Embryonala stamceller

Upptäckten av embryonala stamceller uppstod inte av en slump, utan dök upp på den förberedda marken för vetenskaplig forskning inom utvecklingsbiologi. Termen "stamcell" introducerades inom medicinen 1908 vid hematologiska sällskapets kongress i Berlin av Alexander Maximov i relation till hematopoetiska celler. Långt före isoleringen och produktionen av stabila linjer av pluripotenta embryonala stamceller användes stamterato- (embryokarcinom) celler i studier av tidiga utvecklingsprocesser, med hjälp av vilka okända mekanismer för embryogenes studerades, inklusive uttryckssekvensen av tidiga gener och proteinprodukter av deras aktivitet.

Men går det mänskliga genomets totipotens oåterkalleligt förlorad i evolutionsprocessen? Nej, och embryogenesen är ett bevis på detta. Om så är fallet, när kommer då i princip den andra vägen för evolutionär utveckling att förverkligas? Förmodligen när människan kommer in i rymden, där miljöförhållandena kommer att vara relativt konstanta under en tillräckligt lång tid. Förlusten av benvävnad (demineralisering av ben i ett tillstånd av viktlöshet), som mycket långsamt genomgår ombyggnad och regenerering, kan betraktas som det första steget i processen för människans anpassning, som art, till existens i rymdförhållanden. Priset för den andra vägen för evolutionär utveckling kommer dock att vara annorlunda - priset för återkomsten av totipotens och absolut plasticitet till alla celler kommer att vara sterilitet. Så i denna värld av "evolutionära kameleonter" måste vi reproducera oss utan meios, genom knoppning. Men vi kommer att leva länge. Telomerasodödlighet är en amöbas odödlighet. I en flercellig organism är stamceller substratet för kvantitativ och kvalitativ livslängd.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Källor till embryonala stamceller

Idag är källorna till embryonala stamceller för laboratorieforskning mus-teratokarcinomlinjer (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) och humant teratokarcinom (NTERA-2, TERA-2, H-9-klon), såväl som Trauneon ESC-linjer. Tillgången till ett detaljerat cellpass som anger immunfenotypen, resultat av kromosomanalys, mRNA-uttrycksprofiler, exponerade receptorer och intracellulära signalproteiner kompenserar dock inte för de betydande bristerna hos teratokarcinom-ESC-linjerna - snabb förlust av totipotens och omöjligheten att använda dem i kliniska prövningar, medan blandad differentiering i kultur gör det mycket svårt att isolera en ren specialiserad linje från en heterogen cellpopulation. Därför är källan till ESC-linjer som skapas för kliniska ändamål vanligtvis blastocystens inre cellmassa, individuella blastomerer från 8-celliga embryon, morulaceller i senare stadier, såväl som primordiala könsceller.

Det bör noteras att teratokarcinomceller, även om de har egenskapen pluripotens, kännetecknas av en signifikant lägre pluripotent potential jämfört med ESC. Deras integration med embryonala celler leder sällan till bildandet av chimärer, vilka dessutom aldrig bildar gameter med genotypen av teratokarcinomceller. Man tror att detta beror på den frekventa förekomsten av kromosomavvikelser under odling av teratokarcinomceller: förlust av Y-kromosomen, olika trisomier, deletioner eller translokationer.

Försök att isolera en mänsklig ESC-linje har gjorts upprepade gånger, men denna uppgift har inte lösts, eftersom normala mänskliga blastocyster är svåra att få tillgång till. Dessutom är frekvensen av kromosomavvikelser hos människor högre än vid djurembryogenes. Den överväldigande majoriteten av tidiga mänskliga embryon som erhålls efter in vitro-fertilisering uppvisar kaotisk kromosommosaik och har ofta numeriska och strukturella avvikelser. Ännu senare, i blastocyststadiet, består endast 20-25 % av mänskliga embryon av celler med normal karyotyp. Det var praktiskt taget omöjligt att använda sådana embryon för att skapa ESC, eftersom zygoter vanligtvis odlades till två- eller fyrablastomerstadiet och sedan transplanterades in i livmodern. Först relativt nyligen har en tillförlitlig teknik för att odla befruktade mänskliga ägg till blastocyststadiet utvecklats. Införandet av denna teknik i in vitro-fertilisering har inte bara ökat frekvensen av framgångsrika implantationsresultat, utan har också gjort normala blastocyster till ett mer tillgängligt objekt.

En annan pluripotent stamcellskälla är de primordiala könscellerna, som till skillnad från de mer avancerade progenitorpopulationerna i germinalepitelet inte har beta-integrin på sin yta, men uttrycker hög aktivitet av alkaliskt fosfatas. Det bör noteras att populationer av stamceller som bildats från primordiala könsceller har studerats experimentellt sedan 1980-talet. Vid den tiden utvecklades en teknik för att isolera primordiala könsceller från rudimentet av musembryots gonad. De första misslyckade resultaten av att odla primordiala könsceller in vitro antydde att dessa försök var meningslösa, eftersom cellerna, även om de överlevde, inte prolifererade och dog inom den första dagen. Det fastställdes senare att musens primordiala könsceller reproducerar sig in vitro endast i närvaro av lösliga och membranbundna specifika polypeptidtillväxtfaktorer i odlingsmediet. Resultaten av ett flertal studier har visat att för överlevnad och proliferation av primära könsceller är närvaron av inte bara LIF utan även membranbundna och lösliga stålfaktorer (SIF) i odlingsmediet nödvändig. Dessa peptider produceras av somatiska celler från embryon som är homozygota för Steel-mutationen, och en av dem är en ligand till cKit-proto-onkogenen.

Primära könsceller hos däggdjur och människor har ett extragonadalt ursprung och är källan till klonal utveckling av könscellslinjen. Ursprunget för den primordiala könscellslinjen, liksom alla embryonala vävnader och det extraembryonala mesodermet, är epiblasten (primär ektoderm) hos tidiga embryon, som har en mosaikstrukturorganisation. Med hjälp av metoden för mikrokirurgiskt avlägsnande av olika delar av det tidiga embryot etablerades en lokaliseringszon i epiblastens klon av engagerade prekursorer till primordiala könsceller. Med hjälp av rodamindextran, som användes som cellmarkör, fastställdes det att prekursorerna till primordiala könsceller är lokaliserade i epiblastens proximala region, nära det extraembryonala ektodermet. Den primordiala könscellslinjen härrör från en 45-cells klon, vars allokering sker i början av gastrulationen. Sedan segregerar klonen, och under gastrulationen går de primära könscellerna in i det extraembryonala mesodermet och återfinns vid basen av allantoisrudimentet, bakom den primära strimman. Därifrån migrerar de primära könscellerna mot den ventrala delen av baktarmendodermet och rör sig sedan aktivt längs mesenteriet och fyller de genitala åsarna i slutet av migrationen. Under migrationen, liksom under de första 2-3 dagarna av lokalisering i gonadrudimentet, prolifererar de primära könscellerna aktivt och genomgår åtta replikationscykler. Om det finns cirka 50 primära könsceller i början av migrationen, överstiger antalet primära könsceller 25 000 i genitala åsarna hos musembryon med tolv dagars utveckling.

Den funktionella likheten mellan ESC och primordiala könsceller bevisas av den fullständiga integrationen av de senare i blastocysten med ersättning av den interna cellmassan och efterföljande fullfjädrad utveckling av embryot, vars vävnader endast består av ättlingar till de primordiala könscellerna. I andra egenskaper visade sig även musens primordiala könsceller vara identiska med ESC, vilket visar förmågan att differentiera i en mängd olika riktningar, att bilda embryoidkroppar in vitro och att bilda teratom in vivo när de administreras subkutant till immunbristfälliga möss, vilket liknar spontana testikelteratom hos 129/ter-möss.

Det visade sig att när LIF, membranbunden och löslig SIF tillsätts till mediet, överlever och reproducerar sig isolerade primära könsceller från 8 dagar gamla musembryon i kulturen i 4 dagar, men dör sedan. Dessutom sammanfaller perioden då död av primära könsceller observeras i kulturen med utvecklingsstadiet för musembryon (12,5-13,5 dagar) då honliga primära könsceller går in i meios i gonadernas rudiment, och mitotiska delningar blockeras i hanliga primära könsceller. Men om inte bara tillväxtfaktorerna LIF och SIF, utan även FGF2, tillsätts till mediet, fortsätter de primära könscellerna att proliferera, och kolonier av celler som kan föröka sig även efter att tillväxtfaktorerna (SIF och FGF) har tagits bort från mediet bildas i subkulturerna. Sådana celler kan odlas under lång tid på ett substrat av embryonala fibroblaster utan att tillsätta den lösliga tillväxtfaktorn LIF. Det föreslogs att dessa stabila cellinjer erhållna från primordiala könsceller kallades embryonala könsceller. Denna term är inte alls framgångsrik, eftersom det är omöjligt att erhålla embryonala könsceller som kan utföra efterföljande steg av oogenes eller spermatogenes när man odlar EG-celler. Detta beror på att EG-cellinjer, även om de härstammar från primordiala könsceller, förlorar förmågan att binda sig till könslinjer, efter att ha förvärvat egenskaperna hos embryonala pluripotenta stamceller i kultur. Med andra ord förlorar primordiala könsceller, när de odlas, egenskaperna hos gametprekursorer och omvandlas till ESC-liknande pluripotenta celler.

Det har noterats att teratom inte uppstår när EG-celler introduceras i immunbristfälliga möss. Det antas att förlusten av mänskliga EG-cellers förmåga att ge upphov till teratom beror på att dessa linjer inte skapades direkt från odlade primära könsceller, utan erhölls från celler isolerade från embryoidkroppar. Därför är det möjligt att de är ättlingar till pluripotenta, men redan dedikerade celler.

Det bör noteras att det finns grundläggande skillnader mellan EG-celler och primordiala könsceller. De senare tillåter inte att man erhåller chimära musembryon, vilket indikerar bristande förmåga hos primordiala könsceller att integreras i den inre cellmassan eller trofektodermen. Egenskaperna hos den primordiala könscellspopulationen liknar mer de somatiska cellernas linjer från senare embryon, vars införande i blastocysten inte heller leder till bildandet av chimära embryon.

Modifiering av tekniken för att odla embryoidkroppar erhållna genom aggregering av EG-celler gjorde det möjligt att erhålla en annan population av pluripotenta celler, kallade "embryoidkroppsderiverade celler" (EBD-celler), med hjälp av selektion på selektiva medier. EBD-cellernas förmåga att proliferera i kultur under lång tid gjorde det möjligt att skapa stabila cellinjer av engagerade celler. Kloner av celler som uttrycker ett brett spektrum av mRNA- och proteinmarkörer från specialiserade celler erhölls. Denna metod bevisade slutligen att mänskliga primära könsceller är pluripotenta och differentierar in vitro till olika celltyper: neuroner, neuroglia, vaskulärt endotel, hematopoetiska celler, muskel- och endodermala celler.

Alternativa källor till embryonala stamceller

En alternativ källa till humana ESC-linjer kan vara hybridceller. Implantation i livmodern hos pseudo-dräktiga kor av en heterogen konstruktion erhållen genom fusion genom elektroporering av somatiska celler från det mänskliga fostret med ett kom från vilket pronukleus tidigare har avlägsnats gör det möjligt att erhålla en intern cellmassa från ett artificiellt embryo i pre-implantationsstadier av utveckling. För detta ändamål erhålls i det första stadiet en blastocyst från ett kom med en transplanterad mänsklig cellkärna.

I det andra steget isoleras en embryoblast från blastocysten, och från den isoleras ESC med Thomson-metoden. Det är anmärkningsvärt att de bästa resultaten för att isolera ESC-linjer med denna metod erhölls med hjälp av kärnor av follikulära celler eller primära könsceller som förblir i människokroppen i ett tillstånd av idle. Detta beror på att kärnorna i mänskliga celler som transplanteras in i ett komägg måste ha icke-förkortade telomerer och hög telomeasaktivitet, vilket hjälper till att undvika för tidigt åldrande av ESC-kloner erhållna från ett hybridägg (Repin, 2001). Det är känt att de viktigaste intracellulära markörproteinerna för ESC är Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, vilka tillhör de så kallade kromatin-tystnadsproteinerna. Tystnadsproteinerna ger ett särskilt kompakt paket av heterokromatin, vilket förhindrar bildandet av eukromatinöglor. Kromatinpaketering medierad av dessa proteiner korrelerar med ESC-genomets totipotens. Det har hittills fastställts att mogna bovina och mänskliga oocyter är den enda typen av specialiserade celler som innehåller höga koncentrationer av silencerproteiner i cytoplasman. Baserat på detta utvecklades en metod för att erhålla hybrid-ESC genom att överföra somatiska cellkärnor till enukleerade bovina oocyter. Preliminära in vitro-studier har visat att cytoplasman hos bovina oocyter återställer totipotensen hos genomet från den mänskliga somatiska cellkärnan efter 12–24 timmars odling.

Av särskilt intresse är data om särdragen i preimplantationsutvecklingen av mänskliga embryon, vilket indikerar en senare ersättning av totipotenta celler med en population av pluripotenta celler än hos möss. En studie av cellulära transformationer visade att trofoblastceller också uppstår från cellerna i den inre cellmassan hos mänskliga blastocyster, utöver ESC, vilket indikerar deras totala potens.

Det är känt att i blastocyststadiet uppstår två olika cellpopulationer. En av dem bildar blastocystens yttre lager - trofektodermet, vars derivat är trofoblastcellerna och andra embryonala komponenter i moderkakan. Den andra cellpopulationen grupperas till en tät massa som kommer i kontakt med trofektodermets inre yta. Derivaterna av cellpopulationen i den inre cellmassan är alla vävnader och rudiment av embryots organ. I det sena blastocyststadiet bildas det extraembryonala endodermet från den inre cellmassan och epiblasten (primär ektoderm) bildas. I detta fall behåller epiblastcellerna pluripotens, medan förmågan att differentiera celler i det extraembryonala endodermet är begränsad.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Att erhålla mänskliga embryonala stamceller

Fram tills nyligen trodde man att det var omöjligt att erhålla ESC från trofoblast. Emellertid prolifererar en linje av diploida trofektodermstamceller isolerade från en blastocyst och transformeras till stamceller i ett medium som innehåller FGF2 och heparin istället för LIF. Om FGF2 avlägsnas från mediet slutar trofektodermcellerna att föröka sig, kromosomendoreduplikation börjar i dem, och trofektodermcellulära element transformeras gradvis till jättelika trofoblastceller. LIF stimulerar förmodligen inte trofektodermcellproliferation på grund av att FGF2 utlöser en annan transsignaleringsmekanism, eftersom FGF2, som binder till plasmareceptorn (FGFR2), aktiverar MAP-kinaser i cytoplasman - ERK1 och ERK2. Följaktligen, när en signalväg (LIF - gpl30 - JAK-kinas - STAT3) aktiveras i blastocystceller, transformeras cellerna i den inre cellmassan till pluripotenta ESC:er, och när den andra mekanismen för transmembran signaltransduktion (FGF2 - FGFR2 - MAP-kinas ERK1/ERK2) aktiveras, bildas trofektoderma stamceller i blastocysten. Valet av signalväg beror i sin tur på aktiviteten hos oct4-genen. Denna gen, som tillhör POU-domänen, är belägen i t-locus av autosom 17 och uttrycks under oogenes, under klyvningsperioden, såväl som i cellerna i blastocystens inre cellmassa och i de primära könscellerna. oct4-genens funktionella roll är att koda för en transkriptionsfaktor som är nödvändig för uppkomsten av pluripotenta celler, deras differentiering och dedifferentiering.

Uttrycket av oct4-genen i ESC varierar beroende på interaktionen mellan denna transkriptionsfaktor och kofaktorer. Riktad reglering av oct4-uttryck i blastocyster visade att när dess aktivitet minskar bildar hälften av cellerna trofektoderm, medan när inducerat uttryck av oct4 ökar uppstår huvudsakligen ESC.

I experimentet kan inte ESC:er överföras till en linje under odling av totipotenta blastomerer i klyvningsstadiet, såväl som i gastrulationsstadiet och senare stadier av embryonal utveckling. Mus-ESC:er isoleras vanligtvis på 3,5-4,5:e dagen av graviditeten, vilket motsvarar det sjätte (enkelskiktsblastocyst) och sjunde stadiet (tvåskiktsblastocyst - tidig äggcylinder) av normal embryogenes. Det är uppenbart att musembryon endast innehåller cellpopulationer som kan transformeras till ESC:er under preimplantationsperioden. Följaktligen är isolering av ESC-linjer endast möjlig i vissa stadier av embryogenesen. Zygoten och blastomererna som uppstår under klyvningen är totipotenta, med tanke på möjligheten att utveckla ett livskraftigt embryo med embryonala membran och placenta. Förlusten av total potens hos könsceller börjar i det sena morulastadiet, när ytterligare engagemang av blastomerer beror på deras placering. Tidiga morulablastomerer behåller totipotens, eftersom experimentella manipulationer med förändringar i deras lokalisering, såsom inversion av deras plats, inte förhindrar utvecklingen av ett fullfjädrat embryo.

Det har fastställts att effektiviteten i att isolera embryonala stamcellslinjer (ESC) i en cell påverkas av blastocysternas tillstånd vid tidpunkten för deras explantation. Användningen av blastocyster efter modellering av en sju dagar lång diapaus i reproduktionskanalen hos möss som ovariektomerats på den 3,5:e dagen av dräktigheten och fått progesteron underlättar en mer framgångsrik isolering av embryonala stamcellslinjer. Det antas att antalet blastomerer som bildar den inre cellmassan ökar under sådana förhållanden. Det är också möjligt att cellcykeln förlängs och att de flesta blastomerer går in i G0-fasen.

Dessutom beror skapandet av stabila pluripotenta ESC-linjer på embryonas genotyp: ESC isoleras ganska lätt från blastocyster från 129-muslinjen, de är mycket svårare att erhålla med CS7BL/6-möss, och det är praktiskt taget omöjligt att isolera en ESC-linje från blastocyster från CBA/Ca-möss. Tidiga embryon har uppenbarligen vissa genetiska egenskaper som påverkar utvecklingen av en pluripotent ESC-linje. Icke desto mindre, vid odling av isolerade epiblaster, såväl som genom selektivt urval av differentierande celler, isolerades ESC-linjer ändå från tidiga embryon från CBA/Ca-möss.

En beprövad standardteknik för att erhålla ESC-linjer från blastocyster ges i laboratoriemanualer om tekniken för experiment med tidiga embryon. Experimentella ESC-linjer kan också erhållas genom att odla isolerad epiblast (primär ektoderm) från 4,5 dagar gamla musembryon med hjälp av en ganska komplex mikrokirurgisk teknik och modifierade odlingsförhållanden. Arbetsintensiteten för denna procedur är motiverad, eftersom frekvensen av ESC-linjebildning i detta fall visade sig vara betydligt högre än i arbeten med blastocystens inre cellmassa.

För att isolera ESC-linjer överförs varje klon till en mikrobrunn, ett aggregat av 40-60 celler odlas och dispergeras sedan igen. Flera upprepningar av denna procedur gör det möjligt att erhålla en immortaliserad ESC-linje med maximal proliferationshastighet för normokaryotypiska celler fästa vid plast, vilka bibehåller totipotens och hög telomerasaktivitet efter 50-100 passager. Vid upprätthållande av ESC-linjer är den största faran kontaminering av mediet eller serumet med bakteriella endotoxiner - även spårkoncentrationer av endotoxin i odlingsmediet orsakar massdöd av omogna könsceller. Med noggrann övervakning av linjär tillväxt och snabb dispersion kan ESC i kultur dela symmetriskt, där båda dottercellerna förblir pluripotenta och kan utföra ett obegränsat antal cellcykler, samtidigt som de bibehåller en diploid karyotyp och total potens.

Selektion av en ren population av humana ESC:er kan utföras efter transfektion av deras genom med rekombinanta DNA-molekyler innehållande genen som kodar för syntesen av grönt fluorescerande protein (GFP). GFP-uttryck ökar när ESC:er odlas under förhållanden som stöder deras proliferation, medan expressionsnivån för denna gen minskar med differentieringens början, vilket möjliggör selektion av rena stabila pluripotenta cellinjer på ett selektivt medium. Vid odling av ESC:er som isolerats med GFP-selektion ökar frekvensen av kolonibildning många gånger, eftersom den kraftfulla antiproliferativa effekten av differentierade celler elimineras under förhållandena med selektionskulturer.

Translationen av mänskliga embryonala stamceller till en linje utförs med hjälp av metoden för isolering från preimplantationsembryon (vid stadiet 80-120 celler), som återstår efter in vitro-fertiliseringsproceduren. För detta ändamål dispergeras artificiellt erhållna "överskotts" embryon mekaniskt i Delbecco-Eagle-medium. Efter märkning av cellerna med selektiva monoklonala antikroppar med en fluorescerande märkning isoleras embryoblastcellerna. Embryoblasten dispergeras i individuella celler med hjälp av en dispas-kollagenasblandning. De dissocierade cellerna odlas i ett speciellt medium (80 % Delbeccos medium + 20 % fetalt kalvserum i närvaro av 500 μg/ml IL-6, LIF och SCF) över ett matarmonolager av embryonala fibroblaster från de första 3 passagerna. I detta fall upprätthålls överlevnaden och proliferationen av stam- och progenitorceller på grund av effekten av IL-6, LIF och SCF. I ett sådant medium växer ESC som suspensionskloner av icke-fästade, bollade celler, vilka måste dissocieras genom mjuk, upprepad pipettering. Nya kloner uppträder i den suspenderade kulturen på 5:e-7:e dagen. Den maximala tillväxthastigheten för ESC uppnås genom upprepad dissociation av kloner vid stadiet 10-15 celler. Därefter överförs varje klon till en mikrobrunn och odlas till ett aggregat av 40-50 celler. Proceduren upprepas många gånger i passager, vilket ökar kulturens volym till en densitet av 5-10 miljoner celler per 6 cm skål. Med hjälp av sådan passagering isolerade Thomson 10 odödliga kloner av humana ESC, vilka efter 100 passager behöll hög telomerasaktivitet, förmågan att proliferera kraftigt, minimala fenotypiska egenskaper och total potens med förmågan att differentiera till vilken som helst av 350 specialiserade cellinjer härledda från ekto-, meso- och endoderm. Differentiering av humana ESC började (vid mediumbyte, tillsats av serum och eliminering av LIF) med cellvidhäftning till substratet, vilket indikerar utvecklingen av cytoskelettet och uttryck av adhesionsreceptorer. Viktigt är att humana ESC behöll en normal karyotyp med obegränsad proliferation.

Den andra metoden för att isolera mänskliga ESC-linjer är baserad på användning av primära könsceller. Experimentella studier har visat att E-cellslinjer kan erhållas från könsvecken hos 12,5 dagar gamla musembryon. I dessa fall var dock frekvensen av bildandet av progenitorcellinjer signifikant lägre än i experiment med tidigare embryon. Samtidigt kan primära könsceller från gonaderna hos musembryon med 13,5 dagars gestationsålder inte alls omvandlas till linjer.

De första stabila linjerna av pluripotenta humana EG-celler erhölls från primära gonocyter isolerade från gonaderna hos 5-9 veckor gamla embryon. De isolerade cellerna odlades på ett substrat av inaktiverade musembryonala fibroblaster i DMEM-medium med fetalt serum kompletterat med merkaptoetanol, forskolin och rekombinanta humana tillväxtfaktorer (FGF och LIF). Efter 7-12 dagar uppträdde flercelliga kolonier i kulturen, motsvarande humana EG-celler genom morfologiska egenskaper och molekylära markörer. Efter aggregering bildade dessa celler embryoidkroppar, med vars vidare utveckling specialiserade celler karakteristiska för derivat av alla tre groddlager uppstod. Under loppet av 10-20 passager behöll EG-cellinjerna en normal karyotyp och förlorade inte pluripotens.

Det har också visats att den kombinerade effekten av LIF, membranbundna och lösliga stålfaktorer, och TGF-b förändrar utvecklingsprogrammet för primordiala könsceller. Istället för att upphöra med mitotiska delningar och börja differentiera mot oogenes eller spermatogenes, fortsätter primordiala könsceller att proliferera. Efter flera ytterligare mitotiska cykler blir de lik epiblastceller och, genom att förlora egenskaperna hos könscellsprekursorer, transformeras till pluripotenta embryonala stam-EG-celler.

År 1998 isolerades således för första gången immortaliserade linjer av primordiala könsceller från det genitala rudimentet av mänsklig fosterobduktionsvävnad. Vid mänsklig embryogenes uppträder primordiala könsceller i gulesäcken under den tredje utvecklingsveckan, och under den fjärde-femte veckan migrerar dessa celler till den genitala tuberkelzonen, där de bildar vilande populationer av primära gonocyter. I ett inaktivt tillstånd bevaras primordiala könsceller i embryot fram till födseln. Linjer av primordiala könsceller isoleras från den fosterliga genitala tuberkeln hos 5-9 veckor gamla embryon, vars extraherade vävnad ex tempore behandlas med en blandning av kollagenaser av typerna IV-V, hyaluronidas och DNase för att öka det kvantitativa och kvalitativa cellutbytet. Primordiala könsceller i vävnaden i den fosterliga genitala tuberkeln är omgivna av stromala (mesenkymala) Sertoliceller. Sertolicellernas funktionella syfte är att producera antiapoptotiska faktorer (Fas-ligand), mitogener och immunsuppressiva medel som skyddar könsceller från immunattacker från kroppen. Dessutom spelar den stromala mikromiljön i genitaltuberkulot en viktig roll i mognaden av gameter. De isolerade primära könscellerna planteras i kultur över ett matarstromalt lager bestående av fetala fibroblaster från de tre första passagerna. Den mest effektiva kombinationen av mitogener är ett komplex bestående av LIF, FGF och forskolin (en stimulator av cAMP-bildning). Proliferation av primära könsceller in vitro kräver tillsats av fetalt serum, i vars närvaro reproduktionen av primära gonocyter i kultur åtföljs av bildandet av kloner av sfäriska celler som inte är bundna till substratet.

Vid National Institutes of Health, USA, drogs en preliminär slutsats, baserat på en sammanfattning av befintliga data om metoder för att isolera mänskliga ESC-linjer från blastocyster, att framgångsrik isolering av ESC är mest sannolikt vid odling av blastocyster med en välformad inre cellmassa (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Ur denna synvinkel är den optimala källan till ESC för att skapa linjer mänskliga blastocyster på den 5:e utvecklingsdagen, från vilka trofektodermen bör avlägsnas försiktigt vid isolering av den inre cellmassan. Den isolerade inre cellmassan, bestående av 30-35 celler i detta skede, bör odlas på ett substrat av embryonala musfibroblaster, vilket är en avgörande förutsättning för bildandet av ESC-kolonier i kultur.

Analys av fenotypiska egenskaper hos embryonala stamceller

Av särskilt intresse är den jämförande analysen mellan arter av de fenotypiska egenskaperna hos embryonala stamceller (ESC). Man fann att mänskliga ESC-kolonier är täta kluster av tillplattade, epitelliknande celler, medan musembryoidkroppar består av ett löst konglomerat av rundade celler. I mänskliga ESC är kärn-plasma-förhållandet lägre än i mus-ESC. Embryonala stamceller från apor bildar plattare kolonier av celler med ojämna kanter. Enskilda celler är lätt synliga i tidiga kloner av primat-ESC. Prolifererande ESC från alla studerade djurarter uttrycker inte MHC klass I och II-molekyler. Samtidigt ger mänskliga ESC en positiv reaktion på TERA 1-60 och GCTM-2-antikroppar, vilket indikerar närvaron av keratin/kondroitinsulfatproteoglykaner på deras yta, karakteristiskt för embryo-(terato)-karcinomstamceller. Uttryck av oct4-genen i embryonala stamceller (ESC) hos alla djurarter tyder på att, trots fenotypiska skillnader, samma uppsättning gener som ansvarar för att upprätthålla pluripotens tydligen aktiveras i ESC från människor och mus (Peru, 2001). Dessutom har ESC-linjer isolerade från råtta-, gris-, kanin-, primat- och nötkreatursembryon liknande morfologiska egenskaper, en liknande uppsättning molekylära identifieringsmarkörer och en nästan identisk molekylär mekanism för att implementera embryogenesprogram, vilket gör att vi kan ta en ny titt på problemet med xenotransplantation.

Till skillnad från normal embryogenes in vivo, åtföljs proliferation av ESC in vitro inte av bildandet av groddlager och sker mot bakgrund av blockering av homeotiska Hoxgener, dvs. utan organogenes. Eftersom segmenteringsgenerna inte fungerar är det omöjligt att reproducera sådana perioder av embryogenes som läggning av somiter, embryosegmentering, bildning av gulesäcken, allantois och andra provisoriska organ och vävnader i ESC-kultur. Odlade ESC verkar ha frusit i början av processen för bildandet av 350 restriktionslinjer av specialiserade celler. Således representerar en klon av dotterprogenitorceller och en centralt lokaliserad ESC endast en modell av ett embryo, under vars utveckling olika linjer av specialiserade celler bildas samtidigt i olika vävnadsregioner, vilka dock härrör från gemensamma prekursorer. Trots den minimala nivån av receptorer på ytan av ESC behåller de förmågan att utföra primitiva morfogenetiska processer, imiterande de volymetriska strukturerna hos ett tidigt embryo: en suspension av ESC i kulturaggregat och bildar strukturer som liknar blastocyster eller till och med senare embryon (äggcylindrar). Sådana suspensionsaggregat kallas enkla respektive komplexa embryoidkroppar.

Vid blandad differentiering uttrycks tidiga gener från ektoderm (oct3, fgf-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), kardiogen mesoderm (pkh-2.5), neuralrör (msx3) och hematopoies (elkf) samtidigt i olika celler i en och samma embryoidkropp. Med hjälp av olika kombinationer av tillväxtfaktorer och cytokiner för riktad verkan på bildandet av groddlagerceller in vitro, var det i ett antal fall möjligt att erhålla embryoidkroppar där ektoderm- eller mesodermgener företrädesvis uttrycktes, vilket öppnar vägen för modellering av gastrulation och de initiala faserna av organogenesen.

Klonal tillväxt av ESC är bevis på asymmetrisk celldelning, där endast en ESC i mitten av klonen behåller obegränsad proliferationspotential, medan den andra dottercellen genererar en generation av progenitorceller som redan genomgår differentiering. Därför är klonproliferationshastigheten vid periferin av den embryoida kroppen högre än i mitten. De marginala cellerna i den växande klonen genomgår spontan oordnad differentiering, migrerar eller dör genom apoptotiska mekanismer. Dessa händelser avgör klonens öde: om proliferationshastigheten överstiger migrationshastigheten och apoptotisk celldöd fortsätter klonen att öka i storlek, stabilisering sker när apoptoshastigheten och hastigheten för ny cellbildning är lika, och regression sker när förhållandet mellan dessa processer är inverst. Progenitorceller delar sig symmetriskt, dvs. båda dottercellerna differentierar därefter till mogna specialiserade cellinjer. Förhållandet mellan ESC och progenitorceller varierar, men antalet ESC är alltid bara en bråkdel av en procent av progenitorcellspopulationen. Därför kan endast noggrann pipettering och snabb uppdelning av kloner öka antalet ESC i kulturen. Disaggregation av kloner i stadiet 10-12 celler visade sig vara mest effektivt för att erhålla maximalt utbyte av ESC. Riktningen och graden av differentiering av celler i embryoidkroppen beror på deras placering. De yttre cellerna i embryoidkroppen uttrycker inte oct4-genen och genomgår differentiering till celler i den primära endodermen, från vilka epitelliknande celler i den parietala och viscerala extraembryonala endodermen därefter bildas. De inre cellerna i embryoidkroppen uttrycker oct4-genen och bibehåller pluripotens under 48 timmars odling. Kulturen omstruktureras dock sedan morfologiskt till ett epitelialt monolager och uttrycket av gener som kontrollerar utvecklingen av den primära ektodermen börjar. Därefter börjar processen med total oordnad cytodifferentiering med uppkomsten av olika celltyper som är derivat av alla tre groddlager. I processen med spontan differentiering av cellerna i embryoidkroppen är det först aggregat med endodermmarkörer i form av fragment (cystor) av gulesäcken som uppträder. Sedan uppträder angioblaster och endotelceller från de växande kapillärerna i dessa strukturer. I de sista stadierna av spontan differentiering utvecklas olika terminalt differentierade celler från de inre cellerna i den embryoida kroppen, inklusive neuroner, gliaceller, kardiomyocyter, makrofager och erytrocyter. I viss utsträckning (med hänsyn till den rumsliga inversionen av bildandet av de germinala vävnadslagren) är det med hjälp av embryoidkroppar möjligt att studera morfogenetiska processer in vitro och analysera de molekylära mekanismerna för de initiala perioderna av embryonal cytodifferentiering,samt att fastställa specifika geners roll i implementeringen av dessa processer.

Inom klonen finns det således celler där olika genetiska utvecklingsprogram har upptäckts - embryonala stamceller (ESC), tidiga progenitorceller och differentierande progenitorpopulationer. Odling av ESC med hängande dropp- eller massodlingsmetoder utan matarlager och utan att tillsätta LIF till mediet leder oundvikligen till bildandet av embryoidkroppar. Morfologin hos cellerna i de yttre och inre lagren av embryoidkroppar skiljer sig åt. Det yttre lagret består av stora, grenade celler. Deras yta som vetter mot omgivningen är täckt med ett flertal mikrovilli. Det yttre lagret av celler är separerat från det inre lagret av ett basalmembran som liknar Reicherts membran, medan cellerna i det inre lagret av embryoidkroppar är kolumnärt epitel. Morfologiskt liknar det inre lagret, även om det innehåller många delande celler, mer odifferentierade kolonier av ESC.

Egenskaper hos mänskliga embryonala stamceller

Avsaknaden av parenkymatösa-mesenkymala signalinteraktioner mot bakgrund av homeosgenblockering leder till oordnad tillväxt av ESC i kultur, eftersom detta stör bildandet och utvecklingen av infrastrukturen för provisoriska organ. Oorganiserad tillväxt och oordnad spontan differentiering av ESC i kultur beror på avsaknaden av mesenkymal markering av det stromala ramverket för framtida organ: in vitro är det fullt möjligt att bilda miljontals hepatocyter, men det är omöjligt att erhålla en enda leverlobul som inkluderar sådana strukturella och funktionella element som bihålor, Disse-utrymmen och Kupffer-celler.

Man tror att pluripotensen hos ESC:er uteslutande realiseras i embryogenesen med bildandet av embryots vävnader och organ, medan placentan och navelsträngen är derivat av trofoblasten. ESC:er inneslutna i det trofektodermala membranet genererar sekventiellt kloner av provisoriska celler som implementerar utvecklingsprogrammet genom det kombinatoriska mRNA från Nokhteyovs volumetriska topografiska matris, vilket förutbestämmer det rumsliga arrangemanget, formen och storleken, antalet celler i provisoriska och definitiva organ, samt sammansättningen av parenkymet i strukturella och funktionella enheter. Samtidigt är ESC:er fortfarande den enda typen av celler där den molekylära mekanismen för implementering av deras potenser är helt frikopplad från det genetiska utvecklingsprogrammet, och ESC:erna själva berövas förmågan att interagera med andra celler på grund av blockering av både receptoruppfattningar och transsignalsystem. Emellertid leder adekvat aktivering av ESC:er till en stegvis utveckling av embryogenesprogrammet, som slutar med födelsen av en fullformad organism, bestående av miljarder celler, redo för extrauterint liv. På denna kortsiktiga men ofattbart långsiktiga väg i cellulära rymden uppstår oundvikligen fel både i de molekylära mekanismer som säkerställer cellernas vitala aktivitet och i de program som kontrollerar deras proliferation, differentiering och specialisering. Därför betraktas sjukdomar i molekylstrukturen och sjukdomar i cellprogrammering separat inom modern farmakogenomik. Dessutom syftar de flesta nya läkemedels verkan till att korrigera programmen för differentiering, proliferation och organogenes, såväl som regenerering av organ och vävnader. I en vuxen organism gör ESC det möjligt att kontrollera beteendet hos stam-/progenitorceller som transplanterats in i hjärnan, levern, mjälten, benmärgen och andra mänskliga organ för att återställa skadat parenkym i mottagarorganen genom att differentiera och specialisera donatorceller på den bevarade mesenkymala matrisen. I huvudsak börjar totipotensprogrammet att realiseras på nivån av oocyt-, zygot- och blastomergenomen; dessa celler har dock ännu inte klonats och passerats i mängder som är nödvändiga för experimentell och praktisk medicins behov. Därför förblir ESC:er en unik källa till genetisk information som innehåller koder för en tredimensionell karta över embryot och kodar för linjär restriktion av specialiserade cellinjer under gastrulation.

Den praktiskt taget obegränsade regenerativa potentialen hos ESC beror på att deras genom, till skillnad från den genetiska apparaten hos differentierade somatiska celler, behåller pluripotens. En av manifestationerna av det vilande tillståndet hos den genetiska informationen som är inbäddad i ESC är den så kallade minimala fenotypen - ett begränsat antal receptorer uttrycks på ytan av ESC, och följaktligen används väldigt få transsignaleringsprogram för interaktionen mellan cellens kärnapparat och dess mikromiljö. Mot bakgrund av dvala hos gener som ansvarar för begränsningen av specialiserade cellinjer och celldifferentiering aktiveras endast cirka 30 av 500 gener, vars produkter säkerställer cellens koppling till den omgivande mikromiljön. Med hjälp av metoden för seriell analys av genuttryck visades det att med det gemensamma arbetet hos genomets huvudfunktionella lådor som reglerar energi och metabolism i somatiska celler och ESC, har de senare en mycket låg nivå av mRNA av receptorer, G-proteiner, sekundära budbärare, transkriptaser, uttrycks- och repressionskofaktorer, dvs. hela systemet för transmembranöverföring av den regulatoriska signalen till cellen. Detta beror på frånvaron eller mycket lågt uttryck av transsignalgener. Under perioden med inducerad differentiering i ESC-genomet slutar 18 fungerande gener synkront att fungera mot bakgrund av aktiveringen av 61 transsignalgener som styr syntesen av celladhesionsreceptorer, komponenter i den extracellulära matrisen, restriktionstranskriptaser och budbärarelement i signalöverföringssystemet till kärnapparaten från receptorerna i cellplasmamembranet. Samtidigt blockeras uttrycket av gener som är ansvariga för syntesen av silencerproteiner, liksom ko-hämmare av genuttryck som säkerställer ESC-genomets totipotens.

Genmarkörer har hittats för celler i alla tre groddlager. Identifiering av det ektodermala cellskiktet utförs genom uttryck av nodal-, oct3- och fgf-5-generna, mesodermceller - genom brachyury- och zeta-globin-generna, endoderm - genom uttryck av gata-4-genen. Vid normal embryogenes observeras under gastrulationsperioden aktiv migration av omogna populationer av stam- och progenitorceller, vilket lokalt markerar utvecklingszonerna för ansiktsbenen i skallen, vissa delar av hjärnan, det perifera nervsystemet, hjärtats ledningssystem och tymus, vars vävnader bildas från kloner av migrerande celler. Märkning av celler med tidiga gener i groddlagren underlättar uppgiften med topografisk analys av migrationsprocesserna för prekursorceller i det utvecklande embryot. Det har i synnerhet fastställts att i aggregat av P19-embryocarcinomceller börjar uttrycket av den första mesodermgenen brachyury under perioden med minskat uttryck av generna för vävnadsplasminogenaktivatorn, α-fetoprotein, keratin 8 och keratin 19, vilka är markörer för de första migrerande mesodermpopulationerna. Följaktligen börjar bildandet av vävnader av mesodermalt ursprung först efter att processen med punktmigration och spridning av mesodermala progenitorceller är fullbordad.

Trots extremt begränsade fenotypiska egenskaper och avsaknaden av de flesta transsignalenheter, uttrycker ESC fortfarande vissa receptormolekyler som kan användas för deras identifiering. Det är anmärkningsvärt att ESC-markörantigener hos människor och primater visade sig vara vanliga. Oftast används märkta antikroppar mot membranbundna antigen SSEA-3, SSEA-4 (unika lipidantigener som representerar ett komplex av glykolipid GL7 med sialinsyra), såväl som högpolymerglykoproteinerna TRA-1-81, TRA-1-60 för ESC-märkning. Dessutom uttrycker ESC det specifika embryonala antigenet SSEA-1 och endogent alkaliskt fosfatas, såväl som den specifika transkriptionsfaktorn Oct4. Den senare är nödvändig för att upprätthålla mekanismerna för ESC-proliferation - den specifika transkriptionsfaktorn Oct4 aktiverar uttrycket av fibroblasttillväxtfaktor 4-genen och stabiliserar uttrycket av den box av gener som ansvarar för obegränsad DNA-replikation i omogna celler. De viktigaste intracellulära markörproteinerna är Oct3, Oct4, Tcf och Groucho, vilka är relaterade till kromatin-tystnadsproteiner.

Nästan omedelbart efter många års framgångsrika försök att odla ESC utanför kroppen och de första stamcellskulturerna isolerade från musblastocyster och kulturer av primära könsceller erhölls, började ett forskningsstadium om ESC:ernas pluripotenta potential när de introducerades i embryon i tidiga utvecklingsstadier. Det visades att ESC:er i morula- och blastocyststadierna kan bilda chimära embryon där ättlingar till donator-ESC:er detekteras i alla somatiska vävnader och till och med i gameter. Således etablerades inom utvecklingsbiologin, med hjälp av ESC:er, en "brygga" mellan experimentella studier in vivo och in vitro, vilket avsevärt utökade möjligheterna att studera processerna för att bilda primära vävnader och organ, deras differentiering och embryonala organogenes.

Det är tydligt etablerat att ESC in vivo under embryogenesen integreras i cellmassan hos det tidiga embryot, och deras derivat finns i alla organ och vävnader. ESC koloniserar en linje av könsceller i det chimära embryot, vars avkomma bildar fullfjädrade ägg och spermier. Embryonala stamceller är klonogena - en enda ESC kan skapa en genetiskt identisk koloni av celler med molekylära markörer, vilka inkluderar uttryck av oct4-genen och alkaliskt fosfatas, hög telomerasaktivitet och uttryck av vissa embryonala antigener.

För att studera mekanismerna för embryogenes med hjälp av ESC:er har en metod för morula-chimerisering utvecklats genom att skapa en biologisk konstruktion, utanför vilken det finns ett lager av mottagartetraploida blastomerer, och donator-ESC:er introduceras inuti. Således bildas trofoblasten från ättlingarna till mottagarens tetraploida blastomerer, vilket säkerställer implantation och placentation, och donator-ESC:er fungerar som en intern cellmassa från vilken kroppen av ett livsdugligt embryo och en linje av primära progenitorkönsceller bildas. Forskningsvärdet av ESC:er ligger inte bara i det faktum att pluripotensen bevaras under in vitro-manipulationer med deras genom, utan också i det faktum att ESC:ernas förmåga att delta i bildandet av primära könsceller i ett chimärt embryo bevaras. Det har visats att ättlingarna till bara en genetiskt modifierad ESC befolkar alla primära rudiment och utvecklande vävnader i ett chimärt embryo som erhållits genom aggregering eller samodling av denna cell med ett 8-celligt embryo. När ESC:er transfekterade med den gröna fluorescerande proteingenen transplanterades in i morula hos möss, hittades fluorescerande ättlingar till denna cell i alla studerade vävnader i det utvecklande embryot (Shimada, 1999). Transplantation av ESC:er in i morula möjliggör skapandet av livskraftiga möss vars organism endast består av ättlingar till donator-ESC:n, vilket öppnar upp möjligheter för olika alternativ för terapeutisk kloning. Denna metodologiska metod används nu framgångsrikt för att studera problem inom utvecklingsbiologi, i synnerhet används den för att analysera mekanismerna för genetisk inaktivering av X-kromosomen eller epigenetisk instabilitet hos ESC:er. Transplantation av ESC:er till ett tidigt embryo används också inom jordbruksbioteknik, såväl som i genterapiexperiment.

Transplantation av genetiskt modifierade ESC används för att testa målceller för mutanta gener. In vitro-odlade ESC används inom bioteknik för att skapa knockout-möss. För detta ändamål avlägsnas genen som ska studeras från ESC:erna genom homolog rekombination (knockout) och celler som saknar denna gen isoleras på selektiva medier. Knockout-ESC:er introduceras sedan i blastocysten eller aggregeras med morulablastomerer. De chimära tidiga embryona som erhålls på detta sätt transplanteras till mottagarhonor, och individer med gameter som är nullizygota för en given gen väljs ut bland de nyfödda mössen. Denna teknik har använts för att skapa många linjer av knockout-möss, som används i stor utsträckning inom experimentell biologi och experimentell medicin. Sådana biologiska modeller används för att studera betydelsen av vissa gener i embryonal utveckling, såväl som deras roll i mekanismerna för mänskliga sjukdomar och patologiska tillstånd. Dessutom används knockout-djurlinjer i preklinisk testning av nya genterapimetoder. Genom att till exempel transfektera den normala allelen av en mutantgen in i ESC-genomet är det möjligt att effektivt korrigera en mutation som påverkar det hematopoetiska systemet. Införandet av främmande gener i ESC möjliggör snabb skapande av linjer av homozygota transgena försöksdjur. Det bör dock noteras att tekniken för riktad rekombinationsdeletion av genen hittills endast har utvecklats på ett tillförlitligt sätt i relation till mus-ESC. Med hjälp av dubbel knockout-mus-ESC fastställdes den funktionella rollen för genklusterregionen på kromosom 7 (en kopia av den genomiska regionen på mänsklig kromosom 19) och den proximala regionen av kromosom 11 (en kopia av mänsklig kromosom 5g) - deletion av dessa gener i mus-ESC gjorde det möjligt att utvärdera funktionen hos deras analoger hos människor.

Möjligheterna att studera funktionen hos mänskliga embryogenesgener har utökats, vars transfektion in i genomet hos ESC hos försöksdjur har gjort det möjligt att i synnerhet klargöra kryptogenens roll i bildandet och utvecklingen av det kardiogena mesodermet, pax-6-genen - i ögonembryogenes. De första kartorna över genuttryck i omogna prolifererande ESC av teratocarcinom och blastocyster hos möss sammanställs, och suppressiv repression av transsignalgener i ESC har bekräftats. En kombination av 60-80 mutanta ESC och 20-30 celler från normala preimplantationsmusembryon leder till utvecklingen av chimära embryon där organprimordier består av donator- och mottagarceller, vilket gör det möjligt att klargöra rollen av okända gener i gastrulation och organogenes. Funktionskartan över gener hos utvecklande musembryon kompletterades med information om sf-1-genens roll i bildandet av binjurarna och gonaderna, wt-1-genen i bildandet av njurarna, gener från myoD-familjen i bildandet av skelettmuskulatur och gener från gata-1-4-familjen i restriktionsmognaden av erytropoes- och lymfopoesgrunderna.

Riktad avstängning av maternella och faderliga alleler av gener i ESC med hjälp av vektorrekombinaser gjorde det möjligt att klargöra funktionerna hos olika gener under den tidiga perioden av embryogenesen, och tekniken för riktad överföring av okända mänskliga gener till mus-ESC bidrar till upptäckten av nya mutanta gener som är ansvariga för utvecklingen av allvarlig ärftlig patologi. Med hjälp av knockout-metoden bestämdes den obligatoriska betydelsen av vissa gener för bildandet av embryonala vävnader: gata-4 - för myokardiet, gata-1 - för den erytroida avstamningen av hematopoetisk vävnad, myoD - för skelettmuskler, brachyury - för mesoderm, restriktionstranskriptaserna hnf3 och hnf4 - för leverstamceller, rag-2 - för bildandet av T- och B-lymfocytkloner (Repin, 2001). Dubbel deletion av gener i ESC har öppnat upp för studier av den funktionella rollen hos groddlagergener, segmentering och homeos, och ESC-transplantation har gjort det möjligt att erhålla livskraftiga interspecies hybridembryon. Med hjälp av en förbättrad teknik för att transplantera en enda donator-ESC till ett 8-celligt embryo har chimerisering på cellnivå av många organ i mottagarembryot bevisats. Det bör noteras att cellgroddar av mänsklig vävnad har hittats i organen hos mottagarmöss efter införandet av humana hematopoetiska stamceller i blastocysten. Det har fastställts att pluripotenta ESC cirkulerar i blodet hos musembryon under organbildningsperioden. Det är möjligt att deras biologiska funktion ligger i den embryonala organisationen av det framtida immunsystemet. Med hjälp av ESC har adekvata modeller av mänsklig genetisk patologi reproducerats i laboratorieförhållanden: dubbel knockout av dystrofin-genen modellerar Duchennes muskeldystrofi hos möss, och avstängning av atm-genen (kontroll av kromatinsignalkinassyntes) - ataxi-telangectasia. Vid denna dödliga ärftliga sjukdom hos barn utvecklas degeneration av Purkinjeceller i lillhjärnan på grund av defekter i DNA-reparation, vilket åtföljs av involution av tymus på grund av död av prolifererande celler. Den kliniska bilden, patofysiologin och patomorfologin för ataxi-telangectasia, reproducerad genom att introducera patologisk genetisk information i ESC, hos chimärmöss motsvarar de hos människor. Förutom ataxi-telangectasia har experimentella modeller av vissa ärftliga homozygota mänskliga sjukdomar associerade med patologi av kolhydrat- och lipidmetabolism, aminosyrakatabolism samt koppar- och bilirubinutsöndring utvecklats med hjälp av ESC och knockout-möss, vilket avsevärt har utökat den experimentella medicinens möjligheter i preklinisk testning av nya metoder för behandling av motsvarande mänskliga sjukdomar.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Användning av stamcellscytohybrider

Hybridceller som erhålls genom att fusionera ESC med somatiska celler är en adekvat och lovande modell för att studera pluripotensen hos stamceller och omprogrammera kromosomerna i differentierade celler. Cytohybrider som erhålls genom att fusionera ESC med differentierade celler från ett vuxet djur gör det möjligt att studera sambanden mellan genom av olika "åldrar": en unik situation uppstår när homologa kromosomer som härrör från celler i olika differentieringsstadier och olika mognadsgrader finns i samma cellkärna, där de enkelt kan utbyta trans-verkande regulatoriska signaler. Det är svårt att förutsäga hur de cisregulatoriska epigenetiska systemen hos homologa kromosomer, som bildas under individuell utveckling, kommer att reagera på påverkan av trans-verkande signaler som härrör från embryonala relaterade genom. Dessutom sker segregation av föräldrakromosomer i hybridceller, vilket gör det möjligt för oss att studera interaktionen mellan genom på nivån av individuella kromosomer, det vill säga att potentiellt identifiera specifika kromosomers deltagande i att upprätthålla pluripotens eller, omvänt, utgången till differentiering.

Cytohybrider erhållna genom att fusionera pluripotent teratokarcinom och differentierade somatiska celler användes som den första experimentella modellen för att studera interaktionen mellan genom med olika "utvecklingshistorier". I vissa fall behöll sådana hybridceller pluripotenta egenskaper på en ganska hög nivå. I synnerhet inducerade teratokarcinom-somatiska hybridceller in vivo utvecklingen av äkta teratom innehållande derivat av alla tre groddlager, och in vitro i suspensionskulturer bildade de embryoidkroppar. Även i interspecifika cytohybrider av denna typ noterades närvaron av embryonala antigener i fall där de somatiska partnerna i fusionen med teratokarcinomceller var lymfocyter eller tymocyter. Det är anmärkningsvärt att cytohybrider som skapats genom att fusionera teratokarcinomceller med fibroblaster motsvarade fibroblaster i fenotyp.

Det viktigaste etablerade faktumet är att i teratokarcinom-somatiska hybridceller uppträdde tecken på omprogrammering av det differentierade cellgenomet, vilket kännetecknades av reaktivering av antingen individuella gener eller den inaktiva X-kromosomen hos den somatiska partnern. Resultaten av studier på cytohybrider av teratokarcinom-somatisk celltyp indikerar således att pluripotens ofta bevaras i hybridceller och det finns tecken på omprogrammering av den somatiska partnerns genom.

I experiment för att erhålla intraspecifika embryonala hybridceller genom att fusionera mus-ESC med vuxna splenocyter studerades egenskaperna hos sådana cytohybrider, segregation av föräldrakromosomer analyserades och pluripotensen hos hybridgenomet utvärderades. Intraspecifika hybridceller erhållna genom att fusionera teratokarcinomceller med somatiska celler kännetecknas vanligtvis av en låg nivå av kromosomsegregation med en tetraploid eller nästan tetraploid karyotyp. En liknande kromosomal sammansättning observerades i cytohybrider under fusionen av primära könsceller med lymfocyter. Samtidigt uppvisade interspecifika hybridceller erhållna genom att fusionera mus-teratokarcinomceller med minklymfocyter intensiv segregation av kromosomerna hos den somatiska partnern.

Ett kvalitativt nytt steg i studien av segregation av föräldrakromosomer i intraspecifika hybrider började efter utvecklingen av en metod för att analysera mikrosatelliter med hjälp av polymeraskedjereaktion, tack vare vilken flera hundra markörer hittades för varje muskromosom, vilket möjliggjorde tillförlitlig diskriminering av vilket par av homologa kromosomer som helst i hybridceller.

Genom att fusionera ESC:er (HM-1-celler med brist på hypoxantinfosforibosyltransferasaktivitet, 2n = 40, XY, isolerade från blastocyster från 129/01a-möss) med splenocyter från de kongena DD/c-mössen, var det möjligt att erhålla en uppsättning hybridkloner som morfologiskt liknade ESC:er. Alla kloner isolerades på ett selektivt medium där endast celler med aktivt hypoxantinfosforibosyltransferas kan växa. Elektroforetisk analys visade att alla kloner hade en allelisk variant av hypoxantinfosforibosyltransferas som är karakteristisk för DD/c-möss. Cytogenetisk analys visade att tre av de fyra hybridklonerna hade en nästan diploid uppsättning kromosomer. En nästan tetraploid klon innehöll två populationer av hybridceller, varav en var tetraploid och den andra, mindre, var diploid.

Mikrosatellitanalys, som möjliggör särskiljning av vilket par av homologa kromosomer som helst hos mössen 129/01a och DD/c, i hybridkloner med en nästan diploid uppsättning, visade att det i två kloner fanns en tydlig preferentiell eliminering av autosomer från den somatiska partnern. De flesta autosomer i klonerna HESS2 och HESS3 hade markörer från 129/01a-linjen, dvs. den pluripotenta partnern. Undantaget var kromosom 1 och I: i klonerna HESS2 och HESS3, tillsammans med markörer från HM-1-celler, fanns markörer från den somatiska partnern i små mängder. Sådana resultat kan återspegla ofullständig segregering av kromosom 1 och I hos den somatiska partnern och överensstämmer med cytogenetiska data som visar att trisomi för dessa kromosomer observeras i 30–40 % av cellerna i klonerna HESS2 och HESS3. Klon HESS4 skilde sig avsevärt åt i sin kromosomala sammansättning: många autosomer i denna klon härstammar från ESC-genomet (kromosomerna 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 och 17), men kromosomerna 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 och 19 representerades av homologer från båda föräldrarna. Det kvantitativa förhållandet mellan mikrosatelliter som markerade dessa homologa kromosomer var ungefär 1:1. Detta gjorde det möjligt för författarna att anta att en homolog härstammar från ESC-genomet och den andra från differentierade celler. I vissa subkloner av klon HESS4 fanns endast markörer för kromosomerna 18 och 19 hos den somatiska partnern närvarande. De erhållna resultaten indikerar att i cellerna i HESS4-klonen, utöver segregeringen av kromosomerna hos den somatiska partnern, inträffade eliminering av en eller båda homologerna av de ovan listade kromosomerna i det pluripotenta genomet, det vill säga det skedde en bilateral segregering av kromosomerna hos båda föräldrarna - ett mycket ovanligt fenomen, eftersom segregering av kromosomerna hos endast en av föräldrarna är karakteristiskt för cytohybrider.

Dessutom innehöll alla kloner av hybridceller efter den 20:e passagen endast markörer för den somatiska partnerns X-kromosom, dvs. ESC X-kromosomen ersattes av den somatiska partnerns X-kromosom i klonerna. Detta viktiga faktum bekräftas av in situ-hybridiseringsdata med användning av en FITC-märkt prob specifik för musens X-kromosom: en positiv signal detekterades endast på en kromosom. Det bör noteras att i tidigare odlingsstadier (före den 15:e passagen), enligt cytogenetiska data, innehöll många celler två X-kromosomer. Därför möjliggör användningen av selektiva medier manipulering av den kromosomala sammansättningen av hybridceller och selektivt val av kloner som bär enskilda kromosomer från den somatiska partnern mot bakgrund av ESC-genomet.

Eftersom en unik egenskap hos cytohybridgenomet är lokaliseringen av föräldragenomen i en cellkärna, uppstår frågan naturligtvis om bevarandet av de pluripotenta egenskaperna hos det embryonala genomet i ESC-somatiska cellhybrider under förhållanden med nära kontakt med genomet hos en differentierad cell. Morfologiskt sett liknade cytohybriderna av ESC och somatiska celler den föräldra-ESC-linjen. Utvärdering av pluripotens visade att alla kloner med en nästan diploid uppsättning kromosomer kunde bilda embryoidkroppar i suspensionskulturer, där derivat av tre groddlager var närvarande.

De flesta hybridceller innehöll ECMA-7-antigenet, en markör som är karakteristisk för tidiga musembryon, och hade även hög alkaliskt fosfatasaktivitet. De mest övertygande uppgifterna om hybridcellernas höga pluripotenta egenskaper erhölls i experiment för att erhålla en serie injektionschimärer som involverade hybridceller av HESS2-klonen. Analys av biokemiska markörer visade att ättlingar till donatorhybridcellerna fanns i de flesta vävnader i chimärerna. Därför behåller hybridceller som erhållits genom att fusionera ESC och somatiska differentierade celler pluripotens på en hög nivå, inklusive förmågan att bilda chimärer när de injiceras i blastocysthålan.

Klonerna HESS2 och HESS4 skilde sig avsevärt åt i sammansättningen av föräldrakromosomer, men hade liknande pluripotenta egenskaper. Man skulle kunna anta att pluripotens i hybridgenomet manifesterar sig som ett dominant drag, men det är möjligt att inte alla kromosomer i det embryonala genomet är involverade i processen att upprätthålla pluripotens. Om detta antagande är korrekt kan man förvänta sig att elimineringen av vissa kromosomer från den pluripotenta partnern från hybridcellernas genom inte kommer att åtföljas av en förändring i deras pluripotenta status. I detta fall skulle analysen av segregationen av föräldrakromosomer i embryonala hybridceller göra det möjligt för oss att närmare närma oss identifieringen av kromosomer som är ansvariga för kontrollen av pluripotens hos embryonala celler.

O. Serov et al. (2001) fann inga avkommor bland 50 avkommor som erhållits genom korsning av chimärer med normala möss som hade musgenotypen 129/01a och bar X-kromosomen hos DD-möss. Författarna tror att detta beror på en minskning av pluripotensen i hybridceller under inverkan av det somatiska genomet. En alternativ förklaring kan vara den negativa effekten av trisomi på vissa autosomer och obalans i könskromosomer (XXY observerades i celler upp till den 15:e passagen) i hybridceller under meios. Det är känt att XXY-celler inte kan genomgå meios och bilda gameter. Trisomi kan också orsaka en minskning av den proliferativa aktiviteten hos hybridceller, vilket resulterar i att den selektiva fördelen i utvecklingen av chimärer kan tillhöra cellerna i mottagarembryot. Det följer att för en adekvat bedömning av hybridcellernas pluripotenta potential är det nödvändigt att erhålla hybridkloner med en normal diploid uppsättning kromosomer.

I experimenten av O. Serov och medförfattare (2001) demonstrerades för första gången möjligheten att omprogrammera X-kromosomen hos en somatisk cell i hybridcellernas genom. Denna slutsats från författarna följer av analysen av uttrycket av hprt-genen (en X-kromosommarkör) i chimärer: närvaron av den alleliska varianten av hprt hos DD/c-möss detekterades i alla analyserade chimära vävnader. Det är lämpligt att betona att efter införandet av hybridceller i blastocysthålan hamnar cytohybriderna i icke-selektiva förhållanden och bevarandet av X-kromosomen i hybridcellernas genom innebär att den har blivit dess obligata komponent och genomet skiljer den inte från Y-kromosomen hos den pluripotenta partnern.

Sammanfattande av resultaten av analysen av interaktionen mellan de somatiska och pluripotenta genomerna i hybridembryonala celler drar författarna slutsatsen att pluripotens manifesteras som ett dominant drag hos vissa cytohybrider. Hybridgenomet kan omprogrammera individuella kromosomer i differentierade celler, vilket dock inte utesluter möjligheten av en omvänd effekt av det somatiska genomet på det embryonala genomets pluripotens. Vid odling av hybridceller sker induktion av differentiering betydligt oftare än i den ursprungliga föräldralinjen för ESC HM-1. En liknande effekt observeras under bildandet av primära kolonier: många primära kolonier av embryonala hybridceller differentierar i tidiga stadier av bildning med stora förluster av kloner under deras selektion och reproduktion.

Således behåller cytohybrider som skapats genom fusion av ESC med somatiska celler, trots nära kontakt med genomet hos differentierade celler, pluripotens som en unik egenskap hos det embryonala genomet. Dessutom är omprogrammering av individuella kromosomer som härrör från differentierade celler möjlig i sådana hybridceller. Det är fortfarande oklart i vilken utsträckning de pluripotenta egenskaperna hos det embryonala genomet behålls i hybridceller, i synnerhet deras förmåga att delta i bildandet av groddlinjen i chimärer. Detta kräver att man erhåller embryonala hybridceller med en normal karyotyp. I vilket fall som helst kan pluripotenta embryonala hybridceller bli en verklig genetisk modell för att identifiera kromosomer involverade i att upprätthålla pluripotens eller kontrollera den, eftersom bilateral segregation av föräldrakromosomer potentiellt ger en sådan möjlighet.

Inte mindre attraktivt är studiet av fenomenet som O. Serov et al. (2001) definierar som "kromosomminne". I hybridgenomet finns homologa kromosomer i två alternativa konfigurationer: homologer av den somatiska partnern har en gång genomgått differentiering, medan i homologer av den pluripotenta partnern denna process bara har börjat. Följaktligen indikerar bevarandet av höga pluripotenta egenskaper hos hybridceller att den "pluripotenta" konfigurationen av ESC-homologer är tillräckligt stabil i hybridgenomet, trots påverkan av transaktionsfaktorer som härrör från den somatiska partnern. De ovan beskrivna tecknen på omprogrammering av homologa kromosomer i det differentierade genomet under utvecklingen av chimärer utesluter inte möjligheten att de i de första stadierna av bildandet och odlingen av cytohybrider in vitro behåller sin status som förvärvats under differentieringen in vivo. Enligt nyligen erhållna data, när embryonala hybridceller överförs till en icke-selektiv miljö, uppvisar de intensiv eliminering av kromosomer från endast den somatiska partnern, dvs. genomet hos hybridceller särskiljer lätt homologer efter in vitro-odling i 10-15 passager. Således representerar embryonala hybridceller en lovande experimentell modell för att studera inte bara en sådan grundläggande egenskap hos det embryonala genomet som pluripotens, utan också dess alternativ - embryonal differentiering.

Terapeutisk effekt av embryonal stamcellstransplantation

Innan vi analyserar den terapeutiska effekten av transplantation av embryogenesceller (ESC) och deras derivat, sammanfattar vi ovanstående material. ESC:ernas förmåga att fullt ut implementera embryogenes in vitro är otillräcklig, eftersom utvecklingsdefekter i detta fall beror på avsaknaden av mesenkymala stamceller, som uppstår i kroppen autonomt och oberoende av ESC:er. ESC:ernas genetiska potential är mindre än zygotens genetiska potential, därför används ESC:erna inte direkt för kloning av embryon. ESC:ernas unika biologiska potential, som de enda celler där utvecklingsprogram används fullt ut i en konsekvent implementering, används i studier av genfunktion. Med hjälp av ESC:erna avkodas de första kombinationerna av signaler som aktiverar uttrycket av tidiga och sena gener som kodar för utvecklingen av tre groddlager. Bevarandet av ESC-genomets pluripotens in vitro gör dem till ett unikt verktyg för reparativ regenerering, kapabla att automatiskt ersätta cellförluster vid skador på organ och vävnader. I ett idealt hypotetiskt scenario kan man anta att ”... vid transplantation av donator-ESC överförs kompakt packade program till mottagarens kropp, vilka under gynnsamma förhållanden realiseras i konstruktionen av ny vävnad”7, som kan ”... integreras effektivt i mottagarens kropp på både morfologisk och funktionell nivå.”

Naturligtvis, efter utvecklingen av metoder för monodifferentiering av ESC, påbörjades in vivo-studier av den funktionella aktiviteten hos celler erhållna in vitro från en specialiserad klon. En prolifererande ESC-klon genererar populationer av migrerande progenitorceller som verkligen är kapabla att aktivt integreras i områden med mottagarvävnadsskada, vilket används inom regenerativ-plastisk medicin. Det har fastställts att transplantation av DOPA-neuroner till substantia nigra minskar kliniska manifestationer vid experimentell hemiparkinsonism. Regionala transplantationer av donatorneuronstamceller minskar graden av motoriska störningar orsakade av trauma eller kontusion av ryggmärg och hjärna. De första positiva resultaten av stamcellstransplantation vid demyeliniserande sjukdomar har också erhållits. Det verkar som att den regenerativ-plastiska potentialen hos ESC öppnar upp obegränsade möjligheter för användning av celltransplantation inom praktisk medicin. Men när de transplanteras till ektopiska zoner omvandlas ESC oundvikligen till tumörer. Teratom bildas när ESC injiceras subkutant i immunbristfälliga möss. När ESC-suspensioner transplanteras under testikelkapseln hos syngena möss bildas även teratom, bestående av olika vävnader, vars celler är derivat av alla tre groddlager. I sådana teratom är processer med reducerad organogenes extremt sällsynta.

Ett antal studier ger information om de positiva resultaten av transplantation av tidiga ESC-derivat till djur med experimentell patologi. Cellulär neurotransplantation med ESC-derivat utvecklas vidare i experiment och de första kliniska prövningarna för att korrigera funktionella störningar vid hjärn- och ryggmärgsskador, och för att behandla syringomyeli och multipel skleros (Repin, 2001). Med tillkomsten av tekniken för in vitro-neurogenes från ESC, istället för att använda embryonal hjärnvävnad, utvecklas metoder för att transplantera neurosfärderivat erhållna från embryonala nervvävnadskulturer. Sådana transplantatsuspensioner är betydligt mer homogena och innehåller dedikerade prekursorer till neuroner och neuroglia.

Med regelbunden tillsats av retinsyra i en dos av 10 μg/ml till odlingsmediet under 6 veckor bildas mer än 80 % av postmitotiska neuroner i den mänskliga embryo-(terato)-karcinomlinjen NTERA-2. Fullständig homogenitet i neuronpopulationen uppnås genom flödessortering av mogna neuroner märkta med immunofenotypiska markörer, vilket gör det möjligt att bli av med rester av teratokarcinom och omogna celler. Efter transplantation till olika regioner i hjärnan hos försöksdjur överlever sådana neuroner inte bara, utan integreras också i regionala neurala nätverk. Hos djur med experimentella modeller av lokala CNS-defekter minskar neurotransplantation de kliniska manifestationerna av sådana mänskliga patologier som konsekvenserna av traumatisk hjärnskada, stroke, demyeliniserande sjukdomar, ärftliga defekter i lillhjärnans utveckling, sjukdomar i lipid- och polysackaridavsättning.

För att optimera regenereringsprocesser vid degenerativa sjukdomar i centrala nervsystemet utvecklas tekniker för att utvinna myelinproducerande oligodendrocyter från ESC. Det första steget inkluderar traditionellt proliferation av ESC med reproduktion av det antal celler som krävs för transplantation. I det andra steget utförs riktad differentiering av celler till en population av myelinproducerande oligodendrocytprekursorer, vilket kontrolleras av selektiva markörantigener.

Vissa möjligheter öppnar sig för användning av ESC-derivat för utveckling av metoder för att korrigera immunbrister orsakade av genetiska defekter i tymusmognad. I studier på knockout-möss (rag 1) med en inducerad gendefekt - en störning av rekombinationsmekanismen hos V(D)J-loci i TCR-gener, vilket leder till förlust av T-lymfocytfunktion, återställer transplantation av tidiga ESC-derivat till djurens tymus mognaden av normala populationer av immunkloner som ansvarar för cellulär immunitet. Kliniska prövningar av transplantation av in vitro-förbildade ESC för behandling av dödliga ärftliga anemier hos barn pågår.

Invändningar mot ett snabbt införande av stamcellstransplantation i kliniken baseras på det begränsade antalet stabila linjer av mänskliga embryonala stamceller och behovet av deras standardisering. För att öka renheten hos standardiserade ESC-linjer, såväl som hos vuxna mänskliga stamceller, föreslås att man använder en metod för linjeselektion baserad på molekylärgenetisk analys av korta tandem-DNA-upprepningar. Det är också nödvändigt att testa ESC-linjer för förekomst av små kromosomala omarrangemang och genetiska mutationer, vars potential att inträffa under cellodlingsförhållanden är ganska hög. En tes framförs om obligatorisk testning av egenskaperna hos alla typer av ESC och regionala pluripotenta stamceller, eftersom deras reproduktion in vitro kan leda till framväxten av nya egenskaper som inte är inneboende i embryonala stamceller eller definitiva vävnader. I synnerhet antas det att långvarig odling i medier med cytokiner för ESC-linjer närmare tumörceller, eftersom de genomgår liknande förändringar i cellcykelregleringsvägarna med förvärvet av förmågan att utföra ett obegränsat antal celldelningar. Vissa författare, baserat på potentialen för tumörutveckling, anser att transplantation av tidiga embryonala stamcellsderivat till människor är vårdslös. Enligt deras uppfattning är det mycket säkrare att använda dedikerade ättlingar till ESC, dvs. linjer av differentierade cellprogenitorer. För närvarande har dock ingen tillförlitlig teknik för att erhålla stabila mänskliga cellinjer som differentierar i önskad riktning ännu utvecklats.

Således dyker alltmer data om den positiva terapeutiska effekten av transplantation av humana embryonala stamcellsderivat upp i litteraturen. Många av dessa studier granskas och kritiseras dock. Vissa forskare anser att resultaten från tidiga kliniska prövningar är preliminära till sin natur och endast indikerar att stamceller kan utöva en gynnsam effekt på det kliniska förloppet av en viss sjukdom. Därför är det nödvändigt att erhålla data om de avlägsna resultaten av celltransplantation. Utvecklingsstadierna inom klinisk neurotransplantation anges som ett argument. Till en början var det publikationer om den höga effektiviteten av transplantation av embryonala hjärnfragment vid Parkinsons sjukdom som dominerade i litteraturen, men sedan började rapporter dyka upp som förnekade den terapeutiska effektiviteten av embryonal eller fosternervvävnad transplanterad i patienters hjärna.

De första kliniska prövningarna genomfördes för att bedöma säkerheten vid transplantation av neuroblaster härledda från NTERA-2 teratokarcinom-ESC:er, vars omogna celler utsattes för proliferation i kultur tills en ackumulering av 100 miljoner cellmassa uppnåddes. Några av de celler som erhölls på detta sätt användes för att karakterisera fenotypen och bestämma cellulära föroreningar, samt för att testa för eventuell kontaminering med virus och bakterier. LIF och matarskiktet av fetala stromala celler avlägsnades från odlingsmediet, och förhållanden skapades för riktad differentiering av ESC:er till neuroblaster med hjälp av en kombination av cytokiner och tillväxtfaktorer. Därefter renades neuroblasterna från omogna teratokarcinomceller på en flödescellsorterare. Efter sekundär rening och fenotypkarakterisering av transplanterade celler injicerades en suspension av neuroblaster (10-12 miljoner) i basalkärnan i patienternas hjärnor (under den sjunde månaden efter hemorragisk stroke) med hjälp av en speciell mikrokanyl och spruta under stereotaxisk och datortomografisk kontroll. Ettårig screening efter transplantation av konsekvenserna av neurontransplantation till strokezonen visade inga biverkningar eller oönskade effekter. Hälften av patienterna uppvisade förbättringar i motorisk funktion under perioden 6 till 12 månader efter transplantationen. Positiva kliniska förändringar åtföljdes av ökad blodtillförsel till strokezonen efter celltransplantation: den genomsnittliga ökningen av absorptionen av fluorescerande märkt 2-deoxyglukos, enligt positronemissionstomografi, nådde 18 %, och hos vissa patienter - 35 %.

Emellertid genomförde US National Institutes of Health en oberoende studie av den kliniska effekten av neurotransplantation hos patienter med Parkinsonism. Patienter i den första gruppen transplanterades med sektioner av embryonal nervvävnad som producerar dopamin, medan den andra patientgruppen genomgick en skenoperation. Resultaten indikerar noll klinisk effekt av sådan neurotransplantation, trots att dopaminproducerande embryonala neuroner överlevde i mottagarnas hjärnor. Dessutom utvecklade 15 % av patienterna ihållande dyskinesi två år efter transplantationen av embryonal nervvävnad, vilket saknades hos patienter i placebogruppen (Stamceller: vetenskapliga framsteg och framtida forskningsinriktningar. Nat. Inst, of Health. USA). Observationer av vidare utveckling av sjukdomen hos dessa patienter pågår.

Vissa författare kopplar de motstridiga litteraturdata om bedömningen av neurotransplantationens kliniska effektivitet till olika metoder för urval av patientgrupper, otillräckligt val av metoder för att objektivt bedöma deras tillstånd, och, viktigast av allt, olika utvecklingsperioder av embryonal nervvävnad och olika områden i hjärnan från vilka denna vävnad erhölls, olika transplantationsstorlekar och metodologiska egenskaper vid kirurgiskt ingrepp.

Det bör noteras att försök till direkt transplantation av pluripotenta embryonala stamceller till striatumregionen i hjärnan hos råttor med experimentell hemiparkinsonism åtföljdes av proliferation av ESC och deras differentiering till dopaminerga neuroner. Det bör antas att nybildade neuroner integrerades effektivt i neurala nätverk, eftersom korrigering av beteendeavvikelser och motorisk asymmetri i apomorfintestet observerades efter ESC-transplantation. Samtidigt dog vissa djur på grund av omvandlingen av transplanterade ESC till hjärntumörer.

Experter från de nationella och medicinska akademierna i USA, specialister från National Institute of Health i USA anser att den kliniska potentialen hos stamceller (ESC) förtjänar största möjliga uppmärksamhet, men insisterar på behovet av en detaljerad studie av deras egenskaper, sannolikheten för komplikationer och långsiktiga konsekvenser i experiment med adekvata biologiska modeller av mänskliga sjukdomar (Stamceller och framtidens regenerativa medicin, National Academy Press.; Stamceller och framtidens forskningsinriktningar. Nat. Inst, of Health USA).

Ur denna synvinkel är det viktigt att en jämförande histologisk analys av experimentella teratom erhållna genom transplantation av ESC-suspension i testikeln med teratom bildade som ett resultat av transplantation av ett tidigt embryo, vilket också innehåller ESC, visade att ESC, oavsett ursprung eller interaktion med vissa omgivande celler, implementerar sin tumörframkallande potential på samma sätt. Det har bevisats att sådana teratom har ett klonalt ursprung, eftersom tumörer bestående av derivat av alla tre groddlager kan uppstå från ett ESC (Rega, 2001). Det är anmärkningsvärt att när klonade ESC med normal karyotyp transplanterades till immunbristfälliga möss, bildades också teratom bestående av olika typer av differentierade somatiska celler. Dessa experimentella data är ett oklanderligt bevis på teratoms klonala ursprung. Ur utvecklingsbiologisk synvinkel indikerar de att det inte är flera engagerade progenitorceller, utan en enda pluripotent stamcell som fungerar som en källa till differentierade derivat av alla tre groddlager som utgör ett teratom. På vägen mot praktisk celltransplantation är dock resultaten av dessa studier, om inte avskräckande, så ett varningstecken på potentiell fara, eftersom inokulering av ESC eller primordiala könsceller i olika vävnader hos vuxna immunbristfälliga möss oundvikligen orsakar utveckling av tumörer från transplanterade stamceller. Neoplastisk degeneration av ektopiskt transplanterade ESC åtföljs av uppkomsten av satellitpopulationer av differentierade celler - på grund av partiell differentiering av ESC och progenitorkloner till specialiserade linjer. Intressant nog bildas neuroner oftast bredvid teratocarcinomceller när ESC transplanteras till skelettmuskler. Införandet av ESC i ett delande ägg eller en blastocyst åtföljs dock av fullständig integration av cellerna i embryot utan bildandet av neoplastiska element. I detta fall integreras ESC i praktiskt taget alla organ och vävnader i embryot, inklusive genital primordium. Sådana allofena djur erhölls först genom att introducera teratocarcinom 129-celler i tidiga embryon i stadierna 8-100 celler. Hos allofena möss integreras populationer av heterogena celler härledda från donator-ESC i vävnaderna i benmärg, tarm, hud, lever och könsorgan, vilket gör det möjligt att skapa jämna interartiga cellchimärer i experimentet. Ju kortare utvecklingsperioden för det tidiga embryot är, desto högre är andelen cellchimerisering, med den högsta graden av chimerisering observerad i det hematopoetiska systemet, huden, nervsystemet, levern och tunntarmen hos allofenembryot. Hos en vuxen organism är vävnader som skyddas från mottagarens immunförsvar av histohematiska barriärer mottagliga för chimerisering:Transplantation av primära könsceller i testikelparenkymet åtföljs av införlivandet av donatorstamceller i mottagarens germinala vävnadslager. Emellertid, vid transplantation av ESC till en blastocyst, bildas inte chimära rudiment av könsorganen med generering av primära donatorkönsceller. ESC:ernas pluripotens, när speciella förhållanden skapas, kan också användas för kloning: transplantation av mus-ESC till ett 8-16-celligt musembryo, där cellmitoser blockeras av cytokalsin, främjar implementeringen av normal embryogenes med utvecklingen av ett embryo från donator-ESC.

Därför är ett alternativ till allogen ESC-transplantation terapeutisk kloning baserad på transplantation av somatiska cellkärnor till ett enukleerat ägg för att skapa en blastocyst, från vars inre cellmassa linjer av ESC som är genetiskt identiska med donatorn av den somatiska kärnan sedan isoleras. Tekniskt sett är denna idé fullt genomförbar, eftersom möjligheten att skapa ESC-linjer från blastocyster erhållna efter transplantation av somatiska kärnor till enukleerade ägg upprepade gånger har bevisats i experiment på laboratoriedjur (Nagy, 1990; Munsie, 2000). I synnerhet, hos möss homozygota för rag2-genmutationen, användes fibroblaster erhållna genom odling av subepidermala vävnadsceller som donatorer av kärnor, vilka transplanterades till enukleerade oocyter. Efter oocytaktivering odlades "zygoten" tills blastocystbildning, från vars inre cellmassa ESC isolerades och överfördes till en linje av celler som inte var nullizygota för den muterade genen (rag2~/~). Mutationen av en allelgen korrigerades i sådana ESC med hjälp av homolog rekombination. I den första experimentserien erhölls embryoidkroppar från ESC med en rekombinant återställd gen, deras celler transfekterades med ett rekombinant retrovirus (HoxB4i/GFP) och injicerades, efter reproduktion, i venen hos rag2~/~-möss. I den andra serien aggregerades tetraploida blastomerer med genetiskt modifierade ESC och transplanterades till mottagarhonor. De resulterande immunkompetenta mössen fungerade som benmärgsdonatorer för transplantation till rag2~/~-mutantmöss. I båda serierna var resultatet positivt: efter 3-4 veckor hittades mogna normala myeloid- och lymfoidceller med förmåga att producera immunglobuliner hos alla möss. Således kan transplantation av somatiska cellkärnor till oocyter användas inte bara för att erhålla ESC-linjer, utan också för cytogenoterapi - korrigering av ärftliga anomalier, med användning av ESC som en vektor för transport av korrigerande genetisk information. Men denna inriktning på celltransplantation har, förutom bioetiska problem, sina begränsningar. Det är oklart hur säker transplantation av terapeutiskt klonade celler med en genotyp identisk med genotypen hos en specifik patient kommer att vara, eftersom sådana celler kan introducera mutationer som skapar en predisposition för andra sjukdomar. Normala mänskliga ägg är fortfarande ett svårtillgängligt objekt, medan även vid transplantation av somatiska kärnor till enukleerade djurägg utvecklas endast 15-25% av de konstruerade "zygoterna" till blastocyststadiet. Det är ännu inte fastställt hur många blastocyster som krävs för att erhålla en linje av pluripotenta klonade ESC. Det är också värt att notera de höga ekonomiska kostnaderna som är förknippade med komplexiteten i den terapeutiska kloningsmetoden.

Sammanfattningsvis bör det noteras att i ESC kombineras genomets pluripotens med hypometylerat DNA med hög telomerasaktivitet och en kort C^-fas i cellcykeln, vilket säkerställer deras intensiva och potentiellt oändliga reproduktion, under vilken ESC behåller en diploid uppsättning kromosomer och en "juvenil" uppsättning fenotypiska egenskaper. Klonal tillväxt av ESC i kultur stör inte deras differentiering till någon specialiserad cellinje i organismen när proliferationen stoppas och lämpliga regleringssignaler läggs till. Restriktionsdifferentiering av ESC till somatiska cellinjer in vitro realiseras utan mesenkymets deltagande, förbi Nochteys, utanför organogenesen och utan embryobildning. Ektopisk introduktion av ESC in vivo leder oundvikligen till bildandet av teratokarcinom. Transplantation av ESC till en blastocyst eller ett tidigt embryo åtföljs av deras integration med embryonala vävnader och stabil chimerisering av dess organ.

Regenerativ-plastisk teknologi baserad på celltransplantation är skärningspunkten mellan intressen för representanter för cellbiologi, utvecklingsbiologi, experimentell genetik, immunologi, neurologi, kardiologi, hematologi och många andra grenar av experimentell och praktisk medicin. De viktigaste resultaten från experimentella studier visar möjligheten att omprogrammera stamceller med en riktad förändring av deras egenskaper, vilket öppnar upp möjligheter att kontrollera cytodifferentieringsprocesserna med hjälp av tillväxtfaktorer - för myokardiell regenerering, återställning av CNS-lesioner och normalisering av funktionen hos bukspottkörtelns öapparat. För en bred introduktion av transplantation av ESC-derivat i praktisk medicin är det dock nödvändigt att studera egenskaperna hos mänskliga stamceller mer i detalj och fortsätta experiment med ESC på experimentella sjukdomsmodeller.

Bioetiska frågor och problemet med avstötning av allogena celltransplantationer skulle kunna lösas genom den upptäckta plasticiteten hos genomet hos regionala stamceller från en vuxen organism. Emellertid revideras och kritiseras nu den initiala informationen att när isolerade och noggrant karakteriserade hematopoetiska autologa celler transplanteras till levern, från vilka nya hepatocyter härleds och integreras i leverlobuli. Trots detta har data publicerats som visar att transplantation av neurala stamceller till tymus orsakar bildandet av nya donator-T- och B-lymfocytgroddar, och transplantation av hjärnneuronstamceller till benmärg leder till bildandet av hematopoetiska groddar med långvarig donatormyelo- och erytropoes. Följaktligen kan pluripotenta stamceller som kan omprogrammera genomet till potentialen hos ESC:er kvarstå i organen hos en vuxen organism.

Källan för att erhålla ESC för medicinska ändamål är fortfarande det mänskliga embryot, vilket förutbestämmer det oundvikliga i en ny skärningspunkt mellan moraliska, etiska, juridiska och religiösa frågor vid det mänskliga livets ursprung. Upptäckten av ESC har gett en kraftfull drivkraft till återupptagandet av tuffa diskussioner om var gränsen går mellan levande celler och materia, varelse och personlighet. Samtidigt finns det inga universella normer, regler och lagar för användningen av ESC inom medicin, trots upprepade försök att skapa och anta dem. Varje stat löser detta problem självständigt inom ramen för sin lagstiftning. För sin del fortsätter läkare runt om i världen att försöka ta regenerativ-plastisk medicin bortom ramen för sådana diskussioner, främst genom användning av vuxna stamcellsreserver snarare än embryonala stamceller.

Lite historia om isoleringen av embryonala stamceller

Terato(embryo)karcinomceller isolerades från spontant uppkomna testikelteratom hos 129/ter-Sv-möss, spontana äggstocksteratom hos Lt/Sv-möss och från teratom härledda från ektopiskt transplanterade embryonala celler eller vävnader. Bland de stabila mus-terato(embryo)karcinomcellinjerna som erhölls på detta sätt var vissa pluripotenta, andra differentierade endast till en specifik celltyp och vissa var helt oförmögna till cytodifferentiering.

En gång i tiden låg fokus på studier vars resultat indikerade möjligheten att återställa terato-(embryo)-karcinomceller till en normal fenotyp efter att de införts i vävnaderna hos ett utvecklande embryo, samt arbete med in vitro-skapandet av genetiskt modifierade terato-(embryo)-karcinomceller, med hjälp av vilka mutanta möss erhölls för biologisk modellering av mänsklig ärftlig patologi.

Konditionerad suspensionsodling användes för att isolera terato-(embryo)-karcinomcellinjer. I kultur växer terato-(embryo)-karcinomceller, liksom ESC, till embryoidkroppar och kräver obligatorisk dissociation för linjeöverföring, vilket bibehåller pluripotens på ett matarlager av embryonala fibroblaster eller under suspensionsodling i ett konditionerat medium. Celler av pluripotenta terato-(embryo)-karcinomlinjer är stora, sfäriska, kännetecknas av hög alkalisk fosfatasaktivitet, bildar aggregat och kan differentieras i flera riktningar. När de introduceras i en blastocyst aggregerar de med morula, vilket leder till bildandet av chimära embryon, i sammansättningen av olika organ och vävnader av vilka derivat av terato-(embryo)-karcinomceller finns. Emellertid dör den överväldigande majoriteten av sådana chimära embryon i livmodern, och i organen hos överlevande nyfödda chimärer detekteras främmande celler sällan och med låg densitet. Samtidigt ökar förekomsten av tumörer (fibrosarkom, rabdomyosarkom, andra typer av maligna tumörer och pankreasadenom) kraftigt, och tumördegeneration inträffar ofta under perioden med intrauterin utveckling av chimära embryon.

De flesta terato-(embryo)-karcinomceller i mikromiljön hos normala embryonala celler förvärvar nästan naturligt maligna neoplastiska egenskaper. Man tror att irreversibel malignitet beror på aktiveringen av proto-onkogener i processen med strukturella omstruktureringar. Ett av undantagen är celler av embryocarcinomlinjen SST3, erhållna från testikelteratom hos mus (linje 129/Sv-ter), vilka uppvisar en hög förmåga att integreras i embryots vävnader och organ utan efterföljande tumörbildning hos chimära möss. Derivat av terato-(embryo)-karcinomcellinjer hos chimära möss deltar praktiskt taget inte i bildandet av primära gonocyter. Tydligen beror detta på den höga frekvensen av kromosomavvikelser som är karakteristiska för de flesta terato-(embryo)-karcinomlinjer, i vilka celler både aneuploidi och kromosomavvikelser observeras.

Flera stabila linjer av humana terato-(embryo)-karcinomceller, kännetecknade av pluripotens, hög proliferativ aktivitet och förmåga att differentiera under tillväxt i kulturer, erhölls under laboratorieförhållanden. I synnerhet användes linjen av humana terato-(embryo)-karcinomceller NTERA-2 för att studera mekanismerna för neural cytodifferentiering. Efter transplantation av celler från denna linje till den subventrikulära regionen av framhjärnan hos nyfödda råttor observerades deras migration och neurogenes. Försök gjordes till och med att transplantera neuroner erhållna genom odling av celler från terato-(embryo)-karcinomlinjen NTERA-2 till patienter med stroke, vilket enligt författarna ledde till en förbättring av sjukdomens kliniska förlopp. Samtidigt fanns inga fall av malignitet hos transplanterade celler från terato-(embryo)-karcinomlinjen NTERA-2 hos patienter med stroke.

De första linjerna av odifferentierade pluripotenta embryonala stamceller från mus erhölls i början av 1980-talet av Evans och Martin, som isolerade dem från blastocystens inre cellmassa – embryoblasten. De isolerade ESC-linjerna behöll pluripotens och förmågan att differentiera till olika celltyper under påverkan av faktorer i ett speciellt odlingsmedium under lång tid.

Termen "embryonal pluripotent stamcell" tillhör i sig Leroy Stevens, som under sin studie av tobakstjärans effekt på tumörutveckling uppmärksammade den spontana förekomsten av testikelteratokarcinom hos linjära (129/v) möss i kontrollgruppen. Cellerna i testikelteratokarcinom kännetecknades av en hög proliferationshastighet, och i närvaro av vätska från bukhålan differentierade de spontant med bildandet av neuroner, keratinocyter, kondrocyter, kardiomyocyter, samt hår- och benfragment, men utan några tecken på ordnad cytoarkitektur hos motsvarande vävnad. När de placerades i kultur växte teratokarcinomcellerna som pluripotenta kloner som inte var fästa vid substratet och bildade embryoidkroppar, varefter de upphörde att dela sig och genomgick spontan oordnad differentiering till neuroner, gliaceller, muskelceller och kardiomyocyter. Stevens fann att mus-teratokarcinom 129/v innehåller mindre än 1 % celler som kan differentieras till en mängd olika specialiserade somatiska linjer, och själva differentieringen beror på de faktorer som påverkar dem (sammansättningen av peritonealvätskan, produkter från mogna celler eller vävnader som tillsätts till kulturen). Leroy Stevensons hypotes om förekomsten av embryonala progenitorceller från groddlinjen bland teratokarcinomceller bekräftades: en suspension av embryoblastceller från preimplantationsembryon i vävnaderna hos vuxna möss bildade teratokarcinom, och rena cellinjer isolerade från dem efter intraperitoneal administrering till mottagardjur differentierade till neuroner, kardiomyocyter och andra somatiska celler härledda från alla tre groddskikten. I in vivo-experiment resulterade transplantation av ESC (erhållna från embryoblasten, men inte trofoblasten) till musembryon från en annan linje i blastomerstadierna 8-32 i födelsen av chimära djur (utan utveckling av tumörer), i vars organ groddar av donatorvävnad hittades. Chimärism observerades även i groddcellslinjen.

Primära progenitorkönsceller isolerade från genitalrudimentet hos ett musembryo motsvarade i morfologi, immunologisk fenotyp och funktionella egenskaper de ESC:er som Stevenson erhöll från teratokarcinom och embryoblast. I chimärer födda efter att ESC:er introducerats i en blastocyst kännetecknades allofenmorfogenes av organ av en mosaikväxling av donator- och mottagarstrukturer och funktionella enheter i lever, lungor och njurar. I vissa fall observerades bildandet av tarmkrypter eller leverlobuler bestående av både mottagar- och donatorceller. Morfogenes realiserades dock alltid i enlighet med det genetiska programmet hos den art som mottagaren tillhörde, och chimärism var begränsad uteslutande till cellnivå.

Det fastställdes sedan att proliferation av ESC utan cytodifferentiering på ett matarlager av mesenkym-deriverade celler (fetala fibroblaster) sker med obligatorisk närvaro av LIF i selektiva näringsmedier, vilka selektivt säkerställer överlevnaden av endast stam- och progenitorceller, medan den överväldigande majoriteten av specialiserade cellulära element dör. Med hjälp av sådana metoder isolerade James Thomson 1998 fem immortaliserade linjer av embryonala stamceller från den inre cellmassan i en mänsklig blastocyst. Samma år utvecklade John Gerhart en metod för att isolera odödliga ESC-linjer från genitalknölen hos fyra till fem veckor gamla mänskliga embryon. På grund av deras unika egenskaper började embryonala stamceller och stamceller från definitiva vävnader, bara två år senare, användas inom regenerativ medicin och genterapi.