Neurala stamceller

Experimentella bevis för möjligheten till regenerering av CNS-celler erhölls mycket tidigare än upptäckten av embryonala stamceller i studier som visade närvaron av celler i neocortex, hippocampus och luktlökarna i hjärnan hos vuxna råttor som fångar 3H-tymidin, dvs. är kapabla till proteinsyntes och delning. Redan på 60-talet av förra seklet antogs det att dessa celler är föregångare till neuroner och är direkt involverade i inlärnings- och minnesprocesser. Lite senare avslöjades närvaron av synapser på neuroner som bildats de novo och de första arbetena med användning av embryonala stamceller för att inducera neurogenes in vitro dök upp. I slutet av 1900-talet ledde experiment med riktad differentiering av ESC till neurala progenitorceller, dopaminerga och serotonerga neuroner till en revidering av de klassiska idéerna om däggdjursnervcellers förmåga att regenerera. Resultaten av ett flertal studier har övertygande bevisat både verkligheten av omstruktureringen av neurala nätverk och förekomsten av neurogenes under hela perioden av däggdjursorganismens postnatala liv.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Källor till neurala stamceller

Mänskliga neurala stamceller isoleras under operationer på den subventrikulära regionen av laterala ventriklar och dentatus gyrus i hippocampus, vars celler bildar neurosfärer (neurala sfärer) i kultur, och efter dispersion och preformation av de senare - alla huvudcelltyper i centrala nervsystemet eller, i ett speciellt medium, nya mikrosfärer. I suspensionskulturer av dissocierad vävnad isolerad från de periventrikulära regionerna i den embryonala hjärnan uppstår också neurosfärer.

Markörer för omogna hjärnceller inkluderar nestin, beta-tubulin III (neuronal härstamningsmarkör), vimentin, GFAP och NCAM, vilka identifieras immunocytokemiskt med hjälp av monoklonala antikroppar. Nestin (intermediärt neurofilamentprotein typ IV) uttrycks av multipotenta neuroektodermala celler. Detta protein används för att identifiera och isolera multipotenta neuroepiteliala progenitorceller från CNS med hjälp av monoklonala antikroppar Rat-401, som kan detektera upp till 95 % av neuralrörscellerna i råttembryon på den elfte dagen av dräktigheten. Nestin uttrycks inte på differentierade avkommor till neurala stamceller, men finns i tidiga neurala progenitorceller, postmitotiska neuroner och tidiga neuroblaster. Denna markör har använts för att identifiera neuroepiteliala progenitorceller och för att bevisa förekomsten av stamceller i CNS. Vimentin (intermediärt neurofilamentprotein typ III) uttrycks av neurala och gliala progenitorceller, såväl som neuroner, fibroblaster och glatta muskelceller. Därför saknar båda immunocytokemiska markörerna den specificitet som krävs för att separat identifiera neurala stam- och progenitorceller. Beta-tubulin III fastställer den neuronala riktningen för stamcellsdifferentiering, medan typ I-astrocyter identifieras genom GFAP-uttryck, och oligodendrocyter uttrycker specifikt galaktocerebrosid (Ga!C).

FGF2 och EGF fungerar som mitogener för neurala progenitorceller och stöder proliferationen av odifferentierade progenitorceller i kultur med bildandet av neurosfärer. Hastigheten för neurala stamcellsdelning ökar signifikant under inverkan av FGF2, såväl som med användning av en kombination av FGF2 + EGF. De proliferativa effekterna av FGF2 medieras av FGF2-R1-receptorer. Heparin ökar affiniteten för FGF2-receptorbindning och förbättrar dramatiskt dess mitogena effekt på neuroepitelceller. I de tidiga stadierna av embryogenesen uttrycks FGF2-receptorer i råttans telencephalon, medan deras lokalisering i senare stadier är begränsad till den ventrikulära zonen. Toppen av FGF2-R1-uttryck av postmitotiska celler observeras efter avslutad tidig neurogenesperioden. Den initiala perioden av telencephalonutveckling kännetecknas av en låg nivå av EGF-receptoruttryck, huvudsakligen i cellerna i den ventrala regionen. I senare stadier av embryogenesen ökar EGF-R-uttrycket i dorsal riktning. I gnagarhjärnan har EGF en hög affinitet för den transformerande tillväxtfaktor beta-receptorn (TGF-beta-R), som den företrädesvis binder till. Indirekta bevis för EGF-R:s funktionella roll tillhandahålls av data om kortikal dysgenes i framhjärnan som inträffar i den sena perioden av embryogenesen och postnatal ontogenes, minskad framhjärnsfunktion, kortikal celldöd och hippocampus ektopi hos möss med EGF-receptorgen-knockout. Dessutom är närvaron av TGF-a i näringsmediet absolut nödvändig för bildandet av neurosfärer. Efter att tillväxtfaktorer har avlägsnats från det konditionerade mediet slutar cellerna dela sig och genomgår spontan differentiering med bildandet av neuroner, astrocyter och oligodendroblaster.

Med hänsyn till detta utförs reaggregation av dissocierade stamceller och odling av neurosfärer i näringsmedier innehållande EGF och basisk FGF eller FGF2, men utan tillsats av serum. Det har visats att EGF inducerar proliferation av stamceller i den subependymala zonen i de laterala ventriklarna, och basisk FGF främjar proliferation av stamceller i striatum, hippocampus, neocortex och synnerven i den mogna hjärnan. Kombinationen av EGF och basisk FGF är absolut nödvändig för aktiv proliferation av stamceller isolerade från ependym i den tredje och fjärde ventriklarna i framhjärnan, såväl som från spinalkanalen i bröst- och ländryggmärgen.

Efter dissociation odlas suspensionen av neurala stamceller i plastskålar eller plattor med flera brunnar utan ett självhäftande substrat för att öka storleken på de nya neurosfärerna som bildas, vilket vanligtvis tar cirka 3 veckor. Metoden med multipel dispersion och reproduktion av neurosfärer möjliggör erhållande av ett tillräckligt antal linjära kloner av multipotenta stamceller för intracerebral transplantation. Denna princip är också grunden för att skapa en bank av stamceller isolerade från den mänskliga embryonala hjärnan. Deras långsiktiga (över flera år) kloning gör det möjligt att erhålla stabila linjer av neurala stamceller, från vilka katekolaminerga neuroner bildas under inducerad differentiering.

Om neurosfärer inte dispergeras och odlas på adhesiva substrat i medier som saknar tillväxtfaktorer, börjar prolifererande stamceller spontant differentieras för att bilda neuronala och gliaala prekursorceller som uttrycker markörer för alla typer av nervceller: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulin III (neuroner), GFAP (astrocyter) och CalC, O4 (oligodendrocyter). Till skillnad från mus- och råttceller står neuroner för mer än 40 % av alla differentierade celler i humana neurala stamcellskulturer (från 1 till 5 % hos gnagare), men betydligt färre oligodendrocyter bildas, vilket är mycket viktigt ur cellterapisynpunkt för demyeliniserande sjukdomar. Problemet löses genom att tillsätta B104-odlingsmedium, vilket stimulerar bildandet av myelinproducerande celler.

Vid odling av neurala progenitorceller från hjärnan hos mänskliga embryon i ett medium innehållande EGF, basisk FGF och LIF ökar antalet neurala prekursorceller 10 miljoner gånger. Celler som expanderat in vitro behåller förmågan att migrera och differentiera till neurala och gliala element efter transplantation till hjärnan hos mogna råttor. Emellertid är antalet delningar av multipotenta prekursorceller begränsat in vivo. Det har upprepade gånger noterats att Hayflick-gränsen för en "vuxen" neural stamcell (cirka 50 mitoser) fortfarande är ouppnåelig även i ett experiment - celler i form av neurosfärer behåller sina egenskaper i endast 7 månader och först efter 8 passager. Man tror att detta beror på särdragen hos deras dispersionsmetoder under passage (trypsinisering eller mekanisk verkan), vilket kraftigt minskar cellernas proliferativa aktivitet på grund av störningar i intercellulära kontakter. Om istället för dispersion används metoden att dela neurosfärer i 4 delar, ökar cellernas livskraft under passage avsevärt. Denna metod gör det möjligt att odla mänskliga neurala stamceller i 300 dagar. Efter denna period förlorar dock cellerna mitotisk aktivitet och genomgår degeneration eller går in i stadiet av spontan differentiering med bildandet av neuroner och astrocyter. På grundval av detta anser författaren att 30 mitoser är det maximala antalet delningar för odlade neurala stamceller.

När mänskliga neurala stamceller odlas in vitro bildas huvudsakligen GABAerga neuroner. Utan speciella förhållanden ger neurala progenitorceller upphov till dopaminerga neuroner (nödvändiga för cellterapi av Parkinsons sjukdom) endast i de första passagerna, varefter alla neuroner i kulturen uteslutande består av GABAerga celler. Hos gnagare orsakar IL-1 och IL-11, såväl som fragment av nervcellsmembran, LIF och GDNF, induktion av dopaminerga neuroner in vitro. Denna metodologiska metod har dock visat sig misslyckad hos människor. När GABAerga neuroner transplanteras intracerebralt in vivo, under inverkan av mikromiljöfaktorer, uppstår dock nervceller med olika mediatorfenotyper.

Sökning efter kombinationer av neurotrofiska faktorer visade att FGF2 och IL-1 inducerar bildandet av dopaminerga neuroblaster, vilka emellertid inte kan producera dopaminerga neuroner. Differentiering av hippocampala stamceller till exciterande glutamaterga och hämmande GABA-erga neuroner sker under inverkan av neurotrofiner, och EGF och IGF1 inducerar bildandet av glutamaterga och GABA-erga neuroner från neurala progenitorceller från mänskliga embryon. Sekventiell tillsats av retinsyra och neurotrofin 3 (NT3) till kulturen ökar signifikant differentieringen av mogna hjärnstamceller från hippocampus till neuroner av olika mediatorkaraktär, medan en kombination av hjärnderiverad neurotrofisk faktor (BNDF), NT3 och GDNF kan producera pyramidala neuroner i hippocampala och neokortikala kulturer.

Resultaten från ett flertal studier indikerar således att stamceller från olika hjärnstrukturer, under inverkan av lokala specifika vävnadsfaktorer, kan differentieras in vivo till neuronala fenotyper som är inneboende i dessa strukturer. För det andra gör riktad inducerad differentiering av neurala stamceller in vitro med hjälp av kloning av progenitorceller det möjligt att erhålla nerv- och gliaceller med specificerade fenotypiska egenskaper för intracerebral transplantation vid olika former av hjärnpatologi.

Det råder ingen tvekan om att pluripotenta stamceller isolerade från embryon eller vuxen CNS kan betraktas som en källa till nya neuroner och användas kliniskt för behandling av neurologisk patologi. Det största hindret för utvecklingen av praktisk cellulär neurotransplantation är dock det faktum att de flesta neurala stamceller inte differentierar till neuroner efter implantation i icke-neurogena zoner i det mogna CNS. För att kringgå detta hinder föreslås en mycket originell innovativ metod som möjliggör in vitro-erhållande av en ren population av neuroner från humana fetala neurala stamceller efter transplantation till CNS hos en mogen råtta. Författarna bevisar att differentieringen av celler implanterade med denna metod slutar med bildandet av neuroner av den kolinerga fenotypen, vilket beror på påverkan av faktorer i den omgivande mikromiljön. Den föreslagna tekniken är av intresse ur synvinkeln att utveckla nya typer av stamcellsbaserad terapi och ersätta neuroner som skadats på grund av skada eller neurodegenerativ sjukdom, eftersom kolinerga neuroner spelar en ledande roll i utvecklingen av motoriska, minnes- och inlärningsfunktioner. I synnerhet kan kolinerga neuroner isolerade från mänskliga stamceller användas för att ersätta motorneuroner som förlorats vid amyotrofisk lateralskleros eller ryggmärgsskador. För närvarande finns det ingen information om metoder för att producera ett betydande antal kolinerga neuroner från en population av mitogen-förbildade stamceller. Författarna föreslår en ganska enkel men effektiv metod för att stimulera mitogen-förbildade primära mänskliga embryonala neurala stamceller att utvecklas till praktiskt taget rena neuroner efter implantation i både icke-neurogena och neurogena zoner i CNS hos en mogen råtta. Det viktigaste resultatet av deras arbete är omvandlingen av ett tillräckligt stort antal transplanterade celler till kolinerga neuroner när de implanteras i mellersta membranet och ryggmärgen.

Dessutom föreslås det, för preformation av neurala stamceller från den 8 veckor gamla mänskliga embryonala hjärnbarken till kolinerga neuroner in vitro, att olika kombinationer av följande trofiska faktorer och kemiska element används: rekombinant basisk FGF, EGF, LIF, musaminoterminal ljudpeptid (Shh-N), trans-retinsyra, NGF, BDNF, NT3, NT4, naturligt laminin och musheparin. Den ursprungliga linjen av humana neurala stamceller (K048) bibehölls in vitro i två år och motstod 85 passager utan förändringar i proliferativa och differentierande egenskaper samtidigt som en normal diploid karyotyp bibehölls. Odispergerade neurosfärer från passagerna 19–55 (veckorna 38–52) ströks ut på poly-d-lysin och laminin och behandlades sedan med ovan nämnda faktorer i olika koncentrationer, kombinationer och sekvenser. Kombinationen av basisk FGF, heparin och laminin (förkortat FHL) gav en unik effekt. Efter en dags odling av embryonala neurala stamceller i FHL-medium med eller utan Shh-N (kombinationen av Shh-N + FHL i förkortningen SFHL) observerades en snabb proliferation av stora plana celler. Alla andra endagsprotokoll (såsom basisk FGF + laminin) ledde däremot till en begränsad radiell spridning av spindelformade celler, och dessa celler lämnade inte kärnan i neurosfärerna. Efter 6 dagars aktivering och efterföljande 10 dagars differentiering i B27-innehållande medium detekterades stora multipolära neuronliknande celler vid kanten av FHL-aktiverade sfärer. I andra protokollgrupper förblev de flesta neuronliknande celler små och bipolära eller unipolära. Immuncytokemisk analys visade att små (< 20 μm) bipolära eller unipolära celler var antingen GABAerga eller glutamaterga, medan de flesta stora multipolära celler lokaliserade vid kanten av FHL-aktiverade neurosfärer var kolinerga och uttryckte markörer karakteristiska för kolinerga neuroner (Islet-1 och ChAT). Några av dessa neuroner uttryckte samtidigt synapsin 1. Som ett resultat av fem serier av oberoende experiment fann författarna att den totala populationen av celler i enkelskiktszonerna differentierade till TuJ1+ neuroner med 45,5%, medan kolinerga (ChAT^) neuroner endast utgjorde 27,8% av cellerna i samma population. Efter 10 dagar av ytterligare differentiering in vitro, förutom kolinerga neuroner, hittades ett betydande antal små neuroner i de FHL-aktiverade neurosfärerna - glutamaterga (6,3%), GABA-erga (11,3%), samt astrocyter (35,2%) och nestin-positiva celler (18,9%). Vid användning av andra kombinationer av tillväxtfaktorer saknades kolinerga neuroner, och neurosfärernas marginalceller bildade antingen astrocyter eller små glutamaterga och GABA-erga neuroner. Övervakning av reserv- och aktiva potentialer med hjälp av helcellspatchclamp-teknik visade att efter sju dagars FHL-aktivering hade de flesta stora polypolära celler en vilopotential på -29,0 ± 2,0 mV i frånvaro av aktionspotential. Efter 2 veckor ökade vilopotentialen till -63.6 ± 3,0 mV, och aktionspotentialer observerades vid induktion av depolariserande strömmar och blockerades av 1 M tetrodotoxin, vilket indikerar den funktionella aktiviteten hos kolinerga omogna neuroner.

Författarna fastställde vidare att FHL- eller SFHL-aktivering in vitro i sig inte resulterar i bildandet av mogna neuroner och försökte fastställa huruvida FHL- eller SFHL-förbildade stamceller kan differentieras till kolinerga neuroner när de transplanteras in i CNS hos mogna råttor. För detta ändamål injicerades aktiverade celler i den neurogena zonen (hippocampus) och i flera icke-neurogena zoner, inklusive prefrontala cortex, mellersta membranet och ryggmärgen hos vuxna råttor. De implanterade cellerna spårades med hjälp av CAO-^^p-vektorn. OCP är känt för att märka både cellulär ultrastruktur och cellulära processer (molekylär nivå) utan läckage och kan visualiseras direkt. Dessutom upprätthåller OCP-märkta neurala stamceller en profil av neuronal och gliadifferentiering identisk med den hos icke-transformerade stamceller i den embryonala hjärnan.

En till två veckor efter implantation av 5 x 104 ^aktiverade och märkta neurala stamceller hittades de i ryggmärgen eller hjärnan hos råttor, med OCD+ celler huvudsakligen belägna nära injektionsstället. Migrations- och integrationsprocesser observerades så tidigt som en månad efter transplantation. Migrationsgränserna varierade beroende på injektionsstället: vid injektion i prefrontala cortex var OCD+ celler belägna 0,4–2 mm från injektionsstället, medan cellerna vid implantation i mellersta membranet, hippocampus eller ryggmärgen migrerade mycket längre sträckor – upp till 1–2 cm. De transplanterade cellerna lokaliserades i välorganiserade CNS-strukturer, inklusive frontala cortex, mellersta membranet, hippocampus och ryggmärgen. OCD-märkta neuronala element var synliga redan den första veckan efter transplantation, och deras antal ökade signifikant en månad efter operationen. Stereologisk analys visade en högre överlevnadsgrad för implanterade celler i olika strukturer i hjärnan, jämfört med ryggmärgen.

Det är känt att i de flesta vävnader hos vuxna däggdjur bevaras en population av regionala stamceller, vars omvandling till mogna celler regleras av specifika vävnadsfaktorer. Proliferationen av stamceller, differentieringen av progenitorceller och bildandet av neuronala fenotyper specifika för en given hjärnstruktur in vivo uttrycks i mycket större utsträckning i den embryonala hjärnan, vilket bestäms av närvaron av höga koncentrationer av morfogenetiska faktorer i den lokala mikromiljön - neurotrofinerna BDNF, NGF, NT3, NT4/5 och tillväxtfaktorerna FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Var finns neurala stamceller?

Det har fastställts att neurala stamceller uttrycker glial surt fibrillärt protein, vilket bland mogna celler i den neurala linjen endast finns kvar på astrocyter. Därför kan astrocytiska celler vara stamreserven i det mogna CNS. Faktum är att neuroner som härrör från GFAP-positiva prekursorer identifierades i luktlökar och dentate gyrus, vilket motsäger traditionella idéer om den radiella gliacellernas progenitorroll, eftersom de inte uttrycker GFAP i dentate gyrus i vuxen ålder. Det är möjligt att det finns två populationer av stamceller i CNS.

Frågan om stamcellernas lokalisering i den subventrikulära zonen förblir också oklar. Enligt vissa författare bildar ependymala celler sfäriska kloner i kultur som inte är riktiga neurosfärer (som kloner av subependymala celler), eftersom de endast kan differentieras till astrocyter. Å andra sidan, efter fluorescerande eller viral märkning av ependymala celler, detekteras markören i cellerna i det subependymala lagret och luktlökar. Sådana märkta celler bildar in vitro neurosfärer och differentierar till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter. Dessutom har det visats att cirka 5% av cellerna i ependym uttrycker stammarkörer - nestin, Notch-1 och Mussashi-1. Det antas att mekanismen för asymmetrisk mitos är förknippad med den ojämna fördelningen av membranreceptorn Notch-1, vilket resulterar i att den senare stannar kvar på membranet hos dottercellen lokaliserad i den ependymala zonen, medan modercellen som migrerar till det subependymala lagret berövas denna receptor. Ur denna synvinkel kan den subependymala zonen betraktas som en samlare av progenitorprekursorer till neuroner och gliaceller bildade från stamceller i det ependymala lagret. Enligt andra författare bildas endast gliaceller i de kaudala delarna av den subventrikulära zonen, och källan till neurogenes är cellerna i den rostral-laterala delen. I den tredje varianten ges de främre och bakre delarna av den subventrikulära zonen i de laterala ventriklarna motsvarande neurogen potential.

Den fjärde varianten av stamreservens organisation i det centrala nervsystemet verkar föredra, enligt vilken tre huvudtyper av neurala progenitorceller särskiljs i den subventrikulära zonen - A, B och C. A-celler uttrycker tidiga neuronala markörer (PSA-NCAM, TuJl) och omges av B-celler, vilka identifieras som astrocyter genom uttryck av antigener. C-celler, som inte har några antigena egenskaper hos neuroner eller glia, har hög proliferativ aktivitet. Författaren har övertygande bevisat att B-celler är prekursorer till A-celler och de novo neuroner i luktlökarna. Under migrationen omges A-cellerna av strängar av neurala progenitorceller, vilket skiljer sig avsevärt från migrationsmekanismen för postmitotiska neuroblaster längs den radiella glia i den embryonala hjärnan. Migrationen slutar i luktlökarna med mitotisk delning av både A- och B-celler, vars derivat inkorporeras i de granulära cellskikten och i det glomerulära skiktet i hjärnans luktzon.

Den utvecklande embryonala hjärnan saknar differentierade ependymala celler, och ventrikulärväggarna innehåller prolifererande stamceller från de ventrikulära germinala och subventrikulära zonerna, där primära neuro- och glioblaster migrerar. Baserat på detta tror vissa författare att den subependymala regionen av den mogna hjärnan innehåller reducerad embryonal germinal nervvävnad bestående av astrocyter, neuroblaster och oidentifierade celler. Äkta neurala stamceller utgör mindre än 1% av cellerna i den germinala zonen av den laterala ventrikulärväggen. Delvis av denna anledning, och även i samband med data att astrocyter i den subependymala zonen är föregångare till neurala stamceller, utesluts inte möjligheten till transdifferentiering av astrocytiska gliaelement med förvärv av neuronala fenotypiska egenskaper.

Det största hindret för en slutgiltig lösning på problemet med lokalisering av neurala stamceller in vivo är bristen på specifika markörer för dessa celler. Icke desto mindre är rapporterna om att neurala stamceller isolerats från CNS-regioner som inte innehåller subependymala zoner - den tredje och fjärde kammaren i framhjärnan, spinalkanalen i bröstkorgens och ländryggens regioner i ryggmärgen mycket intressanta. Av särskild betydelse är det faktum att ryggmärgsskada ökar proliferationen av ependymala stamceller i den centrala kanalen med bildandet av progenitorceller som migrerar och differentierar till astrocyter i det gliomesodermala ärret. Dessutom hittades prekursorceller till astro- och oligodendrocyter också i den oskadade ryggmärgen hos vuxna råttor.

Litteraturdata visar således övertygande förekomsten i CNS hos vuxna däggdjur, inklusive människor, av en regional stamreserv, vars regenerativa-plastiska kapacitet tyvärr endast kan tillhandahålla processer för fysiologisk regenerering med bildandet av nya neuronala nätverk, men inte uppfyller behoven för reparativ regenerering. Detta ställer uppgiften att söka efter möjligheter att öka CNS stamresurser genom exogena metoder, vilket är olösligt utan en tydlig förståelse av mekanismerna för CNS-bildning under embryonalperioden.

Idag vet vi att neuralrörsstamceller under embryonal utveckling är källan till tre celltyper - neuroner, astrocyter och oligodendrocyter, dvs. neuroner och neuroglia härstammar från en enda prekursorcell. Differentieringen av ektodermen till kluster av neurala progenitorceller börjar under inverkan av produkterna från de proneurala generna i bHLH-familjen och blockeras av uttrycket av receptortransmembranproteinderivat från Notch-familjens gener, vilket begränsar bestämningen och tidig differentiering av neurala prekursorceller. Liganderna för Notch-receptorerna är i sin tur transmembrana Delta-proteiner från angränsande celler, på grund av vars extracellulära domän direkta intercellulära kontakter med induktiv interaktion mellan stamceller utförs.

Det vidare genomförandet av programmet för embryonal neurogenes är inte mindre komplext och bör, verkar det, vara artspecifikt. Resultaten från neuroxenotransplantationsstudier tyder dock på att stamceller har en uttalad evolutionär konservatism, vilket gör att mänskliga neurala stamceller kan migrera och utvecklas när de transplanteras till råtthjärnan.

Det är känt att däggdjurs CNS har en extremt låg kapacitet för reparativ regenerering, vilket kännetecknas av avsaknaden av tecken på uppkomsten av nya cellulära element i den mogna hjärnan för att ersätta neuroner som dött till följd av skada. Vid neuroblasttransplantation kan dock de senare inte bara implantera, proliferera och differentiera, utan de kan också integreras i hjärnstrukturer och funktionellt ersätta förlorade neuroner. Vid transplantation av dedikerade neuronala progenitorceller var den terapeutiska effekten betydligt svagare. Sådana celler har visat sig ha en låg migrationskapacitet. Dessutom reproducerar inte neuronala progenitorceller arkitekturen hos neurala nätverk och är inte funktionellt integrerade i mottagarens hjärna. I detta avseende studeras aktivt frågor om reparativ-plastisk regenerering under transplantation av icke-förformade multipotenta neurala stamceller.

I studien av M. Aleksandrova et al. (2001), i den första versionen av experimenten, var mottagarna könsmogna honråttor och donatorerna var 15 dagar gamla embryon. En del av hjärnans occipitala cortex togs bort från mottagarna, och mekaniskt suspenderad vävnad från den presumptiva embryonala cortex innehållande multipotenta stamceller från de ventrikulära och subventrikulära regionerna transplanterades in i kaviteten. I den andra versionen av experimenten transplanterades neurala stamceller från ett 9 veckor gammalt mänskligt embryo in i hjärnan hos könsmogna råttor. Författarna isolerade vävnadsbitar från den periventrikulära regionen av den embryonala hjärnan, placerade dem i ett F-12-näringsmedium och erhöll en cellsuspension genom upprepad pipettering, och odlade dem sedan i ett speciellt NPBM-medium med tillsats av tillväxtfaktorer - FGF, EGF och NGF. Cellerna odlades i en suspensionskultur tills neurosfärer bildades, vilka dispergerades och återigen planterades i kulturen. Efter fyra passager med en total odlingsperiod på 12–16 dagar användes cellerna för transplantation. Mottagarna var tio dagar gamla råttungar och könsmogna två månader gamla Wistar-råttor, till vilka 4 μl av den humana neurala stamcellssuspensionen injicerades i hjärnans laterala ventrikel utan immunsuppression. Resultaten av arbetet visade att dissocierade celler från den ventrikulära och subventrikulära zonen i den embryonala anlagen av råtthjärnbarken fortsatte sin utveckling under allotransplantation till den mogna hjärnan, dvs. faktorerna i mikromiljön i den differentierade mottagarhjärnan blockerade inte tillväxten och differentieringen av embryots neurala stamceller. I de tidiga stadierna efter transplantation fortsatte multipotenta celler den mitotiska delningen och migrerade aktivt från transplantationsområdet till mottagarens hjärnvävnad. Transplanterade embryonala celler med en enorm migrationspotential hittades i nästan alla lager av mottagarens hjärnbark längs transplantationsbanan och i den vita substansen. Längden på nervcellernas migrationskanal var alltid betydligt kortare (upp till 680 μm) än gliala elements (upp till 3 mm). Blodkärl och fiberstrukturer i hjärnan fungerade som strukturella vektorer för astrocytmigration, vilket också noterades i andra studier.

Tidigare trodde man att ansamlingen av märkta astrocyter i det skadade området på mottagarens hjärnbark kunde vara förknippad med bildandet av en gliabarriär mellan transplantatets och mottagarens vävnader. En studie av strukturen hos kompakt placerade celltransplantationer visade dock att deras cytoarkitektur kännetecknas av kaos, utan någon skiktad fördelning av transplanterade celler. Graden av ordning hos transplanterade neuroner närmade sig den hos normala hjärnbarkceller endast i frånvaro av en gliabarriär mellan donatorns och mottagarens vävnader. Annars var strukturen hos transplantationscellerna atypisk, och neuronerna själva utsattes för hypertrofi. Med hjälp av neuroimmunokemisk typning av transplanterade celler hittades hämmande GABA-erga neuroner i transplantaten och uttryck av PARV-, CALB- och NPY-proteiner detekterades. Följaktligen behåller den mogna hjärnan mikromiljöfaktorer som kan stödja proliferation, migration och specifik differentiering av neurala multipotenta celler.

I kulturen av humana stamceller isolerade från den periventrikulära regionen i hjärnan hos 9 veckor gamla embryon fann M. Aleksandrova et al. (2001) ett stort antal nestin-positiva multipotenta celler i den fjärde passagen, av vilka några redan hade genomgått in vitro-differentiering och utvecklades enligt neuronal typ, vilket motsvarade resultaten från studier av andra författare. Efter transplantation till hjärnan hos vuxna råttor delade sig de odlade humana stamcellerna mitotiskt och migrerade in i vävnaden i den xenogena mottagarhjärnan. I celltransplantationerna observerade författarna två populationer av celler - små och större. Den senare migrerade både i parenkymet och längs fiberstrukturerna i mottagarhjärnan över obetydliga avstånd - inom 300 μm. Den största utsträckningen av migrationsvägen (upp till 3 mm) var karakteristisk för små celler, av vilka några differentierade till astrocyter, vilket etablerades med hjälp av monoklonala antikroppar mot GFAP. Båda celltyperna hittades i väggen i den laterala ventrikeln, vilket indikerar att de transplanterade cellerna gick in i den rostrala migrationsvägen. Astrocytiska derivat av neurala stamceller från både människor och råttor migrerade huvudsakligen genom blodkapillärerna och fiberstrukturerna i mottagarhjärnan, vilket sammanfaller med data från andra författare.

Analys av differentiering av mänskliga stamceller in vivo med monoklonala antikroppar mot GFAP, CALB och VIM avslöjade bildandet av både astrocyter och neuroner. Till skillnad från cellerna i råtttransplantationer var många mänskliga stamceller vimentin-positiva. Följaktligen genomgick vissa av de humana multipotenta cellerna ingen differentiering. Samma författare visade senare att mänskliga neurala stamceller transplanterade utan immunsuppression överlever i råtthjärnan i 20 dagar efter transplantation, utan tecken på immunaggression från gliacellerna i den mogna hjärnan.

Det har fastställts att även neurala stamceller från Drosophila inympas och differentieras i hjärnan hos en taxon så avlägsen från insekter som råttan. Riktigheten i författarnas experiment råder ingen tvekan om: transgena Drosophila-linjer innehöll gener för humana neurotrofiska faktorer NGF, GDNF, BDNF, insatta i CaSper-vektorn under Drosophilas värmechockpromotor, så att kroppstemperaturen hos däggdjur automatiskt framkallade deras uttryck. Författarna identifierade Drosophila-celler genom produkten av den bakteriella galaktosidasgenen med hjälp av histokemisk X-Gal-färgning. Dessutom visade det sig att Drosophilas neurala stamceller specifikt svarar på neurotrofiska faktorer som kodas av mänskliga gener: vid xenotransplantation av celler från en transgen Drosophila-linje innehållande gdnf-genen ökade syntesen av tyrosinhydroxylas i dess differentierande neurala stamceller kraftigt, och celler med ngf-genen producerade aktivt acetylkolinesteras. Xenotransplantationen inducerade liknande genberoende reaktioner i allotransplantationen av embryonal nervvävnad som transplanterats tillsammans med den.

Betyder detta att specifik differentiering av neurala stamceller induceras av art-ospecifika neurotrofiska faktorer? Enligt författarnas resultat hade de xenograftproducerande neurotrofiska faktorerna en specifik effekt på allografternas öde, vilka i detta fall utvecklades mer intensivt och var 2-3 gånger större i storlek än allografter som introducerades i hjärnan utan tillsats av xenografter. Följaktligen har xenograftceller som innehåller neurotrofingener, särskilt genen som kodar för human glialcell-derived neurotrofisk faktor (GDNF), en art-ospecifik effekt på allograftutveckling som liknar verkan av motsvarande neurotrofin. GDNF är känt för att öka överlevnaden av dopaminerga neuroner i råttembryonala mitthjärnan och förbättra dopaminmetabolismen hos dessa celler, och inducera differentiering av tyrosinhydroxylaspositiva celler, vilket förbättrar axontillväxten och ökar storleken på den neuronala cellkroppen. Liknande effekter observeras också i odlade dopaminerga neuroner i råttmitthjärnan.

Aktiv migration av humana neurala stamceller observeras efter xenotransplantation in i hjärnan hos mogna råttor. Det är känt att processen för migration och differentiering av neurala stamceller styrs av en uppsättning speciella gener. Den initierande migrationssignalen till prekursorcellen för att påbörja differentiering ges av proteinprodukten från c-ret-protoonkogenen tillsammans med GDNF. Nästa signal kommer från mash-1-genen, som styr valet av cellutvecklingsväg. Dessutom beror den specifika reaktionen hos differentierande celler också på α-receptorn för den ciliära neurotrofiska faktorn. Med tanke på den helt olika genetiska konstitutionen hos xenogena humana neurala stamceller och mottagarråtthjärnceller är det således nödvändigt att erkänna inte bara artnonspecificiteten hos neurotrofiska faktorer, utan också den högsta evolutionära konservatismen hos de gener som är ansvariga för den specifika differentieringen av neurala stamelement.

Framtiden kommer att visa huruvida xenotransplantation av embryonalt neuromaterial kommer att vara möjligt inom neurokirurgisk praxis för behandling av neurodegenerativa patologiska processer orsakade av störningar i myelinsyntesen av oligodendrocyter. Under tiden är de mest intensivt behandlade frågorna kring neurotransplantation de som rör erhållande av allogena neurala stamceller från den embryonala eller mogna hjärnan i kultur med deras efterföljande riktade differentiering till neuroblaster eller specialiserade neuroner.

Neural stamcellstransplantation

För att stimulera proliferation och differentiering av neurala stamceller hos en vuxen organism kan embryonal nervvävnad transplanteras. Det är möjligt att stamcellerna från den embryonala nervvävnaden som förts in med allograftet själva kan genomgå proliferation och differentiering. Det är känt att efter en ryggmärgsskada sker regenerering av nervledare genom förlängning av skadade axoner och kollateral groning av axoner från oskadade processer hos motoriska nervceller. De viktigaste faktorerna som förhindrar ryggmärgsregenerering är bildandet av ett bindvävsärr i det skadade området, dystrofiska och degenerativa förändringar i centrala nervceller, NGF-brist och närvaron av myelin-nedbrytningsprodukter i det skadade området. Det har visats att transplantation av olika celltyper till den skadade ryggmärgen - fragment av ischiasnerven hos vuxna djur, embryonal occipital cortex, hippocampus, ryggmärg, Schwann-celler, astrocyter, mikroglia, makrofager, fibroblaster - främjar regenerering av skadade axoner genom groning och tillåter nybildade axoner att växa genom ryggmärgsskadezonen. Det har experimentellt bevisats att transplantation av embryonal nervvävnad till det skadade området i ryggmärgen, genom inverkan av neurotrofiska faktorer, accelererar tillväxten av skadade axoner, förhindrar bildandet av glialärr och utvecklingen av dystrofiska och degenerativa processer i centrala neuroner, medan cellerna i den transplanterade embryonala nervvävnaden överlever i ryggmärgen, integreras med angränsande vävnader och främjar axontillväxt genom det skadade området med bildandet av dendritiska synapser på spinala neuroner.

Detta område inom regenerativ-plastisk medicin har fått den största utvecklingen i Ukraina tack vare arbetet i det vetenskapliga teamet lett av V.I. Tsymbalyuk. Först och främst är det experimentella studier av effektiviteten av embryonal nervvävnadstransplantation vid ryggmärgsskador. Under autotransplantation av den perifera nerven observerade författarna de mest uttalade destruktiva förändringarna i den distala suturzonen, där de på den 30:e dagen efter operationen kombinerades med reparativa processer. Under allotransplantation kännetecknades det implanterade nervens morfofunktionella tillstånd på den 30:e dagen av uttalad destruktion med fettdegeneration och amyloidos mot bakgrund av fokal inflammatorisk lymfoidcellsinfiltration med övervägande atrofi av Schwann-celler. Transplantation av embryonal nervvävnad bidrog i större utsträckning till återställningen av ryggmärgens konduktivitet, särskilt hos djur som genomgick kirurgi under de första 24 timmarna efter skadan: mot bakgrund av en minskning av intensiteten av inflammatoriska och destruktiva processer, hypertrofi och hyperplasi av proteinsyntetiserande och energiproducerande ultrastrukturella element i spinala neuroner, observerades hypertrofi och hyperplasi av oligodendrocyter, amplituden av muskelaktionspotentialen återställdes med 50% och impulsledningshastigheten med 90%. Vid bedömning av effektiviteten av transplantation av embryonal nervvävnad beroende på transplantationszonen fann man att de bästa resultaten observerades när transplantatet infördes direkt i ryggmärgsskadezonen. Vid fullständig transektion av ryggmärgen var transplantation av embryonal nervvävnad ineffektiv. Dynamiska studier har visat att den optimala tiden för att utföra transplantation av embryonal nervvävnad är de första 24 timmarna efter ryggmärgsskada, medan det bör anses olämpligt att utföra kirurgi under perioden med uttalade sekundära ischemisk-inflammatoriska förändringar som inträffar på 2:a-9:e dagen efter skadan.

Det är känt att allvarlig traumatisk hjärnskada framkallar kraftfull och långvarig aktivering av lipidperoxidation i de initiala och mellanliggande stadierna av den posttraumatiska perioden, både i den skadade hjärnvävnaden och i kroppen som helhet, och stör även energimetabolismen i den skadade hjärnan. Under dessa förhållanden främjar transplantation av embryonal nervvävnad till det traumatiska skadaområdet stabiliseringen av lipidperoxidationsprocesser och ökar potentialen hos antioxidantsystemet i hjärnan och kroppen som helhet, vilket förstärker dess antiradikalskydd på den 35-60:e dagen av den posttraumatiska perioden. Under samma period efter transplantation av embryonal nervvävnad normaliseras energimetabolismen och oxidativa fosforyleringsprocesser i hjärnan. Dessutom har det visats att impedansen i vävnaden i den skadade hemisfären minskar med 30-37% den första dagen efter experimentell traumatisk hjärnskada, och med 20% i den kontralaterala, vilket indikerar utveckling av generaliserat hjärnödem. Hos djur som genomgick transplantation av embryonal nervvävnad inträffade ödeminvolutionen betydligt snabbare - redan på den sjunde dagen nådde det genomsnittliga impedansvärdet för vävnaderna i den skadade hemisfären 97,8 % av kontrollnivån. Dessutom noterades fullständig återställning av impedansvärdena på den 30:e dagen endast hos djur som genomgick transplantation av embryonal nervvävnad.

Döden av vissa nervceller i hjärnan efter en allvarlig kraniocerebral skada är en av de främsta orsakerna till posttraumatiska komplikationer. Nervceller i de integrerande dopaminerga och noradrenerga systemen i mellanhjärnan och medulla oblongata är särskilt känsliga för skador. En minskning av dopaminnivån i striopallidalkomplexet och hjärnbarken ökar avsevärt risken för att utveckla motoriska störningar och psykiska störningar, epileptiforma tillstånd, och en minskning av dopaminproduktionen i hypotalamus kan vara orsaken till många vegetativa och somatiska störningar som observerats i den sena posttraumatiska perioden. Resultaten av studier som utförts vid experimentell kraniocerebral skada indikerar att transplantation av embryonal nervvävnad hjälper till att återställa dopaminnivåerna i den skadade hjärnhalvan, dopamin och noradrenalin i hypotalamus, och öka noradrenalin- och dopaminnivåerna i mellanhjärnan och medulla oblongata. Dessutom, som ett resultat av transplantation av embryonal nervvävnad i den skadade hjärnhalvan hos försöksdjur, normaliseras den procentuella andelen fosfolipider och halten av fettsyror ökar (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Dessa data bekräftar stimuleringen av regenerativ-plastiska processer genom transplanterad embryonal nervvävnad och indikerar transplantationens reparativ-trofiska effekt på mottagarens hjärna som helhet.

Den kliniska erfarenheten hos personalen vid AP Romodanov Institute of Neurosurgery vid Ukrainas akademi för medicinska vetenskaper av transplantation av embryonal nervvävnad vid cerebral pares, en extremt komplex patologi med allvarlig motorisk dysfunktion, förtjänar särskild uppmärksamhet. Kliniska former av cerebral pares beror på graden av skada på de integrerade strukturer som ansvarar för reglering av muskeltonus och bildandet av motoriska stereotyper. För närvarande finns det tillräckliga bevis som stöder det faktum att patologiska förändringar i det striopallidal-thalamokortikala motorstyrsystemet spelar en viktig roll i motorisk funktion och muskeltonusstörningar. Den striopallidala länken i detta system utför kontrollfunktionen genom nigrostriatal dopaminproduktion. Den direkta vägen för implementering av thalamokortikal kontroll börjar från putamenets neuroner, medieras av gamma-aminosmörsyra (GABA) och substans P och projiceras direkt in i motorzonen i det inre segmentet av globus pallidus och substantia nigra. Den indirekta vägen, vars effekt uppnås med deltagande av GABA och enkefalin, utgår från putamenets neuroner och påverkar basala gangliernas kärnor genom en sekvens av kopplingar, inklusive det externa segmentet av globus pallidus och subthalamuskärnan. Störningar i den direkta vägens konduktivitet orsakar hypokinesi, medan en minskning av konduktiviteten hos den indirekta vägens strukturer leder till hyperkinesi med motsvarande förändringar i muskeltonus. Integriteten hos GABAerga ledningsvägar på olika nivåer i det motoriska styrsystemet och integrationen av dopaminerga kopplingar på putamennivå är avgörande för regleringen av talamokortikala interaktioner. Den vanligaste manifestationen av motorisk patologi vid olika former av cerebral pares är en kränkning av muskeltonus och en närbesläktad förändring i reflexmuskelaktivitet.

Transplantation av embryonal nervvävnad vid cerebral pares kräver en grundlig analys av arten av skador på hjärnstrukturer. Baserat på bestämning av dopamin- och GABA-nivåer i subaraknoidalarvevsvätskan, specificerade författarna graden av störning i integrationen av funktionella hjärnstrukturer, vilket gjorde det möjligt att objektivisera resultaten av kirurgiska ingrepp och korrigera upprepade neurotransplantationer. Embryonal nervvävnad (abortmaterial från ett 9-veckors embryo) transplanterades in i parenkymet i cortex i de precentrala konvolutionerna i hjärnhalvorna beroende på svårighetsgraden av atrofiska förändringar. Inga komplikationer eller försämring av patienternas tillstånd observerades under den postoperativa perioden. Positiv dynamik noterades hos 63% av patienterna med spastiska former, hos 82% av barnen med en atonisk-estetisk form och endast hos 24% av patienterna med en blandad form av sjukdomen. En negativ effekt av en hög nivå av neurosensibilisering med närvaron av autoantikroppar mot neurospecifika proteiner på operationsresultaten fastställdes. Transplantation av embryonal nervvävnad visade sig vara ineffektiv hos patienter i åldern 8-10 år och äldre, såväl som i fall av svårt hyperkinetiskt syndrom och epilepsi. Kliniskt sett manifesterades effektiviteten av transplantation av embryonal nervvävnad hos patienter med spastiska former av cerebral pares genom bildandet av nya statomotoriska färdigheter och frivilliga rörelser med korrigering av den patologiska motoriska stereotypen och en minskning av graden av spasticitet, patologiska ställningar och attityder. Författarna anser att den positiva effekten av transplantation av embryonal nervvävnad är resultatet av den normaliserande effekten på den funktionella aktiviteten hos de supraspinala strukturer som är involverade i regleringen av postural tonus och frivilliga rörelser. Samtidigt åtföljs de positiva kliniska effekterna av transplantation av embryonal nervvävnad av en minskning av innehållet av neurotransmittorer i subaraknoidalarvevsvätskan, vilket indikerar återställandet av integrerade interaktioner mellan de drabbade hjärnstrukturerna.

Det finns en annan allvarlig form av neurologisk patologi - apalliskt syndrom, vars behandlingsproblem tyvärr är långt ifrån löst. Apalliskt syndrom är ett polyetiologiskt subakut eller kroniskt tillstånd som uppstår som ett resultat av allvarliga organiska skador i centrala nervsystemet (främst hjärnbarken) och kännetecknas av utveckling av panapraxi och panagnosi med relativt bevarad funktion av segmentstamsektionerna och formationerna av hjärnans limbisk-retikulära komplex. Uppföljningsstudier (från 1 år till 3 år) har visat att apalliskt syndrom inte är en slutgiltig diagnos av ihållande skador på nervsystemet hos barn, utan omvandlas antingen till organisk demens eller till ett kroniskt vegetativt tillstånd. Vid avdelningen för restaurativ neurokirurgi vid AP Romodanov-institutet för neurokirurgi vid Ukrainas akademi för medicinska vetenskaper genomgick 21 patienter med konsekvenser av apalliskt syndrom transplantation av embryonal nervvävnad. Under generell anestesi användes ett kronborr för att göra ett borrhål över området med de mest uttalade atrofiska förändringarna som avslöjats med datortomografi eller magnetisk resonanstomografi, och vid diffus atrofi av den grå eller vita substansen fördes transplantatet in i hjärnans precentrala och centrala gyri. Efter att dura mater öppnats implanterades vävnadsbitar från sensorimotorisk cortex från 8-9 veckor gamla embryon intrakortikalt med hjälp av en speciell anordning. Antalet implanterade vävnadsprover varierade från 4 till 10, vilket bestämdes av borrhålets storlek och storleken på lokala förändringar i hjärnsubstansen. Till skillnad från andra typer av patologi försökte författarna vid apalliskt syndrom att implantera så mycket embryonal vävnad som möjligt i de mest tillgängliga områdena av hjärnan. Dura mater syddes fast och plastikkirurgi av skalldefekten utfördes. Under operationen uppvisade alla patienter signifikanta förändringar i både cortex (atrofi, avsaknad av vindlingar, förändring i färg och pulsering av hjärnsubstansen) och hjärnhinnorna (förtjockning av dura mater, signifikant förtjockning av araknoidmembranet med närvaro av egna blodkärl, sammansmältning av membranen med den underliggande hjärnsubstansen). Dessa förändringar var mer uttalade hos patienter med en historia av inflammatoriska hjärnskador. Hos patienter som hade genomgått CNS-hypoxi dominerade diffusa atrofiska förändringar i hjärnsubstansen, särskilt i cortex, med en ökning av subaraknoidalrummet, utan signifikanta förändringar i hjärnhinnorna. Hälften av patienterna hade ökad blödning i mjukvävnad, ben och hjärnsubstans. Efter operationerna, inom sex månader till tre år, förbättrades tillståndet hos 16 patienter och förblev oförändrat hos fem patienter. Positiv dynamik observerades i både motorisk och mental sfär. Muskeltonus minskade hos tio patienter, hos 11 patienter ökade motorisk aktivitet (minskad pares,(förbättrad rörelsekoordination), hos fem barn ökade de övre extremiteternas manipulativa förmåga avsevärt. Hos fyra patienter minskade frekvensen och svårighetsgraden av epileptiska anfall, och hos ett barn förekom inga anfall alls under hela observationsperioden efter operationen. Aggressionen minskade hos två barn, hos två patienter med svåra bulbära störningar förbättrades sväljningsförmågan, två barn kunde tugga självständigt redan 2 veckor efter operationen. En minskning av svårighetsgraden av psykiska störningar noterades, nio barn blev lugnare efter operationen, sömn och uppmärksamhet förbättrades hos sju patienter. Tre patienter med konsekvenser av apalliskt syndrom började känna igen sina föräldrar, en - att följa instruktioner, två - att uttala ord, hos tre minskade graden av dysartri. Författarna noterar att en märkbar förbättring av patienternas tillstånd börjar 2 månader efter operationen, når ett maximum vid 5-6 månader, sedan saktar förbättringstakten ner och vid årets slut stabiliseras processen hos 50% av patienterna. Den positiva effekten av neurotransplantation låg till grund för en upprepad operation på sex patienter med konsekvenserna av apalliskt syndrom, men på den andra hjärnhalvan. Tekniken och metoderna för den andra transplantationen var identiska med de vid den första operationen, men den kliniska effekten av den andra operationen var lägre, även om inga allvarliga komplikationer uppstod efter vare sig det första eller det andra kirurgiska ingreppet. Enligt författarna är mekanismen för den terapeutiska effekten av neurotransplantation förknippad med den neurotrofiska effekten av den transplanterade embryonala nervvävnaden, som innehåller ett stort antal tillväxt-, hormonella och andra biologiskt aktiva substanser som stimulerar reparationen av skadade neuroner och plastisk reorganisation av mottagarens hjärnvävnad. En aktiverande effekt på aktiviteten hos nervceller som tidigare var morfologiskt bevarade, men förlorat sin funktionella aktivitet på grund av sjukdomen, är också möjlig. Det är den snabba neurotrofiska effekten som kan förklara förbättringen av bulbärfunktioner hos vissa barn redan i slutet av den första eller andra veckan efter operationen. Det antas att, utöver detta, vid den tredje eller fjärde månaden, morfofunktionella kopplingar etableras mellan transplantatet och värdhjärnan, genom vilka neurotransplantatet ersätter funktionerna hos döda hjärnceller, vilket är substratet för att förbättra både patienternas motoriska och mentala funktioner. Två barn kunde tugga självständigt redan 2 veckor efter operationen. En minskning av svårighetsgraden av psykiska störningar noterades, nio barn blev lugnare efter operationen, sömn och uppmärksamhet förbättrades hos sju patienter. Tre patienter med konsekvenser av apallisk syndrom började känna igen sina föräldrar, en - att följa instruktioner, två - att uttala ord,Hos tre minskade graden av dysartri. Författarna noterar att en märkbar förbättring av patienternas tillstånd börjar 2 månader efter operationen, når ett maximum efter 5-6 månader, sedan saktar förbättringstakten ner och vid årets slut stabiliseras processen hos 50 % av patienterna. Den positiva effekten av neurotransplantation låg till grund för en upprepad operation hos sex patienter med konsekvenserna av apalliskt syndrom, men på den andra hjärnhalvan. Tekniken och metoden för den andra transplantationen var identisk med den vid den första operationen, men den kliniska effekten av den andra operationen var lägre, även om det inte fanns några allvarliga komplikationer efter varken det första eller det andra kirurgiska ingreppet. Enligt författarna är mekanismen för den terapeutiska effekten av neurotransplantation förknippad med den neurotrofiska effekten av den transplanterade embryonala nervvävnaden, som innehåller ett stort antal tillväxt-, hormon- och andra biologiskt aktiva substanser som stimulerar reparationen av skadade neuroner och plastisk omorganisation av mottagarens hjärnvävnad. En aktiverande effekt på aktiviteten hos nervceller som tidigare var morfologiskt bevarade, men förlorat sin funktionella aktivitet på grund av sjukdomen, är också möjlig. Det är just den snabba neurotrofiska effekten som kan förklara förbättringen av bulbära funktioner hos vissa barn redan i slutet av den första eller andra veckan efter operationen. Det antas att, tillsammans med detta, vid den tredje eller fjärde månaden, etableras morfofunktionella kopplingar mellan transplantatet och värdhjärnan, genom vilka neurotransplantatet ersätter funktionerna hos döda hjärnceller, vilket är substratet för att förbättra både motoriska och mentala funktioner hos patienterna. Två barn kunde tugga självständigt redan 2 veckor efter operationen. En minskning av svårighetsgraden av psykiska störningar noterades, nio barn blev lugnare efter operationen, sömn och uppmärksamhet förbättrades hos sju patienter. Tre patienter med konsekvenser av apalliskt syndrom började känna igen sina föräldrar, en - att följa instruktioner, två - att uttala ord, hos tre minskade graden av dysartri. Författarna noterar att en märkbar förbättring av patienternas tillstånd börjar 2 månader efter operationen, når ett maximum efter 5-6 månader, varefter förbättringstakten avtar och vid årets slut stabiliseras processen hos 50 % av patienterna. Den positiva effekten av neurotransplantation låg till grund för en upprepad operation hos sex patienter med konsekvenserna av apalliskt syndrom, men på den andra hjärnhalvan. Tekniken och metoden för den andra transplantationen var identisk med den vid den första operationen, men den kliniska effekten av den andra operationen var lägre, även om det inte fanns några allvarliga komplikationer efter vare sig det första eller det andra kirurgiska ingreppet. Enligt författarna,Mekanismen för den terapeutiska effekten av neurotransplantation är förknippad med den neurotrofiska effekten av den transplanterade embryonala nervvävnaden, som innehåller ett stort antal tillväxt-, hormon- och andra biologiskt aktiva substanser som stimulerar reparationen av skadade neuroner och plastisk omorganisation av mottagarens hjärnvävnad. En aktiverande effekt på aktiviteten hos nervceller som tidigare var morfologiskt bevarade, men förlorat sin funktionella aktivitet på grund av sjukdomen, är också möjlig. Det är just den snabba neurotrofiska effekten som kan förklara förbättringen av bulbära funktioner hos vissa barn redan i slutet av den första eller andra veckan efter operationen. Det antas att, tillsammans med detta, vid den tredje eller fjärde månaden, etableras morfofunktionella kopplingar mellan transplantatet och värdhjärnan, genom vilka neurotransplantationen ersätter funktionerna hos döda hjärnceller, vilket är substratet för att förbättra både motoriska och mentala funktioner hos patienter, även om inga allvarliga komplikationer uppstod efter varken det första eller det andra kirurgiska ingreppet. Enligt författarna är mekanismen för den terapeutiska effekten av neurotransplantation förknippad med den neurotrofiska effekten av den transplanterade embryonala nervvävnaden, som innehåller ett stort antal tillväxt-, hormon- och andra biologiskt aktiva substanser som stimulerar reparationen av skadade neuroner och den plastiska omorganisationen av mottagarens hjärnvävnad. En aktiverande effekt på aktiviteten hos nervceller som tidigare var morfologiskt bevarade, men förlorat sin funktionella aktivitet på grund av sjukdomen, är också möjlig. Det är just den snabba neurotrofiska effekten som kan förklara förbättringen av bulbära funktioner hos vissa barn redan i slutet av den första eller andra veckan efter operationen. Det antas att, tillsammans med detta, vid den tredje eller fjärde månaden, etableras morfofunktionella kopplingar mellan transplantatet och värdhjärnan, genom vilka neurotransplantationen ersätter funktionerna hos döda hjärnceller, vilket är substratet för att förbättra både patienternas motoriska och mentala funktioner, även om inga allvarliga komplikationer uppstod efter varken det första eller det andra kirurgiska ingreppet. Enligt författarna är mekanismen för den terapeutiska effekten av neurotransplantation förknippad med den neurotrofiska effekten av den transplanterade embryonala nervvävnaden, som innehåller ett stort antal tillväxt-, hormonella och andra biologiskt aktiva substanser som stimulerar reparationen av skadade neuroner och den plastiska omorganisationen av mottagarens hjärnvävnad. En aktiverande effekt på aktiviteten hos nervceller som tidigare var morfologiskt bevarade, men förlorat sin funktionella aktivitet på grund av sjukdomen, är också möjlig.Det är just den snabba neurotrofiska effekten som kan förklara förbättringen av bulbära funktioner hos vissa barn redan i slutet av den första eller andra veckan efter operationen. Det antas att det samtidigt vid den tredje eller fjärde månaden etableras morfofunktionella kopplingar mellan transplantatet och värdhjärnan, genom vilka neurotransplantatet ersätter funktionerna hos döda hjärnceller, vilket är substratet för att förbättra både patienternas motoriska och mentala funktioner.

Effekten av embryonal nervvävnadstransplantation på omorganisationen av internuronala sammankopplingar studerades experimentellt. Författarna studerade mönstren för återställning av intermodulära axonala kopplingar i området med mekanisk skada på hjärnbarken hos vita råttor med och utan transplantation av embryonal nervvävnad med hjälp av den fluorescerande lipofila märkningen DIL (1,1-dioktadecyl-3,3,33'-tetrametylindokarbocyaninperklorat) och konfokal laserskanning. Det visade sig att införandet av embryonal nervvävnad i det skadade området säkerställer tillväxten av axoner, som efter att ha passerat genom transplantatet ansluter till den intilliggande hjärnvävnaden, medan utan transplantation av embryonal nervvävnad är det skadade området ett oöverstigligt hinder för växande axoner. I detta arbete utfördes transplantation av embryonal (15-17:e dagen av dräktigheten) neocortex. Resultaten som erhållits av författarna är ytterligare bevis för den aktiva inverkan av embryonal nervvävnadstransplantation på den posttraumatiska omorganisationen av internuronala relationer mellan angränsande strukturella och funktionella moduler i hjärnbarken. Transplantation av embryonal nervvävnad ger delvis återställning av kopplingar mellan skadade områden i hjärnbarken genom att skapa gynnsamma förhållanden för axontillväxt i verkningszonen för transplantatets neurotrofiska faktorer. Förekomsten av en sådan effekt har bevisats experimentellt och diskuteras i litteraturen som bevis på hög plastisk förmåga hos den skadade hjärnan hos könsmogna djur. I detta avseende anses celltransplantation för närvarande vara en optimal terapeutisk strategi för att återställa funktionen hos det skadade mänskliga centrala nervsystemet.

De data som författarna erhållit om effektiviteten av att använda embryonal nervvävnad i hjärnan som ett exogent transplantationsmedium för axontillväxt bekräftar möjligheterna till riktat skapande av kommunikationslänkar mellan intakta angränsande områden i hjärnan. Arbetet med att studera effekten av transplantation av nervvävnad på dynamiken hos funktionella parametrar i det centrala nervsystemet verkar relevant. Arbetets uppgift var att undersöka effekten av transplantation av det embryonala locus coeruleus (LC) på de morfofunktionella indexen för LC-neuroner och mottagarnas rörelseaktivitet. Mottagarna var honråttor av typen Wistar, och donatorerna var 18 dagar gamla embryon från råttor av samma linje. Transplantation av embryonal LC utfördes i håligheten i hjärnans tredje kammare. Histologiskt detekterades engraftment av transplantatet hos 75 % av mottagardjuren. I fall av engraftment var transplantatet intill kammarväggen, fyllde 1/5-2/5 av dess lumen och var livskraftigt. 1 och 6 månader efter operationen representerade den transplanterade nervvävnaden, enligt sina morfologiska egenskaper, strukturer som skulle ha uppstått under deras normala ontogenetiska utveckling, dvs. LC-strukturer. De data som författarna erhållit indikerar att hos djur till vilka den embryonala LC-anlagen transplanterades förändras den dynamiska aktiviteten och matrisaktiviteten hos kromatinet i LC-cellkärnorna ökar. Följaktligen intensifieras aktiviteten hos neuroner i deras egen LC, men det inympade transplantatet är också funktionellt aktivt. Det är känt att den så kallade lokomotoriska regionen i mitthjärnan praktiskt taget sammanfaller med lokaliseringen av LC. Författarna tror att grunden för förändringen i den motoriska aktiviteten hos mottagarråttor är aktiveringen av LC-celler, både deras egna och transplantatet, med frisättning av en stor mängd noradrenalin, inklusive i ryggmärgssegmenten. Således antas det att ökningen av motorisk aktivitet under förhållanden av LC-transplantation till djurens intakta hjärna beror på närvaron av ett funktionellt aktivt transplantat integrerat med mottagarens hjärna och som bidrar till aktiveringen av den rörelsemässiga aktiviteten hos råttor.

Dessutom visades det att transplanterade neuroepitelceller från de embryonala rudimenten i neocortex och ryggmärg överlever och differentierar till neuroblaster, unga och mogna neuroner, inom 1-2 månader efter transplantationen till den skadade ischiasnerven hos mogna råttor. När man studerade utvecklingsdynamiken hos NADPH-positiva neuroner i de embryonala rudimenten i neocortex och ryggmärg hos råttor i heterotopiska allografter (15 dagar gamla råttembryon), upptäcktes engraftment av 70 till 80 % av neurotransplantaten på longitudinella snitt genom ischiasnerverna hos mottagarråttor, vilket berodde på observationsperioden. Uni- och bipolära neuroblaster med rundade ljusa kärnor och en eller två nukleoler började bildas i transplantaten en vecka efter operationen, vilket åtföljdes av bildandet av kluster. Författarna misslyckades med att detektera celler innehållande NADPH-diaforas (NADPH-d) bland neuroblasterna. Efter 7 dagar var endast cellulära element i blodkärlen NADPH-positiva - kapillära endotelceller i transplantatets tjocklek, såväl som endotel- och glattmuskelceller i mottagarens ischiasnervkärl. Eftersom induktionen av NO-syntas (NOS) i vaskulära glattmuskelceller sker under inverkan av IL-1, associerar författarna uppkomsten av NADPH-positiva glattmuskelceller i ischiasnervens blodkärl med närvaron av IL-1 syntetiserat i skadade nervstammar. Det är känt att neurogenes under transplantationsförhållanden av embryonala hjärnrudier sker synkront med utvecklingen av neuroner in situ. Resultaten av morfologiska studier indikerar att differentieringen av vissa neurala element i transplantaten sju dagar efter transplantation motsvarar differentieringen av celler i liknande delar av hjärnan hos nyfödda råttor. Således, under förhållanden med heterotoptransplantation i den perifera nerven, uppvisar de transplanterade embryonala nervcellerna förmågan att syntetisera NADPH-d. I detta fall finns fler neuroner innehållande NADPH-d i ryggmärgstransplantationer än i neocortextransplantationer, men kväveoxidsyntesen börjar i de transplanterade neuronerna senare än under in situ-utvecklingen. I ryggradsdjurens centrala nervsystem uppträder NOS-positiva celler redan under prenatalperioden. Man tror att NO främjar bildandet av synaptiska kopplingar i den utvecklande hjärnan, och närvaron av NOS-positiva nervefferenta fibrer som tillhandahåller NO-syntes i cerebellära neuroblaster stimulerar migrationen och differentieringen av neuroner, varigenom normal hjärncytoarkitektur bildas. En viktig roll för NO i synapsogenes har fastställts i tektum - endast de neuroner som hade synaptiska kopplingar till retinala celler visade sig vara NOS-positiva.

Det är känt att kväveoxid är en av regulatorerna av hjärnaktivitet, där den bildas från arginin under inverkan av NO-syntas, som har diaforasaktivitet. I det centrala nervsystemet syntetiseras NO i endotelceller i blodkärl, mikroglia, astrocyter och neuroner i olika delar av hjärnan. Efter traumatisk hjärnskada, såväl som under hypoxi och ischemi, observeras en ökning av antalet neuroner som innehåller NO, vilket är en av regulatorerna av cerebralt blodflöde. Med tanke på NO:s förmåga att inducera synapsogenes är studier av bildandet av NO-innehållande celler under neurotransplantationsförhållanden mot bakgrund av traumatisk skada på mottagarens nervvävnad av särskilt intresse.

Inte mindre viktigt är studien av neurotransplantationens effekt på den betingade reflexstereotypen av beteende. I experiment för att studera effekten av intracerebral och distanstransplantation (mellan CII och CIII) av embryonal locus coeruleus-vävnad (17-19 dagars graviditet) på minnesprocesser och katekolamininnehåll hos råttor med förstörelse av den frontotemporala neocortexen, visades det att elektrolytisk skada på hjärnans frontotemporala cortex stör stereotypen av den betingade reflexmässiga emotionella undvikande reaktionen (minne), försvagar fysiologisk aktivitet, minskar halten av noradrenalin i zonen av koagulerad neocortex, men ökar dess nivå i hypotalamus, där en minskning av adrenalinkoncentrationen observeras, även om dess mängd i blodet och binjurarna ökar.

Som ett resultat av intracerebral transplantation av embryonal locus coeruleus-vävnad återställs stereotypen av den betingade reflexmässiga emotionella undvikande reaktionen, störd av elektrolytisk skada på de frontotemporala regionerna i hjärnbarken, hos 81,4% av djuren, adrenalinhalten i den retikulära formationen av mellanhjärnan, hypotalamus och neocortex normaliseras, och dess nivå i hippocampus ökar till och med, vilket kombineras med en minskning av adrenalinkoncentrationen i blodet.

Fjärrtransplantation av embryonal locus coeruleus-vävnad återställer inte bara den störda stereotypen av den betingade reflexmässiga emotionella undvikande reaktionen hos råttor med elektrolytisk skada på frontotemporal cortex, utan ökar också halten av noradrenalin och adrenalin, främst i hypotalamus, blod, binjurar och hjärta. Det antas att detta beror på vaskularisering av transplantatet, penetration av neurotransmittorer i blodomloppet, deras passage genom blod-hjärnbarriären och aktivering av mekanismerna för återupptag av adrenalin och noradrenalin enligt upptagstyperna 1, 2, 3. Författarna anser att långsiktig stabilisering av noradrenalinivån under förhållanden av engraftment och funktion av transplantatet kan betraktas som ett fenomen av dess progressiva frisättning i minimala doser av neuroner i locus coeruleus.

Positiva kliniska effekter av transplantation av embryonal nervvävnad kan också bero på dess förmåga att påverka processerna för vaskulär neoplasma, i vars reglering tillväxtfaktorer och cytokiner direkt deltar. Vaskulogenes aktiveras av angiogena tillväxtfaktorer - vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF), FGF, PDGF och TGF, vilka syntetiseras under ischemi, vilket fungerar som initieringsmomentet för angiogenes. Det har bevisats att utarmningen av den vaskulära tillväxtpotentialen sker under kroppens åldringsprocess, vilket spelar en betydande roll i patogenesen av sjukdomar som kranskärlssjukdom och utplånande ateroskleros i nedre extremiteterna. Vävnadsischemi utvecklas också vid många andra sjukdomar. Införandet av angiogena faktorer i ischemiska zoner (terapeutisk angiogenes) stimulerar tillväxten av blodkärl i ischemiska vävnader och förbättrar mikrocirkulationen på grund av utvecklingen av kollateral cirkulation, vilket i sin tur ökar den funktionella aktiviteten hos det drabbade organet.

VEGF och FGF anses vara de mest lovande för klinisk användning. Resultaten av de första randomiserade studierna var uppmuntrande, särskilt om de optimala doserna och administreringsmetoderna för angiogena faktorer valdes korrekt. I detta avseende utfördes en experimentell bedömning av den angiogena aktiviteten hos ett extrakt isolerat från mänsklig embryonal hjärnvävnad. Arbetet använde aborterat material som erhölls vid den tjugonde graviditetsveckan och bearbetades enligt metoden av I. Maciog et al. (1979) modifierad av IC ANRF. Detta läkemedel är en analog till "Endotelcellsväxttillskott" ("Sigma") och är en naturlig blandning av humana angiogena faktorer, som inkluderar VEGF och FGF. Experimenten utfördes på råttor med modeller av bakbens- och myokardvävnadsischemi. Baserat på studien av alkalisk fosfatasaktivitet hos försöksdjur som fick extrakt av embryonal nervvävnad, fann man en ökning av antalet kapillärer per ytenhet av myokardiet - både i längsgående och tvärgående sektioner av hjärtat. Preparatets angiogena aktivitet manifesterades vid direkt administrering till den ischemiska zonen, såväl som vid systemisk (intramuskulär) administrering, vilket ledde till en minskning av den genomsnittliga ytan av ärret efter infarkt.

I alla varianter av transplantation av embryonal nervvävnad är det extremt viktigt att korrekt välja gestationsåldern för det transplanterade embryonala materialet. Jämförande analys av effektiviteten hos cellpreparat från det embryonala ventrala mesencefalonet hos 8-, 14- och 16-17-dagars råttembryon tre månader efter intrastriatal neurotransplantation till mogna råttor med parkinsonism i det automatiserade testet av apomorfininducerad motorisk asymmetri visade en signifikant högre effektivitet hos CNS-cellpreparat från 8-dagars embryon och den lägsta effektiviteten från 16-17-dagars embryonal nervvävnad. De erhållna uppgifterna korrelerade med resultaten av histomorfologisk analys, i synnerhet med transplantatens storlek, svårighetsgraden av gliareaktionen och antalet dopaminerga neuroner i dem.

Skillnader i den terapeutiska effekten av embryonala nervvävnadsceller kan vara förknippade med både graden av omognad och engagemang hos cellerna själva och deras olika reaktioner på tillväxtfaktorer som frisätts i området med inducerad skada på dopaminerga neuroner. I synnerhet inträffar effekten av EGF och FGF2 på utvecklingen av telencefala neurala stamceller in vivo i olika stadier av embryogenesen. Neuroepiteliala celler från 8,5 dagar gamla musembryon, när de odlas in vitro i ett serumfritt medium, prolifererar i närvaro av FGF2, men inte EGF, som endast populationer av stamceller isolerade från hjärnan hos embryon i senare utvecklingsstadier svarar på. Samtidigt prolifererar neurala stamceller som svar på vart och ett av dessa mitogener och ökar additivt tillväxten vid tillsats av EGF och FGF2 till en kultur med låg cellsådddensitet. EGF-reaktiva neurala stamceller från de germinala zonerna hos 14,5 dagar gamla musembryon anses vara linjära ättlingar till FGF-reaktiva neurala stamceller som först uppträder efter 8,5 dagars dräktighet. Den potentiella fenotypen av neurala stam- och progenitorceller beror på den komplexa effekten av deras mikromiljö. Immunofenotypning av neurala celler från de periventrikulära och hippocampala zonerna hos 8-12 och 17-20 veckor gamla mänskliga embryon med flödescytofluorometri avslöjade signifikant variation i samband med både gestationsåldern och individuella konstitutionella egenskaper hos donatorbiomaterialet. När dessa neurala progenitorceller odlas i ett selektivt serumfritt medium med EGF, FGF2 och NGF, bildas neurosfärer i en hastighet som signifikant beror på gestationsåldern. Celler från olika delar av hjärnan hos 5-13 veckor gamla mänskliga embryon, när de kort odlas med FGF2 i monolagerkultur på ett lamininsubstrat i närvaro av spårmängder av tillväxtfaktorer, bibehåller proliferation i 6 veckor med en hög andel nestin-positiva celler mot bakgrund av spontan bildning av celler med markörer för alla tre linjerna av neural differentiering. Celler isolerade från mesencefalon hos ett mänskligt embryo vid en dräktighetsperiod som överstiger 13 veckor, prolifererar under inverkan av EGF och bildar även neurosfärer. En synergistisk effekt uppnåddes genom att använda en kombination av EGF och FGF2. Den mest intensiva proliferationen av neurala stamceller med bildandet av neurosfärer observeras vid odling av hjärnbarkvävnad från 6-8 veckor gamla mänskliga embryon i närvaro av EGF2, IGF1 och 5% hästserum på ett substrat med fibronektin.

Det bör noteras att frågorna gällande gestationsåldern och den del av det embryonala CNS som föredras för neurotransplantation fortfarande är öppna. Svaren på dem bör sökas i den utvecklande hjärnans neurogenes, som fortsätter under hela prenatalperioden - vid en tidpunkt då neuralrörets epitel bildar en flerskiktsstruktur. Man tror att källan till stamceller och nya neuroner är radiella gliaceller, bestående av avlånga celler med långa utskott radiellt riktade i förhållande till hjärnblåsornas vägg och i kontakt med kamrarnas inre yta och hjärnväggens yttre piala yta. Tidigare var radiella gliaceller endast utrustade med funktionen av en neuronal trakt längs vilken neuroblaster migrerar från den ventrala regionen till de ytliga sektionerna, och de tilldelades också en skelettroll i processen att bilda den korrekta laminära organisationen av cortex. Idag har det fastställts att allt eftersom utvecklingen fortskrider transdifferentierar radiella gliaceller till astrocyter. En betydande del av det hos däggdjur reduceras omedelbart efter födseln, men hos de djurarter där radiell glia bevaras fram till vuxen ålder sker neurogenes aktivt under postnatalperioden.

I kultur bildade radiella gliaceller från den embryonala neocortexen hos gnagare neuroner och gliaceller, där neuroner huvudsakligen bildades vid 14- till 16-dagars gestationsålder under embryonal utveckling (perioden med maximal intensitet av neurogenes i hjärnbarken hos möss och råttor). På den 18:e dagen av embryogenesen skiftade differentieringen mot bildandet av astrocyter med en signifikant minskning av antalet nybildade neuroner. In situ-märkning av radiella gliaceller med GFP gjorde det möjligt att detektera asymmetrisk delning av märkta celler i håligheten i hjärnvesiklarna hos 15- till 16 dagar gamla råttembryon med uppkomsten av dotterceller med immunologiska och elektrofysiologiska egenskaper hos neuroblaster. Det är anmärkningsvärt att, enligt resultaten av dynamiska observationer, använder de framväxande neuroblasterna modercellen till radiella gliaceller för migration till den piala ytan.

Den endogena markören för radial glia är det intermediära filamentproteinet nestin. Med hjälp av metoden med fluorescerande flödessortering av celler märkta med ett retrovirus associerat med GFP och uttryckta under kontroll av nestin, visades det att stamceller från gyrus dentatus och hilus i den mänskliga hippocampus (materialet erhölls under operationer för epilepsi) uttrycker nestin. Därför tillhör de den radiala glia, som hos människor, liksom hos andra däggdjur, endast bevaras i gyrus dentatus.

Samtidigt bestäms effektiviteten av celltransplantation inte bara av donatorcellernas höga livskraft, deras differentieringspotential och förmåga att ersätta defekta celler, utan först och främst av deras riktade migration. Fullständig funktionell integration av transplanterade celler beror på deras migrationsförmåga - utan att störa cytoarkitekturen i mottagarens hjärna. Eftersom radial glia genomgår nästan fullständig reduktion under den postnatala perioden var det nödvändigt att ta reda på hur donatorceller kan röra sig från transplantationszonen till platsen för hjärnskada hos vuxna mottagare. Det finns två varianter av cellmigration till CNS som inte är beroende av radial glia: fenomenet tangentiell migration eller rörelsen av neuroblaster under utvecklingen av hjärnbarken vinkelrätt mot det radiala glianätverket, samt migration "i rad" eller "längs en kedja". I synnerhet sker migrationen av neurala progenitorceller från den rostrala subventrikulära zonen till luktbulben som en sekvens av tätt intilliggande celler omgivna av gliaceller. Man tror att dessa celler använder partnerceller som migrationssubstrat, och den huvudsakliga regulatorn för sådana intercellulära interaktioner är PSA-NCAM (polysialylerad neural celladhesionsmolekyl). Därför kräver neuronal migration inte nödvändigtvis deltagande av radial glia eller redan existerande axonala kopplingar. Den extraradiala formen av cellrörelse i en "sträng" längs den rostrala migrationskanalen bibehålls under hela livet, vilket indikerar en verklig möjlighet till riktad leverans av transplanterade neurala progenitorceller till det mogna nervsystemet.

Det finns en hypotes om närvaron av en stamcellslinje i hjärnans ontogenes, enligt vilken stamcellen i de tidiga stadierna av hjärnutvecklingen är en neuroepitelcell, som, när den mognar, transdifferentierar till radial glia. I vuxen ålder utförs stamcellernas roll av celler som har egenskaper hos astrocyter. Trots ett antal kontroversiella punkter (motsägelser gällande stamcellerna i hippocampus, såväl som djupa delar av hjärnan som saknar en skiktad cortex och utvecklas från thalamusknölarna, där radial glia saknas), ser ett tydligt och enkelt koncept om en konsekvent förändring av stamcellernas fenotyp under hela ontogenesen mycket attraktivt ut.

Inverkan av mikromiljöfaktorer på bestämningen och den efterföljande differentieringen av neurala differentierade celler har tydligt demonstrerats genom transplantation av mogna ryggmärgsstamceller från råtta till olika regioner i det mogna nervsystemet. När stamceller transplanterades till gyrus dentatus eller till regionen för neuronal migration i luktlökarna observerades aktiv migration av transplanterade celler, med bildandet av ett flertal neuroner. Transplantation av stamceller till ryggmärgen och Ammons horn-regionen resulterade i bildandet av astrocyter och oligodendrocyter, medan transplantation till gyrus dentatus resulterade i bildandet av inte bara gliaceller, utan även neuroner.

Hos en mogen råtta kan antalet delande celler i gyrus dentatus uppgå till flera tusen per dag – mindre än 1 % av det totala antalet granulaceller. Neuroner står för 50–90 % av cellerna, astocyter och andra gliaelement – cirka 15 %. De återstående cellerna har inte antigena egenskaper hos neuroner och glia, men innehåller endotelcellsantigener, vilket indikerar ett nära samband mellan neurogenes och angiogenes i gyrus dentatus. Förespråkare för möjligheten till differentiering av endotelceller till neuronala prekursorceller hänvisar till endotelcellernas förmåga att in vitro syntetisera BDNF.

Självorganiseringshastigheten hos neurala kretsar är imponerande: under differentieringen migrerar granulacellernas prekursorceller till dentate gyrus och bildar processer som växer mot SAZ-zonen i Ammons horn och bildar synapser med pyramidala glutamaterga och interkalära hämmande neuroner. Nybildade granulaceller integreras i befintliga neurala kretsar inom 2 veckor, och de första synapserna uppträder så tidigt som 4-6 dagar efter att nya celler har uppstått. Genom frekvent administrering av BrdU eller 3H-tymidin (en av metoderna för att identifiera vuxna stamceller) till mogna djur hittades ett stort antal märkta neuroner och astrocyter i Ammons horn, vilket indikerar möjligheten att nya neuroner bildas inte bara i dentate gyrus, utan även i andra delar av hippocampus. Intresset för processerna för delning, differentiering och celldöd i dentate gyrus i hippocampus i den mogna hjärnan beror också på att de neuroner som bildas här är lokaliserade i ett av de viktigaste områdena i hippocampus, som ansvarar för inlärnings- och minnesprocesser.

Således har det idag fastställts att neurala progenitorceller härstammar från cellerna i den subependymala zonen i den laterala ventrikeln hos mogna gnagare. De migrerar längs den rostrala migrationskanalen som bildas av longitudinellt orienterade astrogliaceller till luktbulben, där de är inbäddade i granulacellskiktet och differentierar till neuroner med denna struktur. Migration av neurala progenitorceller har detekterats i den rostrala migrationskanalen hos vuxna apor, vilket indikerar möjligheten att nya neuroner bildas i luktbulben hos primater. Neurala stamceller har isolerats från luktbulben hos en vuxen människa och överförts till linjer, vars klonade celler differentierar till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter. Stamceller har hittats i hippocampus i den mogna hjärnan hos råttor, möss, apor och människor. Neurala stamceller i den subgranulära zonen av dentate fascia är en källa till progenitorceller som migrerar till de mediala och laterala extremiteterna av hippocampus, där de differentierar till mogna granulaceller och gliaelement. Axoner från de novo-bildade neuroner i dentate fascia spåras till CA3-fältet, vilket indikerar deltagande av nybildade neuroner i implementeringen av hippocampusfunktioner. I associationsområdena i neocortex hos vuxna apor hittades neuronala progenitorceller som migrerar från den subventrikulära zonen. I lager VI av neocortex i mushjärnan detekteras nya pyramidala neuroner 2–28 veckor efter inducerad skada och död av nativa neuroner i detta lager på grund av migrationen av tidigare vilande progenitorceller i den subventrikulära zonen. Slutligen bevisas verkligheten av postnatal neurogenes i den mänskliga hjärnan av en tvåfaldig ökning av antalet kortikala neuroner, vilket fortsätter under de första 6 åren efter födseln.

Av inte ringa betydelse för praktisk celltransplantation är frågan om reglering av processerna för reproduktion och differentiering av neurala stam- och progenitorceller. De viktigaste faktorerna som hämmar proliferationen av neurala progenitorceller är glukokortikoider, vilka kraftigt minskar antalet delningar, medan borttagning av binjurarna tvärtom avsevärt ökar antalet mitoser (Gould, 1996). Det är anmärkningsvärt att morfogenesen av gyrus dentatus hos gnagare är mest intensiv under de första två veckorna av postnatal utveckling under perioden utan stressreaktion mot bakgrund av en kraftig minskning av produktionen och utsöndringen av steroidhormoner i binjurebarken. Kortikosteroider hämmar migrationen av granulaceller - nya neuroner är inte inbäddade i gyrus dentatus granula, utan förblir i hilus. Det antas att processerna för bildandet av synaptiska kopplingar störs samtidigt. Skyddet av celler från sådan "steroidaggression" sker genom minimalt uttryck av mineralkortikoid- och glukokortikoidreceptorer på prolifererande granulaceller, inte bara under utvecklingen av dentate gyrus, utan även hos mogna djur. Av alla hjärnans neuroner är det dock neuronerna i hippocampus som kännetecknas av det högsta innehållet av glukokortikoidreceptorer, vilket orsakar stresseffekten på hippocampus. Psykoemotionell stress och stressiga situationer hämmar neurogenes, och kronisk stress minskar kraftigt djurens förmåga att förvärva nya färdigheter och lära sig. En mer uttalad negativ effekt av kronisk stress på neurogenes är ganska förståelig om vi tar hänsyn till det övervägande vilande tillståndet hos neurala stamceller. Vid immobilisering av dräktiga råttor (för gnagare - en extremt stark stressfaktor) fann man att prenatal stress också orsakar en minskning av antalet celler i dentate gyrus och hämmar neurogenes signifikant. Det är känt att glukokortikoider deltar i patogenesen av depressiva tillstånd, vars morfologiska motsvarighet är hämning av neurogenes, patologisk omorganisation av neuroner och internuronala kopplingar, samt död av nervceller. Å andra sidan aktiverar antidepressiva kemoterapimedel bildandet av neuroner de novo, vilket bekräftar sambandet mellan processerna för bildandet av nya neuroner i hippocampus och utvecklingen av depression. Östrogener har en signifikant effekt på neurogenesen, vars effekter är motsatta av glukokortikosteroiders verkan och består i att stödja proliferationen och livskraften hos neurala progenitorceller. Det bör noteras att östrogener avsevärt ökar djurens inlärningsförmåga. Vissa författare associerar cykliska förändringar i antalet granulaceller och deras överskott hos honor med östrogeners inverkan.

Det är känt att neurogenes kontrolleras av EGF, FGF och BDNF, men mekanismerna för effekten av externa signaler på stamceller från mitogener och tillväxtfaktorer har inte studerats tillräckligt. Det har fastställts att PDGF in vitro upprätthåller den neuronala riktningen för differentiering av progenitorceller, och ciliär neurotrofisk faktor (CNTF), liksom trijodtyronin, stimulerar bildandet av övervägande gliaelement - astrocyter och oligodendrocyter. Hypofysadenylatcyklasaktiverande protein (PACAP) och vasoaktiv intestinal peptid (VIP) aktiverar proliferationen av neurala progenitorceller, men hämmar samtidigt processerna för differentiering av dotterceller. Opioider, särskilt vid långvarig exponering, hämmar neurogenes signifikant. Opioidreceptorer har dock inte identifierats i stamceller och neurala progenitorceller i dentate gyrus (de finns i differentierande neuroner från embryonalperioden), vilket inte tillåter oss att bedöma de direkta effekterna av opioider.

Behoven inom praktisk regenerativ-plastisk medicin har tvingat forskare att ägna särskild uppmärksamhet åt studier av pluri- och multipotens hos stamceller. Implementeringen av dessa egenskaper på nivån av regionala stamceller hos en vuxen organism skulle i framtiden kunna säkerställa produktionen av nödvändigt transplantationsmaterial. Det visades ovan att epigenetisk stimulering av neurala stamceller möjliggör erhållande av prolifererande celler som redan är förformade enligt neurala fenotyper, vilket begränsar deras antal. Vid användning av de totipotenta egenskaperna hos en embryonal stamcell sker proliferation tills ett tillräckligt antal celler erhålls tidigare än neural differentiering, och de multiplicerade cellerna omvandlas lätt till en neural fenotyp. För att erhålla neurala stamceller isoleras ESC från blastocystens inre cellmassa och odlas i den obligatoriska närvaron av LIF, vilket bevarar deras totipotens och förmågan till obegränsad delning. Därefter induceras neural differentiering av ESC med hjälp av retinsyra. Transplantation av de resulterande neurala stamcellerna till striatum som skadats av kinolin och 6-hydroxydopamin åtföljs av deras differentiering till dopaminerga och serotonerga neuroner. Efter injektion i kamrarna i råttahjärnan migrerar de ESC-deriverade neurala progenitorcellerna till olika regioner i mottagarhjärnan, inklusive cortex, striatum, septum, thalamus, hypotalamus och cerebellum. De celler som finns kvar i kammarhålan bildar epitelstrukturer som liknar ett neuralrör, såväl som individuella öar av icke-neural vävnad. I hjärnparenkym hos mottagarembryot producerar de transplanterade cellerna nervsystemets tre huvudcelltyper. Några av dem har förlängda apikala dendriter, pyramidala cellkroppar och basala axoner som skjuter ut i corpus callosum. Astrocyter av donatorursprung sträcker ut processer till närliggande kapillärer, och oligodendrocyter är i nära kontakt med myelinmuffar och deltar i bildandet av myelin. Således är neurala progenitorceller erhållna från ESC in vitro kapabla till riktad migration och regional differentiering som är adekvat för mikromiljösignaler, vilket förser många områden i den utvecklande hjärnan med neuroner och glia.

Vissa författare överväger möjligheten till de- och transdifferentiering av regionala stamceller från en vuxen organism. Indirekt bekräftelse på celldedifferentiering i kultur med expansion av deras potential ges av data om inympning av neurala stamceller från mus i den röda benmärgen med efterföljande utveckling av cellinjer från dem, vilket ger funktionellt aktiva celler från perifert blod. Dessutom ledde transplantation av genetiskt märkta (LacZ) neurosfärceller erhållna från den mogna eller embryonala hjärnan till hjärnan hos bestrålade möss med undertryckt hematopoies till bildandet av inte bara neurala derivat från stamceller, utan orsakade också generering av blodkroppar, vilket indikerar pluripotensen hos neurala stamceller, realiserad utanför hjärnan. Således kan en neural stamcell differentieras till blodkroppar under påverkan av signaler från benmärgsmikromiljön med preliminär transformation till en hematopoetisk stamcell. Å andra sidan, vid transplantation av hematopoetiska stamceller från benmärg till hjärnan, etablerades deras differentiering under påverkan av hjärnvävnadens mikromiljö till glia- och neurala celler. Följaktligen är differentieringspotentialen hos neurala och hematopoetiska stamceller inte begränsad av vävnadsspecificitet. Med andra ord kan faktorer i den lokala mikromiljön, som skiljer sig från de som är karakteristiska för hjärn- och benmärgsvävnader, ändra differentieringsriktningen för dessa celler. Det visades att neurala stamceller som introduceras i det venösa systemet hos bestrålade möss skapar populationer av myeloida, lymfoida och omogna hematopoetiska celler i mjälten och benmärgen. In vitro fastställdes effekten av benmärgsmorfogenetiska proteiner (BMP) på överlevnad och differentiering av neurala stamceller, vilket, liksom i de tidiga stadierna av embryogenesen, bestämde deras utveckling i neurala eller gliala riktningar. I neurala stamcellskulturer från 16 dagar gamla råttembryon inducerar BMP bildandet av neuroner och astroglia, medan i stamcellskulturer härledda från perinatal hjärna endast astrocyter bildas. Dessutom hämmar BMP genereringen av oligodendrocyter, som in vitro endast uppträder med tillsats av BMP-antagonisten noggin.

Transdifferentieringsprocesser är art-ospecifika: humana hematopoetiska stamceller från benmärg som transplanterats in i striatum hos mogna råttor migrerar till den vita substansen i den yttre kapseln, ipsi- och kontralaterala neocortex, där de bildar astrocytliknande cellulära element (Azizi et al., 1998). När benmärgsstamceller allotransplanteras in i den laterala ventrikeln hos nyfödda möss kan migrationen av hematopoetiska stamceller spåras till strukturerna i framhjärnan och lillhjärnan. I striatum och molekylära skiktet i hippocampus transformeras de migrerade cellerna till astrocyter, och i luktbulben, det inre granulatcellskiktet i lillhjärnan och den retikulära bildningen av hjärnstammen bildar de neuronliknande celler med en positiv reaktion på neurofilament. Efter intravenös administrering av hematopoetiska celler till vuxna möss detekterades GFP-märkta mikro- och astrocyter i neocortex, talamus, hjärnstam och lillhjärnan.

Dessutom kan mesenkymala stamceller från benmärg, som ger upphov till alla typer av bindvävsceller, också genomgå neural transdifferentiering under vissa förhållanden (kom ihåg att den embryonala källan till mesenkym är neurala kammarceller). Det har visats att stromala celler från benmärg från människa och mus, odlade in vitro i närvaro av EGF eller BDNF, uttrycker markören för neurala progenitorceller nestin, och tillsatsen av olika kombinationer av tillväxtfaktorer leder till bildandet av celler med markörer för glia (GFAP) och neuroner (kärnprotein, NeuN). Märkta syngena mesenkymala stamceller transplanterade i den laterala ventrikeln i hjärnan hos nyfödda möss migrerar och lokaliseras i framhjärnan och lillhjärnan utan att störa cytoarkitekturen hos mottagarhjärnan. Mesenkymala stamceller från benmärg differentierar till mogna astrocyter i striatum och molekylära lager i hippocampus, och befolkar luktbulben, granulära lager i lillhjärnan och retikulär bildning, där de omvandlas till neuroner. Mänskliga mesenkymala stamceller från benmärg kan differentieras till makroglia in vitro och integreras i råtthjärnstrukturer efter transplantation. Direkt transplantation av mesenkymala stamceller från benmärg till hippocampus hos vuxna råttor åtföljs också av deras migration in i hjärnparenkymet och neuroglial differentiering.

Det antas att transplantation av benmärgsstamceller kan utöka möjligheterna för cellterapi av CNS-sjukdomar som kännetecknas av överdriven patologisk neurondöd. Det bör dock noteras att inte alla forskare inser det faktum att neurala och hematopoetiska stamceller transformeras ömsesidigt, särskilt in vivo, vilket återigen beror på avsaknaden av en tillförlitlig markör för att bedöma deras transdifferentiering och vidare utveckling.

Stamcellstransplantation öppnar nya möjligheter för cellulär genterapi av ärftlig neurologisk patologi. Genetisk modifiering av neurala stamceller innebär införande av genetiska reglerande konstruktioner, vars produkter interagerar med cellcykelproteiner i det automatiska regleringsläget. Transduktion av sådana gener till embryonala progenitorceller används för att multiplicera neurala stamceller. De flesta genetiskt modifierade cellkloner beter sig som stabila cellinjer och visar inga tecken på transformation in vivo eller in vitro, men har en uttalad förmåga att kontakthämma proliferation. Vid transplantation integreras de multiplicerade transfekterade cellerna i mottagarvävnaden utan att störa cytoarkitekturen och utan att genomgå tumörtransformation. Donatorns neurala stamceller deformerar inte integrationszonen och konkurrerar lika om utrymme med värdens progenitorceller. Emellertid minskar delningsintensiteten hos transfektantceller kraftigt på den 2:a-3:e dagen, vilket motsvarar kontakthämning av deras proliferation in vitro. Embryon-mottagare av neurala stamtransfektanter har inga avvikelser i utvecklingen av det centrala nervsystemet, alla områden i hjärnan som är i kontakt med transplantatet utvecklas normalt. Efter transplantation migrerar kloner av neurala stamceller snabbt från injektionszonen och går ofta bortom motsvarande embryonala zoner längs rostralkanalen, och integreras adekvat med andra områden i hjärnan. Integrationen av genetiskt modifierade kloner och transfekterade cellinjer av neurala stamceller i värdorganismens hjärna är karakteristisk inte bara för embryonalperioden: dessa celler implanteras i många områden i fostrets, nyföddas, vuxnas och till och med åldrande mottagarorganismers centrala nervsystem och visar förmåga till adekvat integration och differentiering. I synnerhet, efter transplantation i hjärnans ventrikulära kavitet, migrerar transfekterade celler utan att skada blod-hjärnbarriären och blir integrerade funktionella cellulära komponenter i hjärnvävnaden. Donatorneuroner bildar lämpliga synapser och uttrycker specifika jonkanaler. Med blod-hjärnbarriärens integritet bevarad, sträcker astroglia, ett derivat av transfektanta neurala stamceller, utbredningar till hjärnkärl, och donatorhärledda oligodendrocyter uttrycker myelinbasprotein och myeliniserar neuronala utbredningar.

Dessutom transfekteras neurala stamceller för användning som cellulära vektorer. Sådana vektorgenetiska konstruktioner ger stabilt uttryck in vivo av främmande gener involverade i nervsystemets utveckling, eller används för att korrigera befintliga genetiska defekter, eftersom produkterna från dessa gener kan kompensera för olika biokemiska avvikelser i det centrala nervsystemet. Hög migrationsaktivitet hos transfekterade stamceller och adekvat implantation i germinalzonerna i olika områden av den utvecklande hjärnan gör att vi kan hoppas på fullständig återställning av ärftlig brist på cellulära enzymer. Vid modellering av ataxi-telangiektasi-syndrom (mutanta muslinjer pg och pcd) försvinner Purkinjeceller från lillhjärnan hos försöksdjur under de första veckorna av postnatal utveckling. Det har visats att införandet av neurala stamceller i hjärnan hos sådana djur åtföljs av deras differentiering till Purkinjeceller och granulära neuroner. Hos pcd-mutanter korrigeras rörelsekoordinationsstörningar delvis och tremorintensiteten minskar. Liknande resultat erhölls genom att transplantera klonade humana neurala stamceller till primater där Purkinjecellsdegeneration inducerades med hjälp av onconase. Efter transplantation hittades donatorns neurala stamceller i de granulära, molekylära och Purkinjecellslagren i lillhjärnsparenkymet. Därför kan genetisk modifiering av neurala progenitorceller ge en stabil, engagerad modifiering av fenotypen som är resistent mot yttre påverkan. Detta är särskilt viktigt vid patologiska processer som är förknippade med utvecklingen av faktorer hos mottagaren som förhindrar överlevnad och differentiering av donatorceller (t.ex. under immunaggression).

Mukopolysackaridos typ VII hos människor kännetecknas av neurodegeneration och progressiv intellektuell funktionsnedsättning, vilket modelleras hos möss genom en deletionsmutation i beta-glukuronidasgenen. Efter transplantation av transfekterade neurala stamceller som utsöndrar beta-glukuronidas till hjärnventriklarna hos nyfödda, defekta mottagarmöss, återfinns donatorcellerna först i den terminala zonen och sprids sedan genom hjärnparenkymet, vilket stabilt korrigerar lysosomernas integritet i hjärnan hos muterade möss. I en modell av Tay-Sachs sjukdom ger retrovirustransducerade neurala stamceller, när de administreras in utero till musfoster och transplanteras till nyfödda möss, effektivt uttryck av beta-subenheten av beta-hexosaminidas hos mottagare med en mutation som leder till patologisk ackumulering av beta2-gangliosid.

En annan inriktning inom regenerativ medicin är stimulering av den proliferativa och differentierande potentialen hos patientens egna neurala stamceller. I synnerhet utsöndrar neurala stamceller NT-3 under ryggmärgshemisektion och hjärnasfyxi hos råttor, uttrycker NGF och BDNF i septum och basala ganglier, tyrosinhydroxylaser i striatum, samt reelin i lillhjärnan och myelinbasprotein i hjärnan.

Emellertid får frågorna om stimulering av neurogenes uppenbarligen inte tillräcklig uppmärksamhet. Ett fåtal studier tyder på att den funktionella belastningen på nervcentra som ansvarar för att urskilja lukter återspeglas i bildandet av nya neuroner. Hos transgena möss med brist på neuronala adhesionsmolekyler kombinerades en minskning av neurogenesens intensitet och en minskning av antalet neuroner som migrerar till luktbulben med en försämrad förmåga att urskilja lukter, även om tröskeln för luktuppfattning och korttidsminne för lukt inte försämrades. Det funktionella tillståndet hos cellerna i gyrus dentatus spelar en viktig roll i regleringen av neurogenes: en försvagning av glutamats effekt på granulatceller efter förstörelsen av entorhinalbarken främjar proliferation och differentiering av neuroner, och stimulering av fibrerna i den perforanta vägen (den huvudsakliga afferenta inmatningen till hippocampus) orsakar hämning av neurogenes. NMDA-receptorantagonister aktiverar processerna för ny neuronbildning, medan agonister tvärtom minskar neurogenesens intensitet, vilket i själva verket liknar glukokortikosteroiders verkan. Motsägelsefulla forskningsresultat finns i litteraturen: information om den experimentellt bevisade hämmande effekten av den exciterande neurotransmittorn glutamat på neurogenes är inkonsekvent med data om stimulering av proliferation av progenitorceller och uppkomsten av nya neuroner med en ökning av anfallsaktiviteten i hippocampus hos djur med experimentella kain- och pilokarpinmodeller av epilepsi. Samtidigt, i den traditionella modellen av epilepsi orsakad av multipel subtröskelstimulering av ett visst område i hjärnan (kindling) och kännetecknad av mindre uttalad neurondöd, ökar intensiteten av neurogenes endast i den sena fasen av kindling, när skador och död av neuroner observeras i hippocampus. Det har visats att vid epilepsi stimulerar anfallsaktivitet neurogenes med onormal lokalisering av nya granulneuroner, av vilka många förekommer inte bara i dentate gyrus utan också i hilus. Sådana neuroner är av stor betydelse för utvecklingen av mossfibergroddning, eftersom deras axoner bildar normalt frånvarande omvända kollateraler som bildar många synapser med angränsande granulceller.

Användningen av regionala neurala stamceller öppnar nya möjligheter för tillämpning av celltransplantation vid behandling av metabola och genetiska neurodegenerativa sjukdomar, demyeliniserande sjukdomar och posttraumatiska störningar i centrala nervsystemet. Innan ersättningscelltransplantation utförs enligt en av metoderna, utförs urval och expansion av den erforderliga typen av neurala progenitorceller ex vivo med syftet att de sedan ska introduceras direkt i det skadade området av hjärnan. Den terapeutiska effekten beror i detta fall på ersättning av skadade celler eller lokal frisättning av tillväxtfaktorer och cytokiner. Denna metod för regenerativ-plastisk terapi kräver transplantation av ett tillräckligt stort antal celler med förutbestämda funktionella egenskaper.

Ytterligare studier av de molekylära egenskaperna och den regenerativ-plastiska potentialen hos mogna hjärnstamceller, såväl som förmågan hos regionala stamceller av olika vävnadsursprung att transdifferentiera, bör också anses lämpliga. Idag har screening av antigener från hematopoetiska stamceller i benmärg redan utförts, med bestämning av en markörkombination av celler som kan transdifferentiera till neurala stamprogenitorceller (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Celler har erhållits som bildar neurosfärer in vitro och bildar neuroner när de transplanteras in i hjärnan hos nyfödda immunbristfälliga möss. Av intresse för cellulär xenotransplantologi är resultaten av studier om möjligheten till korstransplantation av stamceller hos individer av evolutionärt avlägsna taxa. Resultaten av neurala stamcellsimplantation i hjärntumörområdet förblir utan korrekt tolkning: transplanterade celler migrerar aktivt genom tumörvolymen utan att gå utanför dess gränser, och när celler introduceras i den intakta delen av hjärnan observeras deras aktiva migration mot tumören. Frågan om den biologiska betydelsen av sådan migration förblir öppen.

Det bör noteras att framgångsrik transplantation av neurala stamceller, såväl som andra neurala progenitorceller erhållna från neuralrörsceller (ESC), endast är möjlig när man använder högrenade neurala progenitorceller, eftersom odifferentierade embryonala stamceller oundvikligen omvandlas till teratom och teratokarcinom när de transplanteras till en vuxen immunkompetent mottagare. Även en minimal mängd dåligt differentierade celler i donatorcellsuspensionen ökar kraftigt transplantatets tumörbildning och ökar oacceptabelt risken för tumörutveckling eller bildandet av icke-neural vävnad. Att erhålla homogena populationer av neurala progenitorceller är möjligt när man använder celler som uppstår i vissa stadier av normal embryogenes som en alternativ källa till donatorvävnad. En annan metod innebär noggrann eliminering av oönskade cellpopulationer genom härstamningsspecifik selektion. Användningen av ESC för neurotransplantation efter deras otillräckliga exponering in vitro för tillväxtfaktorer är också farlig. I detta fall kan ett misslyckande av det neurala differentieringsprogrammet med bildandet av strukturer som är inneboende i neuralröret inte uteslutas.

Idag är det ganska uppenbart att neurala stamceller uppvisar tropism för patologiskt förändrade områden i centrala nervsystemet och har en uttalad regenerativ-plastisk effekt. Mikromiljön i området för celldöd i nervvävnaden modellerar differentieringsriktningen för transplanterade celler, vilket kompenserar för bristen på specifika neurala element inom zonen med CNS-skada. I vissa neurodegenerativa processer uppstår neurogena signaler för att återskapa neurogenesen, och neurala stamceller i den mogna hjärnan kan reagera på denna lärorika information. Många experimentella data tjänar som en tydlig illustration av den terapeutiska potentialen hos neurala stamceller. Intracisternal administrering av en klon av neurala stamceller till djur med ligering av den mellersta hjärnartären (en modell för ischemisk stroke) hjälper till att minska arean och volymen av det destruktivt förändrade området i hjärnan, särskilt vid transplantation av neurala stamceller tillsammans med FGF2. Immuncytokemiskt observeras migration av donatorceller till den ischemiska zonen med deras efterföljande integration med intakta mottagarhjärnceller. Transplantation av omogna celler från musens neuroepiteliala linje MHP36 till hjärnan hos råttor med experimentell stroke förbättrar sensomotorisk funktion, och införandet av dessa celler i hjärnventriklarna förstärker kognitiv funktion. Transplantation av neuralt förformade hematopoetiska celler från mänsklig benmärg till råttor eliminerar dysfunktion i hjärnbarken orsakad av ischemisk skada. I detta fall migrerar xenogena neurala progenitorceller från injektionsstället till zonen med destruktiva förändringar i hjärnvävnaden. Intrakraniell transplantation av homologa benmärgsceller vid traumatisk skada på hjärnbarken hos råttor leder till partiell återställning av motorisk funktion. Donatorceller transplanteras in, prolifererar, genomgår neural differentiering till neuroner och astrocyter och migrerar mot lesionen. När de injiceras i striatum hos vuxna råttor med experimentell stroke ersätter klonade mänskliga neurala stamceller skadade CNS-celler och återställer delvis nedsatt hjärnfunktion.

Mänskliga neurala stamceller isoleras huvudsakligen från det embryonala telencefalonet, som utvecklas mycket senare än mer kaudalt belägna delar av nervstammen. Möjligheten att isolera neurala stamceller från ryggmärgen hos ett 43-137 dagar gammalt mänskligt foster har visats, eftersom dessa celler i närvaro av EGF och FGF2 bildar neurosfärer och uppvisar multipotens vid tidiga passager, och differentierar till neuroner och astrocyter. Långvarig odling av neurala progenitorceller (över 1 år) berövar dem dock multipotensen - sådana celler kan endast differentieras till astrocyter, dvs. de blir unipotenta. Regionala neurala stamceller kan erhållas som ett resultat av partiell bulbektomi och, efter reproduktion i kultur i närvaro av LIF, transplanteras till samma patient med neurodegenerativa förändringar i andra delar av det centrala nervsystemet. I kliniken utfördes först ersättningscellsterapi med neurala stamceller för att behandla patienter med stroke åtföljd av skador på hjärnans basala ganglier. Som ett resultat av transplantation av donatorceller noterades en förbättring av det kliniska tillståndet hos de flesta patienter.

Vissa författare menar att neurala stamcellers förmåga att transplantera, migrera och integreras i olika områden av nervvävnad vid CNS-skada öppnar upp obegränsade möjligheter för cellterapi av inte bara lokala, utan även omfattande (stroke eller kvävning), multifokala (multipel skleros) och till och med globala (de flesta ärftliga metabola sjukdomar eller neurodegenerativa demens) patologiska processer. När klonade neurala stamceller från mus och människor transplanteras till mottagardjur (möss respektive primater) med degeneration av dopaminerga neuroner i det mesostriatala systemet inducerad genom införandet av metylfenyltetrapyridin (modell för Parkinsons sjukdom) 8 månader före transplantation, integreras donatorns neurala stamceller i mottagarens CNS. En månad senare lokaliseras de transplanterade cellerna bilateralt längs mitthjärnan. Några av de resulterande neuronerna av donatorursprung uttrycker tyrosinhydrolas i frånvaro av tecken på en immunreaktion mot transplantatet. Hos råttor som administrerades 6-hydroxydopamin (en annan experimentell modell av Parkinsons sjukdom) bestämdes de transplanterade cellernas anpassning till mikromiljön i värdhjärnan av förhållandena vid odling av neurala stamceller före deras transplantation. Neurala stamceller, som snabbt prolifererade in vitro under inverkan av EGF, kompenserade för bristen på dopaminerga neuroner i det skadade striatumet mer effektivt än celler från 28-dagarskulturer. Författarna tror att detta beror på förlusten av förmågan att uppfatta motsvarande differentieringssignaler under celldelningsprocessen hos neurala progenitorceller in vitro.

I vissa studier har man försökt öka effektiviteten av effekten på processerna för reinnervation av det skadade striatumet genom att transplantera embryonala striatumceller till detta område som en källa till neurotrofiska faktorer med samtidig transplantation av dopaminerga neuroner i ventral mesencephalon. Det visade sig att effektiviteten av neurotransplantation till stor del beror på metoden för att införa embryonal nervvävnad. Som ett resultat av studier av transplantation av embryonala nervvävnadspreparat i hjärnans ventrikulära system (för att undvika skada på striatumparenkymet) erhölls information om deras positiva effekt på motoriska defekter vid Parkinsonism.

I andra studier har dock experimentella observationer visat att transplantation av embryonala nervvävnadspreparat från ventral mesencefalon innehållande dopaminerga neuroner till hjärnventrikeln, såväl som transplantation av GABA-erga embryonala neurala element till striatum hos råttor med hemiparkinsonism, inte främjar återställandet av de nedsatta funktionerna i det dopaminerga systemet. Tvärtom bekräftade immunocytokemisk analys data om den låga överlevnadsgraden för dopaminerga neuroner från ventral mesencefalon transplanterade till råttors striatum. Den terapeutiska effekten av intraventrikulär transplantation av embryonal nervvävnad från ventral mesencefalon uppnåddes endast under förutsättning att en preparation av embryonala striatala celler implanterades samtidigt i det denerverade striatumet. Författarna tror att mekanismen för denna effekt är förknippad med den positiva trofiska effekten av GABA-erga element från embryonala striatum på den specifika dopaminerga aktiviteten hos intraventrikulära ventrala mesencefalontransplantationer. En uttalad glialreaktion i transplantationerna åtföljdes av en liten regression av apomorfintestparametrarna. Det senare korrelerade i sin tur med GFAP-halten i blodserumet, vilket direkt indikerade en kränkning av blod-hjärnbarriärens permeabilitet. Baserat på dessa data drog författarna slutsatsen att GFAP-nivån i blodserumet kan användas som ett adekvat kriterium för att bedöma transplantatets funktionella tillstånd, och ökad permeabilitet i blod-hjärnbarriären för neurospecifika antigener såsom GFAP är en patogenetisk länk i utvecklingen av transplantationsmisslyckande på grund av autoimmuna skador på mottagarens nervvävnad.

Ur andra forskares synvinkel är inympningen och integrationen av neurala stamceller efter transplantation stabil och livslång, eftersom donatorceller finns hos mottagarna i minst två år efter transplantationen och utan en signifikant minskning av deras antal. Försök att förklara detta med det faktum att neurala stamceller i ett odifferentierat tillstånd inte uttrycker MHC klass I och II-molekyler på en nivå som är tillräcklig för att inducera en immunavstötningsreaktion kan endast anses vara sanna i relation till lågdifferentierade neurala prekursorer. Emellertid bevaras inte alla neurala stamceller i mottagarens hjärna i ett omoget vilande tillstånd. De flesta av dem genomgår differentiering, under vilken MHC-molekyler uttrycks fullt ut.

I synnerhet är den otillräckliga effektiviteten av att använda intrastriatal transplantation av embryonala ventrala mesencefalonpreparat innehållande dopaminerga neuroner för behandling av experimentell parkinsonism förknippad med den låga överlevnadsgraden för transplanterade dopaminerga neuroner (endast 5–20 %), vilket orsakas av reaktiv glios som åtföljer lokalt trauma på hjärnparenkymet under transplantation. Det är känt att lokalt trauma på hjärnparenkymet och samtidig glios leder till störningar i blod-hjärnbarriärens integritet med frisättning av antigener från nervvävnad, i synnerhet OCAR och neuronspecifikt antigen, i det perifera blodet. Närvaron av dessa antigener i blodet kan orsaka produktion av specifika cytotoxiska antikroppar mot dem och utveckling av autoimmun aggression.

V. Tsymbalyuk och medförfattare (2001) rapporterar att den traditionella synvinkeln fortfarande gäller, enligt vilken det centrala nervsystemet är en immunologiskt privilegierad zon isolerad från immunsystemet genom blod-hjärnbarriären. I sin litteraturgenomgång citerar författarna ett antal arbeten som indikerar att denna synvinkel inte helt överensstämmer med essensen av immunprocesser i däggdjurshjärnan. Det har fastställts att märkta substanser som introduceras i hjärnparenkymet kan nå djupa cervikala lymfkörtlar, och efter intracerebral injektion av antigener bildas specifika antikroppar i kroppen. Celler i cervikala lymfkörtlar svarar på sådana antigener genom proliferation, med början den 5:e dagen efter injektionen. Bildningen av specifika antikroppar har också avslöjats under hudtransplantation till hjärnparenkymet. Författarna till översikten ger flera hypotetiska vägar för antigentransport från hjärnan till lymfsystemet. En av dem är övergången av antigener från de perivaskulära utrymmena till subaraknoidalrummet. Det antas att de perivaskulära utrymmena lokaliserade längs hjärnans stora kärl motsvarar lymfsystemet i hjärnan. Den andra vägen går längs de vita fibrerna - genom etmoideumbenet in i lymfkärlen i nässlemhinnan. Dessutom finns ett omfattande nätverk av lymfkärl i dura mater. Blod-hjärnbarriärens ogenomtränglighet för lymfocyter är också ganska relativ. Det har bevisats att aktiverade lymfocyter kan producera enzymer som påverkar permeabiliteten hos hjärnans "immunfilter"-strukturer. På nivån av postkapillära venoler penetrerar aktiverade T-hjälpare den intakta blod-hjärnbarriären. Tesen om avsaknaden av celler i hjärnan som representerar antigener håller inte för kritik. För närvarande har möjligheten att representera antigener i CNS av minst tre typer av celler övertygande bevisats. För det första är dessa dendritiska celler härledda från benmärg som är lokaliserade i hjärnan längs stora blodkärl och i den vita substansen. För det andra kan antigener presentera endotelceller i hjärnans blodkärl, och i samband med MHC-antigener, vilket stöder den klonala tillväxten av T-celler specifika för dessa antigener. För det tredje fungerar mikro- och astrogliaceller som antigenpresenterande ämnen. Astrocyter deltar i bildandet av immunsvaret i det centrala nervsystemet och förvärvar egenskaperna hos en immuneffektorcell och uttrycker ett antal antigener, cytokiner och immunmodulatorer. När de inkuberas med y-interferon (y-INF) uttrycker astrogliaceller in vitro MHC klass I- och II-antigener, och stimulerade astrocyter kan presentera antigen och upprätthålla klonal proliferation av lymfocyter.

Hjärnvävnadstrauma, postoperativ inflammation, ödem och fibrinavlagringar som åtföljer embryonal nervvävnadstransplantation skapar förutsättningar för ökad permeabilitet av blod-hjärnbarriären med nedsatt autotolerans, sensibilisering och aktivering av CD3+CD4+ lymfocyter. Presentation av auto- och alloantigener utförs av astrocyter och mikrogliaceller som svarar på y-INF genom att uttrycka MHC-molekyler, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimulerande molekyler B7-1 (CD80) och B7-2 (CD86), samt utsöndring av IL-la, IL-ip och y-INF.

Följaktligen kan det faktum att embryonal nervvävnad överlever längre efter intracerebral transplantation än efter perifer administrering knappast kopplas till avsaknaden av initiering av transplantationsimmunitet. Dessutom spelar monocyter, aktiverade lymfocyter (cytotoxiska CD3+CD8+ och T-hjälparceller) och de cytokiner de producerar, såväl som antikroppar mot antigener från det perifera transplantatet av embryonal nervvävnad, en viktig roll i processen för dess avstötning. En låg nivå av MHC-molekyler i embryonal nervvävnad är av viss betydelse för att skapa förutsättningar för längre resistens hos neurotransplantationer mot T-cellsimmunprocesser. Det är därför immuninflammation efter transplantation av embryonal nervvävnad till hjärnan utvecklas långsammare i experimentet än efter hudtransplantation. Icke desto mindre observeras fullständig destruktion av individuella transplantat av nervvävnad efter 6 månader. I detta fall är T-lymfocyter som är begränsade av MHC klass II-antigener huvudsakligen lokaliserade i transplantationszonen (Nicholas et al., 1988). Det har experimentellt fastställts att under xenologisk neurotransplantation förlänger utarmning av T-hjälpare (L3T4+), men inte cytotoxiska T-lymfocyter (Lyt-2), överlevnaden av råttnervvävnad i hjärnan hos mottagarmöss. Avstötning av neurotransplantatet åtföljs av dess infiltration av värdmakrofager och T-lymfocyter. Följaktligen agerar värdmakrofager och aktiverade mikrogliaceller in situ som antigenpresenterande immunstimulerande celler, och ökat uttryck av donator-MHC klass I-antigener förstärker mördaraktiviteten hos mottagarcytotoxiska T-lymfocyter.

Det är meningslöst att analysera de många spekulativa försöken att förklara avstötningen av neurotransplantationer genom mottagarens immunsystems reaktion på donatorns endotelceller eller gliaceller, eftersom även rena neurala progenitorceller utsätts för immunattacker. Det är anmärkningsvärt att uttrycket av Fas-ligander av hjärnceller som binder apoptosreceptorer (Fas-molekyler) på T-lymfocyter som infiltrerar hjärnan och inducerar deras apoptos spelar en viktig roll i mekanismerna för längre transplantationsöverlevnad inom CNS, vilket är en typisk skyddsmekanism för transbarriärautoimmunogena vävnader.

Som V. Tsymbalyuk och medförfattare (2001) med rätta påpekar, kännetecknas transplantation av embryonal nervvävnad av utveckling av inflammation med deltagande av celler som är sensibiliserade för hjärnantigener och aktiverade celler, antikroppar, samt som ett resultat av lokal produktion av cytokiner. En viktig roll i detta spelas av den redan existerande sensibiliseringen av kroppen för hjärnantigener, vilket sker under utvecklingen av CNS-sjukdomar och kan riktas mot transplantationsantigener. Det är därför den verkligt långsiktiga överlevnaden av histoinkompatibla neurotransplantationer endast uppnås genom att undertrycka immunförsvaret med ciklosporin A eller genom att introducera monoklonala antikroppar mot mottagarens CD4+ lymfocyter.

Således förblir många problem med neurotransplantation olösta, inklusive de som rör vävnadernas immunologiska kompatibilitet, vilka endast kan lösas efter riktad grundläggande och klinisk forskning.