliniska prövningar är preliminära och föreslår att stamceller kan ha en positiv effekt på den kliniska kursen av en sjukdom. Därför är det nödvändigt att erhålla data om de långsiktiga resultaten av celltransplantation. Som ett argument ges utvecklingsstadierna för klinisk neurotransplantologi. Indeed, i litteraturen, inledningsvis domineras av offentliggörandet av den höga effektiviteten av de hjärn transplantationer fragment av embryon i Parkinsons sjukdom, men sedan började dyka rapporter förnekar terapeutiska effekten av embryonal eller fetal neural vävnad transplanteras in i hjärnan hos patienter.

Genomfört de första kliniska prövningarna för fastställande av säkerhet av transplantationsneuroblast - derivat av PGCs NTERA-2 teratokarcinom ades omogna celler som prolifererar i odling utsattes för lagring 100 miljonte cellmassa. En del av de sålunda erhållna cellerna användes för att bestämma egenskaperna hos cellfenotyp och föroreningar, samt för att testa potentiella kontamination av virus och bakterier. Från odlingsmediet avlägsnades LIF och matarskikt av stromaceller och fetala skapat förutsättningar för riktad differentiering av hESCs till neuroblaster med en kombination av cytokiner och tillväxtfaktorer. Renades därefter från omogna neuroblaster teratokarcinomceller genom en flödescellsorterare. Efter den andra rening och karaktärisering av fenotypen av transplanterade celler neuroblaster (10-12 miljoner kronor) suspension med en speciell spruta och microcannulas stereotaxi och under kontroll av CT injiceras i nucleus basalis av hjärnan hos patienter (den sjunde månaden efter hemorragisk stroke). Odnogodovoy efter transplantation screening effekterna av transplantation av nervceller i slaget zonen avslöjade inga negativa och oönskade effekter. Hälften av patienterna upplevde en förbättring av motorfunktionen under perioden 6-12 månader efter transplantation. Positiva kliniska förändringar åtföljdes av en ökning av blodtillförsel slagzonen efter transplantation av celler: genomsnittlig ökning av fluorescensmärkt 2-deoxiglukos absorption, enligt positronemissionstomografi nådde 18%, och i vissa patienter - 35%.

Men USA: s nationella institut för hälsa genomförde en självständig studie av den kliniska effekten av neurotransplantation hos patienter med Parkinsonism. Patienter i den första gruppen transplanterades med embryonala nervvävnadsproducerande dopamin medan den andra gruppen av patienter fick en falsk operation. Resultaten indikerar en nollklinisk effektivitet av sådan neurotransplantation, trots det faktum att dopaminproducerande embryonala neuroner överlevde i mottagarens hjärna. Dessutom, efter 2 år efter transplantation av fetal neural vävnad i 15% av patienterna utvecklade ihållande dyskinesi, som är frånvarande i patienter i placebogruppen (Stamceller: vetenskapliga framsteg och framtida forskningsinriktningar Nat Inst, hälso USA ...). Observationer av den vidare utvecklingen av sjukdomen hos dessa patienter fortsätter.

Vissa författare tillskriver den motsägelse litteraturen om utvärderingen av kliniska effektivitet neurotransplantation data med en annan inställning till valet av patientgrupper, otillräcklig val av objektiva metoder för bedömning av deras tillstånd och, viktigast av allt, olika termer av utveckling av vävnaden fetal nervösa och i olika delar av hjärnan från vilket tyget producerades i olika storlekar transplantation och metodiska egenskaper vid operationen.

Det bör noteras att försök att rikta transplantation av pluripotenta embryonala stamceller i striatala regionen i hjärnan hos råttor med experimentell kropp gemiparkinsonizmom åtföljs ESC proliferation och deras differentiering till dopaminerga neuroner. Det måste antas att de nybildade nervceller effektivt inbyggd i det neuronala nätverket som ESCs efter transplantation observerades korrigering av anomalier i beteende och motor asymmetri i apomorfin test. Samtidigt dog vissa djur till följd av omvandlingen av transplanterade hESCs i en hjärntumör.

Experter från US National och Medical Academy, specialister av National Institutes of Health tror att den kliniska potentialen av hESCs förtjänar seriös uppmärksamhet, men insisterar på att det behövs en detaljerad studie av deras egenskaper, sannolikheten för komplikationer och långsiktiga effekter i experiment med adekvata biologiska modeller för mänskliga sjukdomar (Stamceller och framtida regenerativ medicin National Academy Press,. Stamceller och framtida forskningsinriktningar Nat Inst, hälso USA)...

Ur denna synpunkt är det viktigt att den jämförande histologisk analys av experimentell teratom erhållen genom transplantation i testikelflyt PGCs med teratom som har utvecklats på grund av transplantation tidiga embryot, som omfattade också närvarande ESC visade att ESK oavsett ursprung eller interaktion med av de eller andra omgivande cellerna på samma sätt inser deras tumörgeneriska förmågor. Det visat sig att sådana teratom har en klonal ursprung, såsom från en tumör ESCs kan förekomma, som består av de derivat av alla tre germinallager (.Rega, 2001). Det är anmärkningsvärt att vid transplantation i immundefekta möss klonade PGCs med normal karyotyp och formade teratom bestående av en mängd olika typer av differentierade somatiska celler. Dessa experimentella data är det perfekta beviset på teratomens klonala ursprung. Ur utvecklingsbiologi, föreslår de att det inte är multipel av engagerade stamfaderceller och pluripotenta stamcellidentiteten är källan till differentierade derivat av alla tre germinallager, teratom komponenter. Emellertid, i de praktiska celltransplantations resultaten av dessa studier är, om inte oöverkomlig, då en varningssignal om potentiell fara, eftersom inokulering ESC eller primordiala könsceller i olika vävnader hos vuxna möss med immunbrist orsakar oundvikligen utvecklingen av tumörer från de transplanterade stamceller. Neoplastisk degeneration ektopiskt transplanterade ESC åtföljs av uppkomsten av satellit populationer av differentierade celler - genom att delvis differentiera är förvisso ESCs och stamfader kloner dedikerade linjer. Det är intressant att transplantations hESCs i skelettmuskelceller närheten teratokartsinomnymi nervceller bildas oftare. Men i administrerar PGCs Mace ägg eller blastocyst tillsammans med fullständig integrering i könscellerna utan bildandet av neoplastiska celler. Samtidigt ESC inbäddade i nästan alla organ och vävnader i embryot, inklusive sexuell rudiment. Sådana allofennye djur framställdes först genom att utsätta teratokarcinom cellen 129 i de tidiga stadierna av embryon vid 8-100 celler. I allofennyh möss populationer geterogenomnyh-cellerna donator PGCs införs i benmärgen, tarm, hud, lever och könsorgan, som gör det möjligt att skapa i försöket även interspecies cell chimärer. Ju mindre tiden för tidiga embryot, desto högre procent cell chimerisering, den högsta graden chimerisering observeras i det hematopoietiska systemet, hud, nervsystemet, lever och tunntarm allofennogo embryo. I den vuxna organismen vävnaden mottaglig chimerisering skyddas från exponering för immunsystemet av de mottagande gistogematicalkie barriärer: transplanterade primordial könsceller i testiklarna parenkymet åtföljd av insättning av donatorstamceller i mottagaren vävnads germenativny skikt. Emellertid ESC transplantation in i en blastocyst bildnings chimära primordia genitalier med generation donator primordial könsceller uppträder ej. ESC pluripotens vid skapande av särskilda villkor och kan användas för kloning: ESC transplantations möss 8-16-cell musembryo, cellmitos vari tsitokalazinom blockerad, bidrar till den normala embryogenes med utvecklingen av de embryodonator PGCs.

Följaktligen, är ett alternativt transplantation av allogen ESC terapeutisk kloning baserad på somatisk cellkärntransplantation in i en enukleerad oocyt för att skapa en blastocyst inre cellmassan från vilken sedan fördelas linje genetiskt identiska donator PGCs somatisk nucleus. Tekniskt sett är denna idé genomförbar, eftersom möjligheten att skapandet av hESC linjer från blastocyster erhållna efter transplantation av somatiska kärnor till enukleation äggcell upprepade gånger visat i försök på laboratoriedjur (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Särskilt i möss homozygota för mutationen rag2, fibroblaster erhållas genom odling subepidermala vävnadsceller användes som donatorkärnor transplanteras in enukleerade oocyter. Efter aktivering, oocyter "zygot" odlades tills blastocyst bildning, från den inre cellmassan är isolerade PGCs och passerar dem i en linje för de mutanta genen nullizigotnyh celler (rag2 ~ / ~). Genom homolog rekombination i sådana PGCs att korrigera en mutation av en allelisk gen. I den första serien av experiment från hESCs utvunna rekombinant gen embryoidkroppar bereddes, transfekterade celler därav med ett rekombinant retrovirus (HoxB4i / GFP) och efter förökning i möss injicerade vein rag2 ~ / ~. I den andra serien tetraploida blastomeres aggregerade med genetiskt modifierade hESCs och transplanterade dem till en mottagare hona. Födda immunkompetenta möss var benmärgsdonatorer för transplantation mutanta möss rag2 ~ / ~. I båda serierna, var resultatet positivt: 3-4 veckor i alla möss i normala mogna myeloida och lymfoida celler har visat sig kapabel att producera immunoglobuliner. Sålunda kan transplantation till oocyten kärnor av somatiska celler inte bara användas för att producera hESC linjer, men också för tsitogenoterapii - Korrigering av ärftliga abnormiteter med användning av ESC som en vektor för transport av korrigera genetiska informationen. Men i denna riktning mot celltransplantation, förutom bioetiska problem, finns det begränsningar. Är det inte klart hur säkert transplantationen skulle terapeutiskt klonade celler med en genotyp identisk med genotypen hos en särskild patient, eftersom sådana celler kan introducera mutationer som skapar en predisposition för vissa sjukdomar. Normala mänskliga ägg förblir otillgängliga objekt, medan även när transplantera somatiska kärnor i enukleation djur äggcell endast 15-25% konstruerad "zygot" utvecklas till blastocyststadiet. Således är det inte definieras hur många blastocyster krävs för att få en rad av pluripotenta klonade hESCs. Det bör noteras, och en hög nivå av finansiella kostnader i samband med komplexiteten i metodiken för terapeutisk kloning.

Avslutningsvis, i ESC pluripotens genomet hypomethylated DNA kombineras med hög telomerasaktivitet och kort C ^ cellcykelfasen, som säkerställer intensiv och potentiellt infinita multiplikationsfaktorn, under vilken PGCs bibehåller diploida kromosomer och "juvenil" uppsättning av fenotypiska egenskaper. Klonal tillväxt av PGCs i kultur hindrar inte dem differentiera till någon specialiserad cell av organismen vid en stopplinje proliferation och tillsats av lämpliga regulatoriska signaler. Restriktions differentiering av hESCs i linje in vitro somatisk cell realiseras utan deltagande av mesenkymet, förbi Nohteyaov, är organogenes och utan bildning av embryot. Ektopisk administrering av ESC in vivo leder oundvikligen till bildandet av teratokarcinom. ESC transplantation till en blastocyst eller tidigt embryo tillsammans med deras integration med vävnaderna hos embryot och dess stabila chimerisering organ.

Regenerativa och plastteknik som baseras på celltransplantation är skärningspunkten mellan intressen medlemmar av cellbiologi, utvecklingsbiologi, experimentella genetik, immunologi, neurologi, kardiologi, hematologi, och många andra områden av experimentell och praktisk medicin. De viktigaste experimentella resultat bevisar möjligheten att omprogrammera stamcellerna med riktningen för förändring av deras egenskaper, vilket öppnar nya perspektiv för styrning cytodifferentiation processer med tillväxtfaktorer - för myokardial regeneration, återställande av CNS lesioner och normalisering av funktionen hos holmen apparaten i bukspottkörteln. Emellertid är allmänt införande transplantations derivat ESC i medicinsk praxis som krävs för att undersöka egenskaperna hos humana stamceller i mer detalj och ytterligare experiment med PGCs i experimentella modeller av sjukdomar.

Bioetiska frågor och problem för avstötning av allogena celltransplantation skulle kunna lösa den observerade plasticitet av genomet regionala adulta stamceller. Emellertid är den initiala informationen att när transplantera levern isolerade och grundligt känne autologa hematopoietiska celler, av vilka det finns nya hepatocyter, försedda in i de hepatiska lobules, håller nu på att granskas och kritiseras. Emellertid publicerade data att transplantation av neurala stamceller i tymus är bildandet av nya groddar av donator-T-och B-lymfocyter, och transplantera neurala stamceller i hjärnan i benmärgen leder till bildningen av hematopoietiska grodden upprättdonator myeloida och erytropoies . Följaktligen i vuxna organ kan bevaras pluripotenta stamceller som kan genom omprogrammering av ESC kapacitet.

Det mänskliga embryot är källan till att ta emot ESC för medicinska ändamål, vilket förutbestämmer oundvikligheten för en ny korsning av moraliska, etiska, moraliska, juridiska och religiösa problem vid livets födelse. Upptäckten av ESC gav en kraftfull impuls till återupptagandet av hårda diskussioner om var linjen mellan levande celler och materia, substans och personlighet ligger. Samtidigt finns det inga universella normer, regler och lagar om användning av ESC i medicin, trots upprepade försök att skapa och acceptera dem. Varje stat i sin lagstiftning löser detta problem på egen hand. För sin del fortsätter läkare från hela världen att försöka utveckla regenerativ plastmedicin utöver sådana diskussioner, främst genom användning av icke-embryonala stamceller och stamcellsreserver hos en vuxen organism.

Några av historien om embryonal stamcellerisolering

Terato- (embryo) -celler isolerades från -kartsinomnye spontant förekommande testikel teratom musstammen 129 / ter-Sv, spontana äggstocks teratom muslinjer Lt / Sv, och från teratom, ektopichno källa var transplanterade celler eller embryonal vävnad. Bland sålunda erhållna terato- stabila muslinjer (embryo) -kartsinomnyh vissa celler är pluripotenta, andra utsattes för differentiering endast i celler av en viss typ, och några har varit generellt oförmögna att cytodifferentiation.

På den tiden låg fokus forskning som visade en möjlig avkastning terato- (embryo) -kartsinomnyh celler till normal fenotyp efter deras introduktion i det utvecklande embryot vävnad, liksom arbetet med att skapa in vitro genetiskt modifierad terato- (embryo) -kartsinomnyh celler, med hjälp av vilka mutanta möss erhölls för biologisk modellering av mänsklig ärftlig patologi.

Konditionerad suspensionskultivering användes för att isolera linjerna av terato-embryo-karcinomceller. I kultur terato- (embryo) -kartsinomnye celler, som ESC, växa för att bilda embryoidkroppar och kräver att översättas till en linje bindande dissociation bibehålla pluripotens på en matarskikt av embryonala fibroblaster eller suspension odling i konditionerat medium. Terato- pluripotenta celler (embryo) - karcinoma linjer stora, sfäriska, har en hög aktivitet av alkaliskt fosfatas, bildar aggregat och är kapabla att flera riktningar differentiering. När den införs i en blastocyst aggregeras med morula, resulterande i bildningen av chimära embryon, i de olika organ och vävnader vilka derivat har hittats terato- (embryo) -kartsinomnyh celler. Emellertid, den stora majoriteten av sådana chimära embryon dör i livmodern, och i organ överlevande chimärer nyfödda främmande celler och sällan detekteras med en låg densitet. Samtidigt inträffar incidensen av tumörer (fibrosarkom, rabdomyosarkom, och andra typer av maligna svullnad och adenom Bukspottkörtel) skarpt ökar, och neoplastisk degenerering ofta till och med in utero chimära embryon.

De flesta av terato- (embryo) -kartsinomnyh celler i mikromiljön av normala embryonala celler blir nästan naturligt maligna neoplastiska egenskaper. Man tror att irreversibel malignitet beror på aktiveringen av protokogener vid strukturella omarrangemang. Ett undantag är de cellinjer embriokartsinomnoy SST3, teratom härledd från murin testikel (line 129 / Sv-ter), som uppvisar en hög förmåga att integreras in i vävnaden och organ hos fostret utan efterföljande bildning av tumörer i chimära möss. Derivat terato- (embryo) -kartsinomnyh cellinjer i möss chimärer nästan inte deltar i bildandet av primära gonocytes. Uppenbarligen är det i samband med en hög frekvens av kromosomavvikelser som är gemensamma för de flesta terato- (embryo) -kartsinomnyh linjer i vilka celler som observerats som aneuploidi eller kromosomal anomali.

Flera stabila terato- linjer (embryo) -kartsinomnyh human cell framställdes under laboratorieförhållanden, känne pluripotens, hög proliferativ aktivitet och förmåga att differentiera i kultur under tillväxt. I synnerhet användes linjen av humana terato-embryo-karcinomceller NTERA-2 för att studera mekanismerna för neuralt cytodifferentiering. Efter transplantation av celler av denna linje i subventrikulärregionen hos förekomsten av nyfödda råttor observerades deras migrering och neuronogenes. Det har varit ännu försök att transplantera neuronal terato- erhållits genom odling av celler (embryo) -kartsinomnoy linje NTERA-2, till patienter med stroke, vilket, enligt författarna, vilket leder till klinisk förbättring av sjukdomen. I detta fall noterades fallen av malignitet hos transplanterade celler av terato-embryo-karcinomlinjen NTERA-2 hos patienter med stroke.

Den första raden av odifferentierade pluripotenta embryonala stamceller från möss i början av 80-talet av förra århundradet fick Evans och Martin, genom att välja dem från den inre cellmassan av en blastocyst - embryoblast. Den isolerade PGCs raden under lång tid bibehålla pluripotens och förmågan att differentiera till olika celltyper under påverkan av faktorer speciella odlingsmedium.

Termen "embryonal pluripotent stamcell" tillhör Leroy Stevens att undersökningen av slagtobakstjära på frekvensen av tumörutveckling uppmärksammade förekomsten av spontana testikel teratokarcinom av linjär (129 / v) av möss i kontrollgruppen. Testikel teratokarcinomceller karaktäriserades av en hög proliferationshastighet, och i närvaro av vätska kvar i bukhålan med bildandet av spontan differentiering av neuroner, keratinocyter, kondrocyter, kardiomyocyter, samt hår och benfragment, men utan någon indikation på en ordnad cytoarchitectonics lämplig vävnad. Vid plantering i teratokarcinom cellkultur odlad ofastade vid substratet pluripotenta klonerna och bildade embryoidkroppar därefter snabbkyldes och utsattes för spontan fission oordnad differentiera till neuroner, glia, muskelceller och kardiomyocyter. Stevens fann att teratokarcinom mus 129 / vol innehåller mindre än 1% av celler som kan differentiera till en mängd specialiserade somatisk linje, och själva differentiering beror på faktorer som påverkar dem (komposition peritonealvätska, de produkter som tillsätts till kulturen av mogna celler eller vävnader). Leroy Stevenson antagande om närvaron bland teratokarcinomceller embryonala stamfader sexuella könsceller bekräftades: suspensionen embryoblast preimplantationsembryon celler i vuxna musvävnader bildade teratokarcinom, och separeras från dem rena cellinjer efter intraperitoneal administrering till mottagande djur hade differentierat till neuroner, kardiomyocyter och annan somatisk kletki derivat av alla tre germinallager. I experiment in vivo transplantation ESK (erhållen från embryoblast men inte trofoblaster) i musembryon vid olika stadier linjerna 8-32 blastomer slutade födelse av den chimära djuret (ingen tumörbildning) i organ som detekterar groddar donatorvävnad. Chimerism observerades även i raden av könsceller.

Primära stamfaderkönsceller isolerade från musembryo groddar kön, morfologi, immunologisk fenotyp och funktionella egenskaper som överensstämmer med hESCs härledda från teratokarcinom Stevenson och embryoblast. Vid chimärer födda efter administrering av hESCs i en blastocyst, allofenny organ morfogenes känne mosaik alternerande givare och mottagare strukturella och funktionella enheter i lever, lunga och njure. I vissa fall den observerade bildningen av tarm kryptor eller leverskivor, bestående av både donator- och mottagarceller. Men genomförandet av morfogenes alltid förekommit på den genetiska program av formen, som tillhörde mottagaren och chimerism begränsades av en cellulär nivå.

Sedan visade det sig att spridningen av hESCs utan cytodifferentiation på ett matarlager mesenchymala celler (fetala fibroblaster) sker i närvaro av LIF-bindning i selektiva näringsmedier som selektivt tillhandahåller endast överlevnad stam- och progenitorceller, medan den stora majoriteten av de specialiserade cellulära element dör. Med hjälp av dessa tekniker 1998 av James Thomson tilldelades fem odödliga rader av embryonala stamceller från den inre cellmassan av en blastocyst person. Samma år, har John Gerhart utvecklat en metod för att isolera de odödliga ESC linjer från sexuellt puff av 4-5 veckors mänskliga embryon. På grund av dess unika egenskaper, bara två år senare embryonala stamceller och stamceller definitiva vävnad har börjat användas i praktiken av regenerativ medicin och genterapi.