Mesenkymala stamceller

Bland de regionala stamcellerna upptar mesenkymala stamceller (MSC) en särskild plats, vars derivat utgör stromalmatrisen av alla organ och vävnader i människokroppen. Prioritering i MSC: s forskning hör till företrädare för rysk biologisk vetenskap.

I mitten av förra seklet isolerades en homogen kultur av multipotenta stromala benmärgsstamceller först i laboratoriet av A. Friedenshtein. Mesenkymala stamceller bundna till ett substrat under en lång tid bibehöll en hög proliferationshastighet, och kulturerna vid låg såddensitet efter fixering på ett substrat bildat av fibroblast-cellkloner som har ingen fagocytisk aktivitet. Stoppet av MSC-proliferation resulterade i deras spontana in vitro-differentiering i ben-, fett-, brosk-, muskel- eller bindvävsceller. Ytterligare studier har gjort det möjligt att fastställa den osteogena potentialen hos fibroblastliknande celler i benmärgsstromen hos olika däggdjursarter, liksom deras kolonidannande aktivitet. Vid experiment in vivo visades att både hetero- och orthotopic transplantation av fibroblast kolonibildande cell avslutade formnings ben, brosk, och fibrös fettvävnad. Eftersom benmärgsstamceller har en hög kapacitet för självförnyelse och en mångfald differentiering inom en enda cellinje, har de kallats multipotenta mesenkymala stamceller.

Det bör noteras att i 45 år med grundforskning av mesenkymala stamceller har reella tillstånd skapats för användning av deras derivat i klinisk praxis.

Idag är det ingen tvekan om att alla vävnader i människokroppen bildas av stamceller från olika cellinjer som ett resultat av processer av proliferation, migration, differentiering och mognad. Emellertid förmodades det att stamceller i den vuxna kroppen är vävnadsspecifika, det vill säga att de kan producera specialiserade cellinjer endast av vävnaderna i vilka de är belägna. Denna konceptuella situation motbevisades av fakta om transformation av hematopoetiska stamceller, inte bara i cellulära delar av perifert blod utan också till ovala leverceller. Dessutom kunde neurala stamceller ge upphov till både neuroner och gliala element, liksom tidigt engagerade linjer av hematopoetiska stamceller. I sin tur kan mesenkymala stamceller, som vanligtvis producerar cellulära element i ben, brosk och fettvävnad, omvandlas till neurala stamceller. Det antas att i processens tillväxt, fysiologisk och reparativ vävnadsregenerering, genereras obestämda stamceller från vävnadsspecifika stamreserver. Till exempel kan reparation av muskelvävnad realiseras med hjälp av mesenkymala stamceller som migrerar från benmärg till skelettmuskler.

Även om sådana tvär utbytbarhet stamceller identifierar inte alla forskare möjligheten till klinisk användning av de mesenkymala stamcellerna som en källa för celltransplantation och cellvektor av genetisk information inte har ifrågasatts som multipotenta stromala benmärgsstamceller, som kan vara relativt lätt att isolera och utbreder i odling in vitro. Samtidigt i den vetenskapliga litteraturen fortsätter att visas rapporter om potentialen hos pluripotenta stamceller i benmärgen stroma. Som bevis presenteras forskningsprotokoll, som under inverkan av specifika inducerare av transdifferentiering av MSC omvandlas till nervceller, kardiomyocyter och hepatocyter. Men för att återaktivering och genuttryck under tidig embryogenes allvarliga tvivel vissa forskare möjligheten. Samtidigt, alla förstår att om förhållandena befinns expandera multi mesenkymala stamceller för att pluripotens av ekonomiska och sociala råd i regenerativ medicin och plast automatiskt löst många problem etiska, moraliska, religiösa och rättsliga karaktär. Dessutom, eftersom i detta fall källan till stammen förnyelseförmåga hos patienten är autologa stromaceller löses och problemet med immunavstötning av celltransplantat. Hur realistiskt är utsikterna snar framtid kommer att visa.

[1], [2], [3], [4]

Användning av mesenkymala stamceller i medicin

Kliniken användningen av derivat av mesenkymala stamceller associeras primärt med reduktionen av vävnadsdefekter som orsakats av omfattande och djupa termiska skador på huden. Preklinisk experimentell utvärdering av lämpligheten av allogena fibroblastliknande mesenkymala stamceller för behandling av djupa brännskador genomfördes. Det visas att de fibroblastliknande benmärgs mesenkymala stamceller bilda ett monoskikt i kultur, vilket gör det möjligt att transplantera dem för att optimera regenereringen av djupa brännskador. Författarna noterar att liknande egenskaper har embryonala fibroblaster, men den kliniska tillämpningen av det senare är begränsat till de existerande etiska och juridiska problem. Djup termisk brännskada med PWA-bekräftas av alla hudlagren förebild Wistar-råttor. Burn området var 18-20% av den totala hudyta. I den första experimentgrupp bestod av råttor med djup termisk skada och transplantation av allogena fibroblast härledda mesenkymala stamceller. Den andra gruppen bestod av djur med djupa brännskador och transplantation av allogena embryonala fibroblaster. Den tredje gruppen av kontrollråttor var försedd med djup värmeskada, som inte utföra cellterapi. En suspension av fibroblastliknande mesenchymala stamceller och embryonala fibroblaster applicerades på en brännskada lindad yta pipetter i en mängd av 2 x 10 ⁴ celler på 2: a dagen efter excision av bränn modellering och nekrotisk sårskorpa bildas. Efter transplantation, celler bränna yta täckt med gasbinda indränkt i isoton natriumkloridlösning med gentamicin. Staket benmärgsceller för att erhålla MSCs med efterföljande induktion av fibroblast linje i mesenkymala stamceller som produceras i vuxna Wistar-råttor från lårbenen. Foster lungfibroblaster erhölls från 14-17 dagars embryon. Embryonala fibroblaster och benmärgsceller för att erhålla ett pre-MSC: er odlades i Petri-skålar vid 37 ° C i en C02 iikubatore, i en atmosfär med 5% CO2 vid 95% fuktighet. Embryonala fibroblaster odlas i 4-6 dagar, medan det för monolager bildande MSC krävs från 14 till 17 dagar. Därefter MSCs underhålls av kryokonservering som ett utgångsmaterial för fibroblastliknande härledda mesenkymala stamceller som framställdes genom upptining och odling av MSC-celler i 4 dagar. Antal fibroblast genererade mesenkymala stamceller är mer än 3 gånger det antal embryonala fibroblaster som uppkommer under samma odlingsperioden. Att identifiera celler i transtslantirovannyh brännsår i steg odla sitt genom märktes med användning viral skyttelvektor baserad på ett rekombinant adenovirus V typ carrier 1AS-2-genen som kodar beta-galaktosidas av E. Coli. Levande celler vid olika tidpunkter efter transplantation detekterades immunhistokemiskt i kryosnitten med tillsatt substrat X-Gal, vilket ger den karakteristiska blå-grön färg. Som ett resultat av visuell dynamisk, planimetrisk och histologisk utvärdering skick brännsår, visade det sig att även vid den 3: e dagen efter transplantation av cellerna i isolerade grupper visas signifikanta skillnader under sårläkningsprocessen. Tydligast denna skillnad är 7 dagar efter celltransplantation. Djuren i den första gruppen, som transplanterades fibroblastliknande mesenkymala stamceller, sår förvärvade likformigt ljus intensiv färg, granulationsvävnad växte över hela sin yta till nivån för epidermis, och bränna ytan reduceras avsevärt i storlek. Flera formad tunnare kollagenfilm till sårytan, men hon fortsatte att täcka hela området av brännskadan. Djuren i den andra gruppen, som transplanterades embryonala fibroblaster, är granulationsväv lyfts till nivån för epidermis hos sårkanterna, men bara på vissa ställen, samtidigt plazmoreya från såret var mer intensiv än i grupp 1, och initialt bildade kollagenfilm praktiskt taget försvunnit. Hos djur som inte fick stamcellsterapi, den 7: e dagen brännsåret var en blek, urkärnade, nekrotisk vävnad, belagda med fibrin. Plasmorrhea noterades genom brännytan. Histologiskt djuren i 1: a och 2: a grupperna visade en minskning av cellulär infiltration och utveckling av kärl har dessa tecken på begynnande regenerator process varit allvarligare i råttorna i Grupp 1. I kontrollgruppen visade tecken på cell lindad infiltration, den histologiska mönster av nybildade blodkärl frånvarande. 15-30: e dagen av observation djuren i 1:e gruppen bränna ytarea var signifikant mindre än i råttorna i andra grupper och granulering ytan var mer utvecklad. I djuren i den 2: a gruppen bränn ytarea är också minskade jämfört med storleken av brännsår i kontrollgruppen av råttor som var på grund av marginal epitelisering. I kontrollen förblev gruppbränn ytplatser bleka granuleringar med sällsynta, som uppträder därpå spindel vener, cellöar var fibrinös plack fortsatt måttlig plazmoreya över brännytan, något som är svårt avtagbar skorv återstod. I allmänhet, djuren i grupp 3 minskar också storleken av såret, men såret förblev podrytymi kant.

Sålunda, under en jämförande studie av sårläkningshastigheter med användning av fibroblast mesenchymala stamceller och fetala fibroblaster, och utan användning av cellterapi markerad acceleration av läkning av brännytan som ett resultat av transplantation av fibroblastliknande mesenchymala stamceller och embryonala fibroblaster. Emellertid, i fallet med användning av allogena mesenkyma stamceller av fibroblast sårläkningshastigheten var högre än vid transplantation av embryonala fibroblaster. Detta manifesterades i accelererande förändring av regenereringsfaser i processen - att reducera cellulär infiltration perioder, ökar graden av proliferation av vaskulära nätverk, såväl som bildningen av granulationsvävnad.

Resultaten av dynamisk planimetri indikerar att hastigheten för spontan läkning av brännsår (utan användning av cellterapi) var den lägsta. På den 15: e och 30: e dagen efter transplantation av allogena mesenkymala stamceller från fibroblast sårläkningstakten var högre än vid transplantation av embryonala fibroblaster. Histokemisk metod för detektion av beta-galaktosidas visade att efter transplantation av fibroblastliknande mesenkymala stamceller och embryonala fibroblaster under hela observationsperioden på ytan och djupa regenererande sår transplanterade cellerna förblir viabla. Författarna föreslår att en högre frekvens av brännskada sår regenere använder mesenkymala stamceller av fibroblastkonditionerat frisättning av dessa celler under mognad rostostimuliruyushih bioaktiva faktorer.

Transplantation av autolog eller allogen keratinocyter och allogena fibroblaster för behandling av brännsår och används i kliniken. Det bör noteras att kirurgisk behandling av barn med omfattande djupa brännskador är en komplicerad uppgift på grund av den höga mångfald av trauma och kirurgiska ingrepp, betydande blodförlust, de olika reaktioner som används infusion media. De största svårigheterna i samband med genomförandet av hud och plastikkirurgi med omfattande djupa brännskador, området som överstiger 40% av kroppsytan, på grund av svårighetsgraden av hennes tillstånd och bristen på resurser donator hud. Användning av mask transplantat med stor perforeringsförhållande löser inte problemet, eftersom bilden efter epiteliziruyutsya cell perforering är mycket långsam, och ofta gör hudtransplantat lyseras eller torr. Sådana beläggningar brännsår som ksenokozha, avlidna allografter, syntetiska filmbeläggningar är inte alltid tillräckligt effektiva, så utveckling av nya metoder för stängning av bränn ytskikt av odlade keratinocyter och fibroblaster. I synnerhet, ett förfarande för att stänga brännytor med användning av odlade allofibroblastov tillhandahåller under transplantation uttalad stimulerande effekt på proliferationen epidermotsitov bevaras i såret gränsen vid brännskador och i keratinocyt transplantat mesh banor. I Budkevich L. Et al (2000) visar resultaten av tillämpning av denna metod för behandling av brännskador hos barn. 31 barn med värmepåverkan mellan 1 och 14 år var under observation. Vid tre barn total yta bränna sår IIIA-B - IV grad var 40%, 25 - 50-70%, även vid de tre - 71-85% av kroppsytan. Tidig kirurgisk necrectomy kombination med transplantation av odlad allofibroblastov och autodermaplasty. I det första steget behandlingen utfördes nekrotisk vävnad excision, den andra - om transplantation av odlad allofibroblastov bärarfilm, den tredje (48 timmar efter transplantation av odlad allofibroblastov) - borttagning av matris och hud flikar med autodermoplasty perforeringsförhållande av 1: 4. Tre patienter inlagda på sjukhus med svår brännskada sjukdom, odlades allofibroblasty transplanteras på granulering sår. Transplantation av odlad allofibroblastov utföras en gång på 18 barn, två gånger - vid 11, tre - två patienter. Området med sårytan, förslutbar cellodling varierade från 30 till 3500 cm2. Effektiviteten av odlade allofibroblastov utvärderas av den totala procentandelen av inympning av hud klaffar, tiden för läkning av brännskador och antalet dödsfall allvarlig värmeskada. Införandet av transplantationer var fullständigt hos 86% av patienterna. Partiella neprizhivlenie hud klaffar noterades i 14% av fallen. Trots pågående behandling dog sex (19,3%) barn. Den totala ytan av hudskador har sträckt sig från 40 till 70% av kroppsytan. Transplantation av odlad allofibroblastov hade ingen relation till döden för brännskador en enda patient.

Analysera resultaten av behandlingen, noterar författarna att tidigare brinner oförenligt med livet, för att behandla djupa värmeskador på huden området 35-40% av kroppsytan (för små barn - upp till 3 år - är kritiska djupa brännskador med en yta på 30%, för äldre barn åldersgrupper - uppåt av 40% av kroppsytan). När kirurgisk transplantation av odlad necrectomy allofibroblastov autodermaplasty och efterföljande hud transplantat med stora brännskador, perforering faktor IIIB - IV grad förblir kritisk, men just nu finns det utsikter i många fall att rädda livet på även sådana offer. Kirurgisk necrectomy i samband med transplantation av odlad allofibroblastov och autodermaplasty hos barn med djupa brännskador har visat sig vara särskilt effektivt hos patienter med avancerade lesioner i huden med ett underskott på donatorställen. Aktiva kirurgiska taktik och transplantera odlade allofibroblastov främja snabb stabilisering av allmäntillstånd av sådana patienter, minskning av antalet infektiösa komplikationer av bränn sjukdom, vilket skapar goda förutsättningar för engraftment, minska tiden för att återställa den förlorade huden och varaktigheten av sjukhusvård, minska förekomsten av dödsfall hos patienter med omfattande brännskador. Sålunda, transplantation av odlad allofibroblastov följt autodermaplasty hud klaffar uppnår återhämtning hos barn med svåra brännskador, som tidigare betraktades dömd.

Det är allmänt accepterat att prioriteras av bränn sjukdom är den mest kompletta och snabb återhämtning av skadad hud för att varna som följer av denna toxiska effekter, infektiösa komplikationer och uttorkning. Resultaten av appliceringen av odlade celler beror till stor del på beredskapen för transplantation av själva brännsåret. I fall av transplantation av odlade keratinocyter till sårytan efter kirurgisk necrectomy prizhivlyaetsya ett genomsnitt av 55% (efter område) av transplanterade celler, medan vid det granulerande sår engraftment hastigheten reduceras till 15%. Därför kräver framgångsrik behandling av omfattande djupa hudförbränningar i första hand aktiva kirurgiska taktik. I närvaro av brännsår IIIB-IV gradens brännskada yta omedelbart befriades från nekrotisk vävnad för att minska fenomenet med berusning och minska mängden komplikationer brännsjukdoms. Användningen av en sådan taktik är nyckeln till att minska den tid från tiden för att bränna till sårförslutning och vistelsetid av patienter med omfattande brännskador på ett sjukhus, men också betydligt minskar antalet dödsfall.

De första rapporterna om framgångsrik användning av odlade keratinocyter för att täcka brännytan uppträdde i början av 1980-talet. Därefter utfördes denna manipulation med hjälp av lager av odlade keratinocyter, som oftast erhållits från autostrukturer, mycket mindre ofta från allokeratinocyter. Emellertid tillåter tekniken för autokeratinocytoplasti inte skapandet av en cellbank, medan tiden som krävs för att producera ett tillräckligt transplantat från keratinocyter är stort och uppgår till 3-4 veckor. Under denna period ökar risken för att utveckla infektiösa och andra komplikationer med brännsjukdom kraftigt, vilket avsevärt förlänger patientens totala längd på sjukhuset. Dessutom nästan ingen autokeratinotsity prizhivlyayutsya transplantation för granulering brännsår och de höga kostnaderna för specialiserade tillväxtmedier och biologiskt aktiva keratinocyttillväxtfaktor stimulerande begränsar deras kliniska användning avsevärt. Andra biotekniska metoder såsom kollagenoplastika transplantation ksenokozhi kryokonserveras liksom användningen av olika biopolymerer beläggningar öka effektiviteten i ytbehandling av omfattande, men inte djupa brännskador. Metoden att belägga sårytan med odlade fibroblaster är fundamentalt annorlunda genom att huvudkomponenten i den odlade cellpoolen inte är keratinocyter utan fibroblaster.

En förutsättning för utvecklingen av metoden tjänade som bevis på att pericyter som omger de små fartyg är pro- genitornymi mesenkymala celler med förmåga att omvandla till fibroblaster, som producerar många tillväxtfaktorer och ger sårläkning på grund av den starka stimulerande effekt på proliferationen och vidhäftning av keratinocyter. Med användning av odlade fibroblaster för stängning sårytor identifierade omedelbart ett antal väsentliga fördelar med denna metod jämfört med användningen av odlade keratinocyter. Framför allt har beredningen av fibroblaster i kultur inte kräver användning av speciella odlingsmedier och tillväxtbefrämjande, vilket minskar kostnaderna för transplantation mer än 10 gånger kostnaden för att erhålla keratinocyter. Fibroblaster lätt utsätts för passaging, under vilken de delvis förlorar sina yta histokompatibilitetsantigener, vilket i sin tur gör det möjligt att använda för framställning av allogena transplantat av celler och skapa sina banker. Förkortar mottar transplantationer, färdiga för användning på en klinik, från 3 veckor (keratinocyter) 1-2 dagar (för fibroblaster). Primära kulturer av fibroblaster kan erhållas genom odling av celler från hudfragment tagna vid autodermoplasty och cellsåddtäthet på kvitto subkulturer av humana fibroblaster är endast 20 × 10 ³ per 1 cm ².

För att studera effekten av fibroblaster och deras regulatoriska proteiner i proliferation och differentiering av keratinocyter, en jämförande analys av de egenskaper och morfologi av keratinocytproliferation på substrat av kollagentyper I och III och fibronektin i samodling med humana fibroblaster. Humana keratinocyter isolerades från huden fragment av patienter med brännskador, tagna under autodermoplasty operation. Tätheten av keratinocyter var 50 x 103 celler per cm2. Den kliniska effekten av transplantation av odlade fibroblaster utvärderades hos 517 patienter. Alla patienter var indelade i två grupper: 1: a - Vuxna drabbade av brännskador IIA, B-IV grad; 2: a - barn med djupa brännskador av IIIB - IV grad. Bedömning av dynamiken i strukturell och funktionell organisation av monokultur av fibroblaster med avseende på roll i regenereringsprocessen av glykosaminoglykaner, fibronektin, kollagen, och tillät författarna för att bestämma den tredje dagen som de mest förmånliga villkor för att använda fibroblastkulturer för produktion av transplantationer. Undersökning av påverkan på fibroblastproliferation och differentiering av keratinocyter visade att under in vitro-fibroblaster har en uttalad stimulerande effekt, primärt på keratinocyt adhesionsprocesser, öka antalet vidhäftande celler och hastigheten för fastställande mer än 2 gånger. Stimulering adhesionsprocesser som åtföljs av en ökad intensitet av DNA-syntes och nivån på keratinocytproliferation. Vidare visade det sig att närvaron av fibroblaster och extracellulär matris som bildas av dem är en förutsättning för bildandet tonofibrillyarnogo apparaten keratinocyt intercellulära förbindelser och, slutligen, för keratinocytdifferentieringen och basalmembranbildning. Vid behandling av barn med djupa brännskador etablerade kliniska effekten av transplantation allofibroblastov kultur, särskilt hos patienter med omfattande skador i huden givar platser i ett underskott. Komplex morfofunktcionalnoe studie visade att transplantatkänne fibroblaster aktiv DNA-syntes, såväl som kollagen, fibronektin och glykosaminoglykaner, vilka alstras i cellerna i den extracellulära matrisen. Författarna föreslår en hög procentandel av inympning av transplanterade fibroblaster (till 96%), en kraftig minskning i termer av deras framställning (inom 2-3 timmar i stället för 24-48 veckor i fallet med keratinocyter), en kraftig acceleration av epitelisering av brinnytan, och en betydande minskning i pris (i 10 gånger) transplantat växande teknik av fibroblaster jämfört med transplantation av keratinocyter. Användningen av transplantation av odlad allofibroblastov gör det möjligt att rädda livet på barn med kritiska brännskador - termisk skada över 50% av kroppsytan, som tidigare ansågs oförenliga med livet. Det är anmärkningsvärt att allogen transplantation av embryonala fibroblaster också övertygande visat inte bara snabbare regeneration av sår och konvalescens patienter med olika gradens brännskada och område, men också en betydande minskning av dödligheten.

Autologa fibroblaster används i ett sådant komplicerat och plastikkirurgi som ersättning korrigering skada stämbanden. Som vanligtvis används för detta ändamål bovint kollagen, verkningstid som begränsas av dess immunogenicitet. Som ett främmande protein, bovint kollagen, kollagenas känslig för mottagaren och kan orsaka immunreaktioner, för att minska risken som tekniken för kollagenpreparat har utvecklats, tvärbunden med glutaraldehyd. Deras fördel är större stabilitet och lägre immunogenicitet, som har funnit praktisk tillämpning i avlägsnandet av defekter och stämbands atrofi. Autologa kollagen injektioner började användas 1995. Metoder förutsatt bevarande av den primära strukturen av autologa kollagenfibrer, inklusive enzymatiskt katalyserade intramolekylära tvärbindningar. Det faktum att naturliga kollagenfibrer är mer resistenta mot nedbrytning genom proteaser än rekonstituerade kollagen telopeptider varvid cut. Integritet telopeptider viktigt för den kvartära strukturen hos kollagenfibrerna och tvärbindning mellan intilliggande kollagenmolekyler. Till skillnad från beredningar av bovint kollagen, betyder autologt kollagen som inte orsakar immunsvar hos mottagaren, men det är inte tillräckligt effektivt som fyller medel. Ihållande korrigering kan uppnås på grund av den lokala produktionen av autolog transplantation av kollagen av fibroblaster. Men utredningen av effektiviteten i transplantation av autologa fibroblaster i klinik avslöjade vissa svårigheter. I den tidiga perioden efter transplantation fibroblast klinisk effekt var svagare jämfört med den efter administration av bovint kollagen. När odlade autologa fibroblaster inte kan utesluta möjligheten att omvandlingen av normala fibroblaster i onormal, de så kallade myofibroblaster, som ansvarar för utvecklingen av fibros och ärrbildning, vilket framgår av minskningen av kollagen gel, på grund av den specifika interaktionen av fibroblaster och kollagenfibriller. Vidare, efter det att seriepassage fibroblasterna in vitro förlorar sin förmåga att syntetisera extracellulära matrisproteiner.

Trots detta har för närvarande tekniken för odling av autologa humana fibroblaster eliminerats experimentellt, vilket eliminerar ovanstående nackdelar och inte leder till onkogen transformation av normala fibroblaster. Autologa fibroblaster erhållna med denna metod används för att fylla defekterna i ansiktsmjukvävnaden. I en studie av H. Keller och medförfattare (2000) fick 20 patienter i åldern 37 till 61 år med rynkor och atrofiska ärr behandling. Hudbiopsier (4 mm) BTE region vi transporteras till laboratoriet i sterila rör innehållande 10 ml odlingsmedium (Dulbecco antibiotikum mikoseptikom, pyruvat och fetalt bovint serum). Materialet placerades inuti 3-5 odlingsrätter med en diameter av 60 mm och inkuberades i en termostat med en atmosfär innehållande 5% CO2. Efter 1 vecka avlägsnades cellerna från disken genom trypsinisering och placerades i 25 cm2 flaskor. Cellerna administreras till patienter i en mängd av 4 x 107. Den betydande och långvarig klinisk effekt observerades hos patienter med korrektions nasolabiala veck, och hos patienter med ärr efter 7 och 12 månader efter den tredje transplantation av autologa fibroblaster. Enligt flödescytometri producerade odlade fibroblaster en stor mängd kollagen av typ I. In vitro-studier visas den normala kontraktiliteten hos injicerbara fibroblaster. Två månader efter subkutan administrering av odlade fibroblaster i en dos av 4 x 107 celler detekterades inte nakna möss. Injicerbara fibroblaster orsakade inte ärrbildning och diffus fibros hos patienter. Enligt författaren kan de implanterade autologa fibroblasterna ständigt producera kollagen, vilket kommer att ge kosmetisk föryngringseffekt. I det här fallet, eftersom livslängden hos differentierade celler är begränsad, är fibroblaster som tagits från en ung patient mer effektiva än de som erhålls hos äldre människor. I framtiden antas risken för frysförvaring av odlade fibroblaster tagna från unga givare som ska transplanteras senare en äldre patient av sina egna unga celler. Sammanfattningsvis är det inte helt korrekt att slutsatsen att autologa fibroblaster under förutsättning för deras funktionella bevarande är det perfekta sättet att korrigera defekter i ansiktets mjuka vävnader. Samtidigt uppfattar författaren själv att det i samband med forskningen uppstod några problematiska situationer i samband med användningen av ett autologt fibroblast-kollagensystem. Den kliniska effekten var ofta svagare än vid användning av bovin kollagen, vilket orsakade besvikelse hos patienter.

I allmänhet ser litteraturdata om utsikterna för klinisk användning av mesenkymala stamceller ganska optimistisk ut. Försök görs att använda autologa benmärgsmultipenta mesenkymala stamceller för behandling av degenerativa gemensamma skador. De första kliniska prövningarna av odlade mesenkymala progenitorceller vid behandling av komplexa sprickor av ben utförs. Autologa och allogena mesenkyma stromala benmärgsceller som används för att generera broskvävnad för transplantation vid korrigering av de artikulära broskdefekter på grund av trauma eller autoimmuna lesioner. Praktiserade metoder för klinisk tillämpning av multi mesenkymala stamceller för att korrigera bendefekter hos barn med svår osteogenesis framsteg orsakas av mutationer av typ I kollagen-genen. Efter mieloabelyatsii barn-mottagare av transplanterad benmärg från HLA-kompatibel frisk givare som ofraktionerat benmärg kan innehålla en tillräcklig mängd av mesenkymala stamceller för att fylla på svår bendefekt. Efter transplantation av allogen benmärg hade sådana barn positiva histologiska förändringar i trabekulära ben, en ökning av tillväxten och en minskning av incidensen av benfrakturer. I vissa fall uppnås ett positivt kliniskt resultat genom att transplantera nära besläktad allogen benmärg och osteoblaster. För behandling av medfödd bräcklighet av ben på grund av obalans av osteoblaster och osteoklaster i benvävnad används MSK-transplantation också. Återställande av benbildning i detta fall uppnås på grund av chimerisering av poolen av stam- och progenitorstromceller i patientens benvävnad.

Metoderna för genetisk modifiering av donator-mesenkymala stamceller förbättras för att korrigera genetiska defekter av stromala vävnader. Det är tänkt att mesenkymala stamceller snart kommer att användas i neurologi för riktad chimerisering hjärnceller och skapa en pool av friska celler, som kan alstra bristfällig enzym eller faktor är ansvarig för de kliniska manifestationerna av sjukdomen. Transplantation av mesenkymala stamceller kan användas för att återställa benmärgsstroma hos cancerpatienter efter radio och kemoterapi och i kombination med benmärgsceller - för att återställa hemopoiesis. Utveckling av substitutionsterapi som syftar till att eliminera defekterna hos det muskuloskeletala systemet använder MSC: er främja ingenjörs i designen matris biomaterial eller biomimics bildar skelett bebor avkomman av mesenkymala stamceller.

Källor av mesenkymala stamceller

Den främsta källan till mesenkymala stamceller är benmärgs hematopoetisk stamceller som i däggdjur ständigt differentiera i blodkroppar och immunförsvaret, medan mesenkymala stamceller presenteras små populationer av fibroblastliknande benmärgsstromaceller och bidra till att upprätthålla odifferentierade tillstånd hematopoetiska stamceller. Under vissa förhållanden, mesenkymala stamceller differentiera till celler av brosk och ben. Vid utstrykning på ett odlingsmedium i låga densitets sättning mononukleära benmärgs stromala celler bildar kolonier av adherenta celler, som i själva verket är fibroblast multipotenta mesenkymala prekursorceller. Vissa författare har föreslagit att benmärg deponeras obekräftade mesenkymala stamceller, som tack vare förmågan att själv förnya och hög differentiering potential, ger alla vävnader i kroppen föregångare mesenkymala stromaceller hela livet däggdjursorganism.

I benmärgen bildar stromcellselement ett nätverk som fyller utrymmet mellan sinusoider och benvävnad. Innehållet av vilande MSC i benmärgen hos en vuxen är jämförbar med antalet hematopoetiska stamceller och överstiger inte 0,01-0,001%. Mesenkymala stamceller isolerade från benmärg och inte utsatt för odling är sakna adhesiva molekyler. Sådana MSC uttrycker inte CD34, ICAM, VCAM, typ I och III kollagen, CD44 och CD29. Därför, i vitro mesenkymala stamceller inte är fixerade på odlingssubstratet, och mer avancerade stamfaderhärledda mesenkymala stamceller, har bildat de cytoskelettala komponenter och receptorapparat av celladhesionsmolekyler. Stromala celler med fenotypen CD34 finns även i perifert blod, även om de är mycket mindre i benmärgen än CD34-positiva mononukleära celler. CD34-cellerna isolerade från blodet och överfördes till kulturen fäst vid substratet och bilda kolonier av fibroblastliknande celler.

Det är känt att under den embryonala perioden uppkommer stromabasen hos alla organ och vävnader hos däggdjur och människor från en gemensam pool av mesenkymala stamceller före och vid organogenessteget. Därför är det troligt att i en mogen kropp ska de flesta mesenkymala stamceller vara i bindväv och benvävnad. Det har etablerats att majoriteten av cellulära element i strom av lös bind- och benvävnad representeras av engagerade stamceller, vilka emellertid behåller förmågan att proliferera och bilda kloner in vitro. Med införandet av sådana celler i det totala blodflödet implanteras mer än 20% av de mesenkymala progenitorcellerna bland de stromala elementen i den hematopoetiska vävnaden och de parenkymala organen.

En potentiell källa för mesenkymala stamceller är fettvävnad, bland vilka av engagerade stamceller som finns i varierande grad av adipocyt progenitorer. Minst mogna prekursorceller element av fettvävnad - stromala-vaskulära celler, vilket är samma som multipotenta mesenkymala stamceller i benmärgen kan differentieras till adipocyter under inverkan av glukokortikoider, insulinliknande tillväxtfaktor och insulin. I kulturen av stromala vaskulära celler differentierar till adipocyter och kondrocyter och fettvävnad benmärgshärledda celler bildar adipocyter och osteoblaster.

I musklerna hittades också stromala stamkällor. I den primära kulturen av celler isolerade från humana skelettmuskler detekteras celler av stellatform och multinucleaterade myotubes. I närvaro av hästserum stellatceller proliferera in vitro utan tecken på cytodifferentiation och efter tillsatsen av dexametason till odlingsmediet av differentiering kännetecknas av uppkomsten av cellelement celler med fenotypen av skelett och glatt muskulatur, ben, brosk, och fettvävnad. Följaktligen är både begåvade och okomplicerade multipotenta mesenkymala progenitorceller närvarande i den mänskliga muskelvävnaden. Det visas att en population av progenitorceller som är närvarande i skelettmuskel kommer från outnyttjade multibenmärgs mesenkymala progenitorceller, och skiljer sig från myogena satellitceller.

I myokardiet av nyfödda råttor fann också vidhäftande stellatceller, lämpliga för differentieringspotential av multi mesenkymala progenitorceller, som under inverkan av dexametason de differentierar till adipocyter, osteoblaster, kondrocyter, glatta muskelceller, myotuber av skelettmuskel och hjärtmuskelceller. Det har visats att vaskulära glatt muskelceller (pericyter) är härledda multi odifferentierad perivaskulär mesenkymala prekursorceller. I kulturen av perivaskulära mesenkymala stamceller uttrycker en-glattmuskelaktin och blodplättshärledd tillväxtfaktorreceptor och kan differentiera minst glatta muskelceller.

En speciell plats i form av stamreserver är den broskiga vävnaden, vars extremt låga reparativa potential antas bero på en brist på multipotenta mesenkymala stamceller eller differentierings- och tillväxtfaktorer. Det antas att de multipotenta mesenkymala progenitorcellerna donerade till kondro- och osteogenesen kommer in i den broskvävnad från andra vävnadskällor.

Vävnadsprung och villkor för uppdrag av mesenkymala stamceller i senorna är inte heller etablerade. Ekspermentalnye observationer tyder på att i tidiga postnatala kanin Achilles tendon celler i primära kulturer i den första passagen och behålla uttryck av kollagen typ I och dekorin, men vid ytterligare odling de förlorar tenotsitov differentieringsmarkörer.

Det bör noteras att svaret på frågan om verkligen lokaliserade i olika vävnader av multi mesenkymala stamceller är alltid närvarande i deras stroma eller vävnads pool av mesenkymala stamceller kompenseras genom migration av stromal benmärgsstamceller, är det fortfarande väntade.

Förutom benmärgen och andra mesenkymala vävnadszoner hos en vuxen organism kan en ytterligare källa till MSC vara sladdblod. Det har visats att navelsträngs ven blod innehåller celler som har liknande morfologiska och antigena egenskaper med multipotenta mesenkymala progenitorceller är kapabla av adhesion, och inte sämre multipotenta mesenkymala progenitorceller av benmärgen ursprung genom differentiering potential. I kulturer av mesenkymala stamceller från navelsträngsblod som detekteras från 5 till 10% obekräftade multipotenta mesenkymala stamceller. Det visade sig att deras antal i navelsträngsblod är omvänt proportionell mot gestationsålder, som är indirekt bevis för migrering av multi mesenkymala stamceller i olika vävnader under fosterutvecklingen. Fanns det första information om klinisk tillämpning av de mesenkymala stamceller isolerade från navelsträngsblod, såväl som embryonala härledd biomaterial, som är baserat på den kända förmågan hos fetala stamceller integrerar och funktion prizhivlyatsya med organ och vävnadssystem vuxna mottagare.

Sökandet efter nya källor till mesenkymala stamceller

Användningen av mesenkymala stamceller av embryoniskt ursprung, som andra fosterceller, skapar ett antal etiska, juridiska, juridiska och lagstiftande problem. Därför fortsätter sökningen efter extraembryonalt cellulärt givarmaterial. Försök misslyckades klinisk tillämpning av humana hudfibroblaster fastställdes genom att inte bara den höga finansiella kapacitet av teknik, men också snabb differentiering av fibrocyter i fibroblaster har betydligt mindre potential spridning och producerar ett begränsat antal tillväxtfaktorer. Ytterligare framsteg när det gäller att studera biologi av MSK och multipotenta mesenkymala benmärgsprecursorer möjliggjorde utvecklingen av en strategi för klinisk användning av autologa mesenkymala stamceller. Tekniken för deras isolering, odling, reproduktion av ex vivo och riktad differentiering krävde först och främst studiet av MSC: s molekylära markörspektrum. Deras analys visade att i de primära kulturerna av mänsklig benvävnad finns det flera typer av multipotenta mesenkymala stamceller. Pro-osteoblastfenotypen hittades i celler som uttrycker en markör för stromala prekursorceller STRO-1, men inte bärande ett osteoblastmarkör-alkaliskt fosfatas. Sådana celler kännetecknas av en låg förmåga att bilda en mineraliserad benmatris, såväl som frånvaron av uttryck av osteopontin och parathyroidhormonreceptorn. Derivat av STRO-1-positiva celler som inte uttrycker alkaliskt fosfatas representeras av mellanliggande och fullständigt differentierade osteoblaster. Det är etablerat att cellelementen i klonade linjer av STRO-1-positiva celler av humana trabekulära ben kan skilja sig från mogna osteocyter och adipocyter. Riktningen differentiering av dessa celler beror på exponering av fleromättade fettsyror, proinflammatoriska cytokiner - IL-1b och tumörnekrosfaktor a (TNF-a), såväl som antiinflammatoriska och immunosuppressiva TGF-b.

Senare visade det sig att multi mesenkymala prekursorceller saknar specifik endast för dem inneboende fenotyp, men uttrycka komplexa markörer, karakteristiska för mesenkymala, endotelceller, epitelceller och muskelceller i frånvaro av uttryck av hematopoetisk cell immunophenotypic antigener - CD45, CD34 och CD14. Dessutom mesenkymala stamceller och konstitutivt producera inducerbart hematopoetiska och icke-hematopoetiska tillväxtfaktorer, interleukiner, och kemokiner, och i multipotenta mesenkymala prekursorceller uttryckte receptorer för vissa tillväxtfaktorer och cytokiner. Bland stromaceller grunderna i den mänskliga kroppen fann dormantnye eller vilande celler med immunofenotyp, nästan identisk med antigena profilen av rå 5-fluorouracil multi mesenkymala stamceller - dessa och andra celler uttrycker CD117, märkning "vuxna" stamceller.

Således har en cellmarkör som är unik för mesenkymala stamceller ännu inte fastställts. Det antas att vilande celler är obekräftade populationer av multipotenta mesenkymala prekursorceller eftersom de inte uttrycker cellmarkörer av besluten att artros (Cbfa-1) eller adipogenes (PPAR-y-2). Den långvariga exponeringen av långsamt prolifererande vilande celler till fetalt kalvserum leder till bildningen av terminalt differentierade prekursorer, kännetecknad av snabb tillväxt. Den klonala tillväxten av sådana stam mesenchymala celler stöds av FGF2. Det verkar som om de genom härrör stromal stamceller "stängd" tight nog har rapporterats om frånvaron av spontan differentiering i MSCs -. Utan särskilda villkor för att begå inte ens de omvandlas till celler mesenkymala serien.

Att studera befolkningsstrukturen mesenchymala stamceller söks differentiering markörproteiner på de stromala cellinjer och primära kulturer. I klonala kolonianalysBenmärgsCeller in vitro funnit att när de utsätts för primära kulturer av EGF ökar den genomsnittliga storleken på kolonierna och minskar klonal expression av alkaliskt fosfatas, under det att tillsats av hydrokortison aktiverar uttryck av alkaliskt fosfatas, som är en markör för osteogen differentiering av MSC: er orientering. Monoklonala antikroppar mot STRO-1 gjorde det möjligt att separera och studiepopulationerna av STRO-1-positiva vidhäftande celler i ett heterogent system Dexter kulturer. Det spektrum av cytokiner reglera både proliferation och differentiering av hematopoietiska och lymfoida celler, men också delta i bildandet, bildandet och nedbrytningen av benvävnad genom para-, auto- och endokrina mekanismer. Receptor-medierad frisättning av sekundära budbärare såsom cAMP, diacylglycerol, inositoltrifosfat, och Ca2 + används även för markör analys av olika kategorier av stromala vävnader hos celler som uttrycker de relevanta receptorerna. Användningen av monoklonala antikroppar som markörer rätt att upprätta stromala lymfoidorgan som hör retikulära celler för T- och B-beroende zoner.

Under en tid fortsatte vetenskapliga tvister kring frågan om möjligheten att MSC kommer från hematopoetisk stamcell. Faktum är att med explantation av suspensionen av benmärgsceller i monolagskulturer växer separata kolonier av fibroblaster i dem. Emellertid, har det visats att närvaron av prekursorer av fibroblast kolonier och diverse bakterier differentiering av hematopoetiska vävnad som en del av benmärgen inte är bevis på deras gemensamma ursprung av hematopoietiska stamceller. Med användning av diskriminantanalys av benmärgsstamceller funnit att mikromiljön vid heterotopisk transplantation, är hematopoietiska celler i benmärgen överförs, vilket bevisar förekomsten, i benmärgen oberoende av histogenetic MSC population av hematopoietiska celler.

Dessutom avslöjade selektiv kloningsmetod i monoskiktskulturer av stromala benmärgsceller av en ny kategori av prekursorceller för att bestämma deras antal, för att studera deras egenskaper, proliferativa och differentieringspotential. Det visade sig att in vitro fibroblastliknande stromala celler prolifererar och bildar diploida kolonier som när back transplantation in i kroppen säkerställer bildandet av nya blodbildande organ. Resultaten av studier av individuella kloner indikerar att det finns en population av celler i deras proliferativa och differentieringspotential som kan påstås rollen av stamceller av den stromala vävnaden, Gistogeneticheskaja oberoende av hematopoietiska stamceller i de stromala progenitorceller. Celler av denna population karakteriseras av självbärande tillväxt och differentierar till progenitorceller av ben, brosk och retikulär benmärgsvävnad.

Av stort intresse är resultaten av studier Chailakhyan R. Et al (1997-2001), som odlades benmärgshärledda stromal progenitorceller kaniner, marsvin och möss av a-MEM-odlingsmedium kompletterat med fetalt kalvserum. Författarna utförde explantationen med en initial densitet av 2-4 x 103 benmärgsceller per 1 cm2. Som matare användes homologa eller heterologa strålningsinaktiverade benmärgsceller i en dos som behöll matningsverkan men fullständigt blockerar deras proliferation. Tvåveckors primära diskreta kolonier av fibroblaster trypsiniserades för att producera monoklonala stammar. Bevis klonala ursprung kolonier erhölls med användning av kromosomala markörer i blandade odlingar av benmärg av manliga och kvinnliga marsvin, time-lapse skytte levande kulturer, såväl som i blandade kulturer av benmärg hos syngena möss och CBA SVAT6T6. Transplantation uppslamning av nyligen isolerade benmärgsceller odlade in vitro eller stromala fibroblaster under njurkapseln utfördes i ivalonovyh porösa stödstrukturer eller gelatin, samt inaktiverat kanin spongiöst benmatris. Trans kloner i benet locket lår marsvin renas från mjukvävnad och benhinna, skär epifysen och grundligt tvätta deras benmärg. Benet skars i fragment (3-5 mm), torkades och bestrålades i en dos av 60 Gy. I de beniga täckningarna placerades individuella fibroblastkolonier och implanterades intramuskulärt. För intraperitoneal transplantation av de stromala fibroblaster, odlas in vitro, använde vi typerna A diffusionskammaren (V = 0015 cm 3, h = 0, l mm) och D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

När man studerar dynamiken i tillväxten av klonala stammarna Chailakhyan R. Et al (2001) fann att de individuella cellerna, kolonibildande fibroblaster, såväl som deras avkomlingar har stor proliferativ potential. Vid 10: e passagen var antalet fibroblaster i vissa stammar 1,2-7,2 x 10 ⁹ celler. Under deras utveckling utvecklade de upp till 31-34 cellulära dupliceringar. Sålunda heterotopisk transplantation av benmärgshärledda stammar bildade av stromala prekursorer flera dussin kloner ledde till överföring av benmärgens mikromiljö och utbildning inom den nya zonen hematopoietiska organtransplantation. Författarna tog upp frågan om huruvida enskilda kloner kan tolerera benmärgsmikro stromaceller eller det kräver samarbete mellan flera olika klonogena stromal gångare? Och om enskilda kloner kan överföra mikromiljön, kommer det att vara komplett för alla tre bakterier, eller ger olika kloner en mikromiljö för olika hematopoetiska groddar? För att ta itu med dessa frågor har utvecklats teknik för odling stromala stamceller i kollagengelen som tillåter dig att skjuta från ytan av fibroblaster odlade kolonierna för efterföljande heterotopisk transplantation. Individuella kloner stromala fibroblaster, benmärgsceller odlade från CBA-möss och marsvin, skuren tillsammans med ett fragment av gelcoat och transplanteras heterotopisk - under njurkapseln hos syngena möss eller autologa muskel mage marsvin. Vid transplantation in i muskeln placerades kolonierna på gelén i benhöljet.

Vi har funnit att genom 50-90 dagar efter transplantation av benmärg fibroblast koloni i 20% av fallen observerades i transplantationsområdet utveckling av ben eller ben och hematopoetisk vävnad. I 5% av mottagande djur bildade fickor av ben som har en hålighet fylld med benmärg. Inuti ben cylindrar sådana foci har en rundad form och en kapsel konstruerad av benvävnad, med osteocyter och väl utvecklad osteoblastisk skiktet. Benmärgshålighet innehåller retikulära tyg med myeloida och erytroida celler, de proportioner som inte skiljer sig från det i normal benmärg. Njuren transplantatet var en typisk medullär kropp bildad av nativt benmärgstransplantation, där ben kapsel omfattar endast den medullära håligheten från den renala kapseln. Huvudvävnad inkluderade myeloida, erytroida och megakaryocytiska element. Sträckan i medullärhålan hade ett välutvecklat sinussystem och innehöll typiska fettceller. Samtidigt inom området transplantation av några kolonier ben med några tecken på blodbildningen konstaterades under njurkapseln. Studie av proliferativ och differentiering potensen för individuella kloner fortsatte monoklonala kaninbenmärg-stammar, cellerna återsuspenderas i odlingsmedium och i en separat ivalonovoy svamp som vägde 1-2 mg tucked under njurkapseln hos kaninen benmärgsdonator. Sådan autotransplantation utsattes för cellerna med 21 monoklonala stammar. Resultaten togs i beaktande om 2-3 månader. Författarna fann att 14% av de transplanterade benmärgs monoklonala stammar formad kropp som består av ben och benmärg hålighet fylld med hematopoietiska celler. I 33% av fallen bildade transplanterade stammar kompakt ben med olika storlek håligheter ostootsitami bricked i osteoblastisk och utvecklade skikt. I vissa fall, svampar transplanterade kloner utvecklade reticulum utan ben eller hematopoetiska celler. Ibland retikulär stroma bildning inträffade med ett väl utvecklat nätverk av sinuskurvor, men inte befolkade de hematopoetiska cellerna. Således var de erhållna resultaten liknar de som erhölls vid transplantationen av kloner på en kollagengel. Om emellertid kloner transplantation odlas på substratet resulterade i bildning av märg vävnad är 5% av benet - 15% och det retikulära tyg - i 80% av fallen, stammar transplantations monoklonala bildningen av benmärgsceller observerades i 14% av fallen av ben - i 53% och retikulär - i 53% av fallen. Enligt författarna, indikerar detta att de villkor för genomförandet av proliferativa och differentieringspotentialer av stromala fibroblaster när transplanterade på porösa ställningar var mer optimalt än med sina transplantat i ben och täcker kollagensubstrat. Det är inte uteslutet att användningen av mer avancerade metoder för odling och transplantation av kloner återkoppling kan förbättra förutsättningarna för genomförandet av dess kloner differentieringspotentialer och ändra dessa relationer. Ett eller annat sätt, men den huvudsakliga värdet av forskningen ligger i det faktum att en del av klonerna stromaceller med förmåga att bilda benvävnad samtidigt säkerställa stromal hematopoetisk mikromiljö omedelbart under tre groddar av benmärgsblod: erytroida, myeloida och megakaryocytiska, vilket skapar en tillräckligt stor fotstöd hematopoetisk vävnad och lite benmassa.

Vidare löste upphovsmännen problemet med förmågan för dessa typer av celldifferentiering av individuella klonala stromala progenitorceller under betingelser av ett slutet system av diffusionskammare. Dessutom var det nödvändigt att fastställa om individuella kloner av pluripotenta utställning eller visning för att differentiera potential krävs den kooperativa samverkan av flera kloner med en fast tecken cytodifferentiation, annorlunda förhållande av vilken bestämmer den preferentiella bildningen av ben, brosk eller retikulär. Genom att kombinera två metodologiska tillvägagångssätt - monoklonal isolerar stromala benmärgsursprungsceller och transplantera dem in diffusionskamrarna, Chailakhyan R. Et al (2001) erhållna resultat som tillåts närma sig förståelse av den strukturella organisationen av benmärgsstroma. Transplantations monoklonala stammar stromala stamceller till typ O-celler resulterade i bildningen av både ben och broskvävnad, vilket visar förmågan hos avkomman av en kolonibildande stromala celler samtidigt bildar ben och brosk. Antagandet att ben och broskvävnad härstammar från den gemensamma stromala progenitorcellen har upprepade gånger uttryckts upprepade gånger. Denna hypotes hade emellertid inte en korrekt experimentell bekräftelse. Bildandet av ben och brosk i diffusionskammare var ett nödvändigt bevis på förekomsten bland stamceller i benmärgsstromen av en gemensam prekursorcell för dessa två typer av vävnader.

Därefter 29 klonala stammar andra och tredje passagerna, primära kulturer härledda från benmärgen hos kaninen placerades i diffusionskammare och inplanteras intraperitonealt homologa djur. Studier har visat att 45% av monoklonala benmärgsmonster har osteogena förmågor. Undantagsvis innehöll den retikala vävnaden 9 kamrar, men tillsammans med ben- och broskvävnad var det närvarande i 13 fler kamrar, vilket stod för 76% av alla stammar. I kamrar av typ O, där differentiering var möjlig för både ben- och broskvävnad, studerades 16 stammar. I fyra kamrar (25%) bildades både ben- och broskvävnad. Det bör återigen noteras att de studier Chailakhyan R. Et al (2001) individuella progenitorceller gick cellstam bestående av från 31 till 34 fördubblingar och deras avkomma var 0,9-2,0 x 10 ⁹ celler. Antalet mitoser till vilka prekursorcellerna hos de polyklonala stammarna exponerades var praktiskt taget desamma som hos cellerna i de monoklonala stammarna. Samtidigt berodde utvecklingsgraden av polyklonala stammar, särskilt i den första fasen av deras bildning, avsevärt av antalet kolonier som användes för initiering av stammar. Diploida stammar av humana embryonala fibroblaster (WI-38) för 12-15 reklonirovanii th fördubblingsnivåer bildade också kolonier olika diameter och i sitt innehåll av celler. Stora kolonier innehållande mer än 103 celler var endast 5-10%. Med ökningen av antalet divisioner minskade andelen stora kolonier. De mono- och polyklonala benmärgs stromala fibroblastceller stammar bibehöll en diploid kromosom inställd efter 20 eller fler dubbleringar, och tendensen hos utveckling var jämförbar med dynamiken i diploida stammar embryonala fibroblaster. Analys av differentieringspotential av specifika benmärgs stromala progenitorceller, som utförs av transplantations monoklonala stammar i diffusionskammare, visade att halv av dem osteogena. Stora kolonier stod för 10% av deras totala antal. Följaktligen motsvarade antalet osteogena kolonidannande celler ungefär 5% av deras totala population. I den totala massan av osteogena progenitorceller identifierade av författarna fanns celler som kunde bilda ben och broskvävnad samtidigt. För första gången visar det sig att dessa två typer av vävnader i den vuxna organismen är den gemensamma föregångare cell: 25% av de testade kloner skapades av liknande celler och deras antal i den allmänna populationen av progenitorceller var inte mindre än 2,5%.

Således har heterotopisk transplantation av individuella kloner av benmärgsfibroblaster öppnat nya aspekter av den strukturella organisationen av populationen av mesenkymala stamceller. Hittats stromal progenitorceller som kan överföra specifik mikromiljö omedelbart för alla hematopoietiska stammen vilket nummer bland de undersökta klonerna större på olika modeller är från 5 till 15% (0,5-1,5% av det totala antalet progenitorceller detekterades). Tillsammans med klonerna, överföra fullständig benmärgsmikro finns progenitorceller, deterministiska endast benbildning, som bildas när den överförs till ett öppet system, ben som inte stöder utvecklingen av blodbildningen. Deras antal från det totala antalet stamceller är 1,5-3%. Vissa av dessa celler kan bilda benvävnad med en begränsad period av självunderhåll. Följaktligen är populationen av stromal progenitorceller heterogen i sin differentieringspotential. Bland dem finns en kategori cell, hävdar den roll som stromala stamceller med förmåga att differentiera till alla tre dimensioner är inneboende i benmärg stromal vävnad, som bildar ben, brosk och retikulär vävnad. Dessa data tillåter oss att hoppas att med hjälp av olika cellmarkörer kommer att vara möjligt att bestämma bidraget från varje typ av stromaceller i mikro av den specifika organisationen och stödja hematopoiesis i Dexter kulturer.

Funktioner av mesenkymala stamceller

Under senare år, fann det att i stationära kulturer av benmärgs mesenkymala multipotenta progenitorceller presenteras en begränsad population av små agranulära celler (RS-1-celler), som kännetecknas av låg kapacitet av kolonisering och frånvaro av Ki-67-antigenexpression specifik för prolifererande celler. Antigena parametrar dormantnyh RS-1-celler skiljer sig från det spektrum av begåtts antigener snabbt prolifererande stromal progenitorceller. Det visade sig att en hög hastighet av proliferation av engagerade progenitorceller observerades endast i närvaro av RS-1-celler. I sin tur ökar RS-1-celler tillväxten under påverkan av faktorer som utsöndras av de mest mogna derivaten av multipotenta mesenkymala progenitorceller. Det verkar som om RS-1-celler är en underklass av icke-obligatoriska MSC som kan återvinna. In vitro resistent mot 5-fluorouracil stromala stamceller i benmärgen som kännetecknas av en låg RNA-innehåll och höga nivåer av uttryck av ornitindekarboxylas gen - markör icke-prolifererande celler.

Intensiv reproduktion av stromala stamceller börjar efter fixering på substratet. När detta anges markörprofilen av dåligt differentierade celler: SH2 (TGF-receptor (3), SH3 (domän signalerings protein), kollagen typ I och III, fibronektin, adhesionsreceptor VCAM-1 (CD106) och ICAM (CD54), kadherin-11 , CD44, CD71 (transferrinreceptor), CD90, CD 120a och CD124, men utan uttryckning av karakteristiska markörer för hematopoetiska stamceller (CD34, CD14, CD45). Klonal tillväxt möjliggör upprepade gånger passe mesenkymala stamceller för framställning av en kultur av många genetiskt homogen stromal progenitor pluripotent celler. Cerea 2-3 passagen av deras antal når 50-300 miljoner kronor. I kulturen av tillräcklig densitet efter stoppa proliferationen av stromala stamceller, till skillnad från hematopoietiska vävnads fibroblaster differentierar till adipocyter, myocyter, broskceller och benvävnad. Kombinationen av de tre differentierings regulatoriska signaler innefattande en-metyl-izobutilksantin (inducerare av intracellulär cAMP-bildning), dexametason (en hämmare av fosfolipas a och C) och indometacin (en cyklooxygenas-inhibitor, tromboxan sänkande aktivitet och) vrider sig i adipocyter upp till 95% av progenitor mesenkymala celler. Adipocyt bildning från omogna stromaceller bekräftade expression av lipoprotein lipasgenen, histokemisk identifiering av apolipoproteiner och peroxysomal receptorer. Celler av samma klon påverkas av TGF-b i serumfritt medium skapar en homogen population av kondrocyt. Flerskiktscellkultur av brosk extracellulär matris kännetecknas utvecklade bestående av proteoglykan och kollagen typ II. Näringsmediet med 10% fetalt serum effekt differentieringssignaler komplex bestående av b-glycerofosfat (donator oorganiskt fosfat), askorbinsyra och dexametason, på samma kultur stromala progenitor progenitorceller leder till bildandet av cellaggregat. I sådana celler finns det en progressiv ökning i aktiviteten av alkaliskt fosfatas och osteopontin nivåer, vilket indikerar bildning av benmineralisering vilka celler bekräftade en progressiv ökning av intracellulärt kalcium.

Enligt vissa, att förmågan hos mesenkymala stamceller dela sig i oändlighet och reproduktion av olika typer av mesenkymala linjeceller i kombination med en hög grad av plasticitet. När de administreras i ventriklarna, eller vit materia mesenkymala stamceller migrerar in i parenkymet hos nervvävnaden och differentierar till neuronal eller glia härledd cellinje. Dessutom finns information om MSC transdifferentiering i hematopoetiska stamceller både in vitro och in vivo. En mer ingående analys i vissa studier bestäms exceptionellt hög duktilitet av MSC, som manifesteras i deras förmåga att differentiera till astrocyter, oligodendrocyter, nervceller, kardiomyocyter, glatta muskelceller och skelettmuskelceller. I ett antal studier transdifferentsirovochnogo potential MSCs in vitro och in vivo funnit att multipotenta mesenkymala prekursorceller av benmärgsursprung terminalt differentierar till cellinjer som bildar ben, brosk, muskel, nerv och fettvävnad, samt senor och stroman som stöder hematopoies .

Emellertid, i andra studier, inga tecken på restriktions pluripotens genomet av mesenkymala stamceller och kunde inte detekteras stromal progenitor cellpopulationer, men för att kontrollera möjliga pluripotenta stromala celler undersöktes mer än 200 MSC kloner isolerade från en primärkultur. Den stora majoriteten av in vitro-kloner bibehöll förmågan att differentiera till osteogena, kondrogena och adipogena riktningar. När exklusive sannolikheten för migrering av de mottagande cellerna genom transplantation av mesenkymala stamceller under njurkapseln eller i diffusionskammare Det visade sig att stromala progenitorceller in situ behålla heterogena fenotyp, vilket indikerar antingen frånvaro av en zon transplanterade restriktionsfaktorer eller frånvaron av pluripotenta MSCs ensam. Samtidigt tillät existensen av en sällsynt typ av somatiska pluripotenta stamceller, som är gemensamma prekursorer av vuxna stamceller.

På multi-, men inte sant pluripotenta mesenkymala stamceller utgör en mycket liten fraktion av benmärgsceller och har förmåga, under vissa omständigheter, när de odlas in vitro för att proliferera utan att komma i differentiering, vilket bevisas av deras inducerade härstamning engagemang av celler i ben, brosk, fett, muskelvävnad , liksom i tenocyterna och stromalelementen som stöder hematopoiesis. Typiskt, kontinuerlig exponering i odlingsmedium med fetalt kalvserum framkallar utgångs MSCs i stromal av engagerade stamfaderceller, avkomman av som undergår spontan slutlig differentiering. In vitro möjligt att uppnå riktnings osteoblast formation genom tillsats till mediet konditione dexametason, beta-glycerofosfat och askorbinsyra, medan kombinationen av differentiering signalerar dexametason och insulin inducerar bildningen av adipocyter.

Fastställt att före inträdet i stadiet av terminal differentiering av benmärg-MSC: er för att skapa vissa odlingsbetingelser initialt differentiera till fibroblastliknande mesenkymala stamceller. Derivat av dessa celler in vivo är inblandade i bildningen av ben, brosk, senor, fett och muskelvävnad samt stromal stöd hematopoies. Många författare förstå termen "multi mesenkymala stamceller" som faktiskt MSCs och engagerade stromal stamceller och benmärg mesenkymala vävnader. Klonal analys av mesenkymala multi progenitorceller av benmärgen ursprung visade att drygt en tredjedel av klonerna differentierade i osteo-, hondro- och adipocyter, medan andra kloner celler har osteogen potential och en form endast hondro- och osteocyter. Denna klon av multi mesenkymala prekursorceller som lUD-9, under lämpliga förhållanden mikromiljö differentieras till celler med en fenotyp och funktionella egenskaper inte bara av osteoblaster, kondrocyter och adic potsitov men stromaceller som stödjer hematopoiesis. Isolerats från fetala råttbenmärgsceller klona RCJ3.1 differentierade mesenkymala celler av olika fenotyper. Genom den kombinerade verkan av askorbinsyra, b-glycerofosfat, och dexametason från cellulära element av denna klon först bildas multinukleära myocyter och sedan, successivt, adipocyter, kondrocyter och skär mineraliserat ben. Populationen av granulära celler från benhinna av råttfoster motsvarar obekräftade multi mesenkymala progenitorceller, såsom kännetecknas av en låg grad av proliferation, uttrycker inte markörer för differentiering, och differentieras i odlingsbetingelser för att bilda hondro-, osteo- och adipocyter och glatta muskelceller.

Därför bör det erkännas att frågan om plyuri- eller multipotens genomet hos mesenkymala stamceller är fortfarande öppen, vilket följaktligen påverkar presentationen av differentiering potential stromala stamceller, som också är inte helt installerad.

Experimentellt bevisade och viktig egenskap hos mesenkymala stamceller är deras förmåga att lämna vävnads nisch och cirkulerar i den allmänna cirkulationen. För att aktivera det genetiska programmet för differentiering bör sådana cirkulerande stamceller falla i lämplig mikromiljö. Det visas att när den administreras systemiskt till blodomloppet MSCs mottagardjuren omogna celler som implanterats i olika organ och vävnader, sedan differentieras till blodceller, myocyter, adipocyter, kondrocyter och fibroblaster. Följaktligen, i de lokala vävnadsområden uppträder Signal reglerande interaktionen av bekräftade och obekräftade stromala stamceller, såväl som mellan dem och de omgivande mogna celler. Det antas att den differentieringsinduktion utföres parakrina regulatoriska faktorer av mesenkymalt ursprung och nemezenhimalnogo (tillväxtfaktorer, eikosanoider, extracellulära matris molekyler) som tillhandahåller de rumsliga och tidsmässiga relationer i mikromiljön av multi mesenkymala stamceller. Därför bör lokala skador av mesenkymal vävnad leder till bildningen av en mikromiljö zoner multipotenta mesenkymala prekursorceller skiljer kvalitativt från de komplexa regulatoriska signaler intakta vävnader i vilka fysiologiska processer inträffar i stället för reparativt regenerering. Denna skillnad är extremt viktig när det gäller specialisering av cellfenotypen i en normal och skadainducerad mikromiljö.

Enligt idéerna är det här att mekanismerna för den grundläggande skillnaden i två kända processer - fysiologisk regenerering och inflammatorisk proliferation - läggs. Den första av dem är avslutad genom reduktion av specialiserad cell vävnadssammansättning och dess funktion, medan resultatet av en proliferativ process är bildandet av mogna bindvävsceller och förlusten av det skadade vävnadsområdet funktion. Således, för att utveckla optimala applikationsprogram multi mesenkymala stamceller inom regenerativ medicin och plast kräver noggrann undersökning av egenheter av mikropåverkansfaktorer på differentieringen av MSCs.

Beroendet av strukturen utrymmet av stamceller från cell para- och autokrina regulatorer vars uttryck moduleras av externa signaler, ingen har bortom allt tvivel. Bland de viktigaste funktionerna av regulatoriska faktorer är kontroll MSCs asymmetrisk uppdelning och uttryck av gener som bestämmer steg härstamning engagemang och antalet celldelningar. Externa signaler, som den vidare utvecklingen av MSC beror på, tillhandahålls av deras mikromiljö. I omogna MSCs att föröka sig tillräckligt lång tid, under bibehållande av förmågan att differentiera till adipocyter linje, myofibroblaster, hematogen stromal vävnad, broskceller, och ben. Man har funnit att en begränsad population av cirkulerande SB34-negativa stromal cellelement från den allmänna cirkulationen återförs till benmärgsstroma vävnad, omvandlas till en linje där CD34-positiva hematopoietiska stamceller. Dessa observationer tyder på att cirkulations stamceller mesenkymala celler i blodet av vävnad ger stöd för återstoden av stromala stamceller i olika organ genom att mobilisera gemensam pool av omogna benmärgsstromaceller. Differentiering av MSC: er in i celler med multipla mesenkymala fenotyper och deras deltagande i reparation eller regenerering av ben, brosk, senor och fettvävnad in vivo demonstreras genom adoptiv överföringsmodeller i försöksdjur. Enligt andra författare, är avlägsen migration av MSCs kärlbädd i kombination med en lokal förskjutning eller korotkodistantnym multipotenta mesenkymala prekursorceller inuti vävnaden vid reparationen brosk, muskel regenerering, och andra reduktionsreaktioner.

Lokala reserver stem stromal vävnad stiftelser spelar en roll källa av celler i ett fysiologiskt vävnadsregenereringsprocesser och fylls av avlägsna transport MSCs som utgifterna stromala vävnad stamceller resurser. Emellertid, i behov av akut mobilisering av cellulärt reparativa kapacitet, såsom multipel trauma, i de reparativa processer av regenere deltar MSCs hela tåget, och periferin genom blodomloppet rekryterade mesenkymala prekursorceller av benmärg.

Transplantation av mesenkymala stamceller

Det finns vissa paralleller mellan processerna för fysiologisk regenerering av vävnader och deras bildning under perioden av intrauterin utveckling. Den embryogenes hos människor och däggdjur, bildandet av olika typer av specialiserade celler härledda från ecto, meso- och endodermalt groddar skikten pool, men med den obligatoriska medverkan av mesenkymet. Den lösa cellnätet fetal mesenkymal vävnad utför många reglerande, metabolisk, skelett och morfogenetiska funktioner. Bookmark provisorisk kroppar genomförs först efter kondense mesenkymet på bekostnad av tillväxt klonogena progenitorceller som genererar primära morfogenetiska signaler organogenesen. Stromal härrör embryonala mesenkym skapa ställnings provisorisk kroppar och ligga till grund för framtida energoplasticheskogo säkerställa på grund av ökningen av den primära vaskulära och lymfkärl. Med andra ord, de stromala elementen i mikrocirkulatoriska enhets fetala organ utvecklas innan bildandet av de strukturella och funktionella enheter. Dessutom aktiv migration av mesenkymala celler under organogenes ger rymdorientering utveckla organ på grund märkning deras gränser i volym Restriktions homeotiska Hox-tepov. På det stromala skelettet sker och montering av strukturella och funktionella enheter av parenkymala organ, som ofta inkluderar morphogenetically och funktionellt mycket olika celler. Följaktligen, i embryogenes mesenkym är primära funktion och genomförs genom generering av regulatoriska signaler aktiverande regionala progenitor proliferation och differentiering av epitelceller. Embryonala mesenkymceller producerar tillväxtfaktorer såsom FOT, HGF-b, CSF, för vilka det finns motsvarande receptorer på parenkymal progenitorceller. De mogna differentierade vävnader hos den vuxna organismen stromal cellnätet alstrar också signaler för att bibehålla livsdugligheten och proliferation av progenitorceller nemezenhimalnogo ursprung. Emellertid de spektrum stromala regulatoriska signaler i postnatal ontogenesen andra (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) och syftar till att ge fysiologisk regenerering eller reparation av skadade vävnadszoner. Vidare är de spektrala egenskaperna hos stromalreglerande faktorer i varje slags vävnad och även inom samma organ olika. I synnerhet, hematopoes och lymfopoies till förökning och differentiering av hematopoetiska och immunkompetenta celler förekommer endast i vissa organ, inom vilken verkar stromal mikromiljö som ger förutsättningar för mognaden av hematopoietiska och lymfoida celler. Det är upp till regulatoriska faktorer mikro beror på förmågan hos hematopoetiska och lymfoida celler att återbefolka kroppen att föröka sig och mogna till dess mikro nischer.

Bland komponenterna i den extracellulära matrisen, som producerar multipotenta mesenkymala prekursorceller, bör det noteras fibronektin, laminin, kollagen och proteoglykaner, liksom CD44 (hyaluronan och osteopontin receptorn) som tar emot huvuddelen i organisationen av den intercellulära växelverkan och bildandet av extracellulär matrix i benmärgen och ben . Det är bevisat att benmärgs mesenkymala, multipotenta celler skapar redshestvenniki stromal mikro ger de induktiva och regulatoriska signalerna inte bara MSC, men även hematopoetiska prekursorer och nemezenhimalnye benmärgsstamceller. Det är känt att MSC: er som är involverade i hematopoies mäts genom deras förmåga att differentiera till stromala celler som stödjer hematopoes, varvid den aktiva vägledning MSK-signalen som erhållits direkt från hematopoietiska stamceller. Det är anledningen till att nät- stromal stamceller är grunden för utfodring av alla kloner av hematopoetiska celler.

I en mogen organism intensitet av hemodialys och lymfopoies i ett tillstånd av dynamisk jämvikt med den "utgifter" av mogna blodkroppar och immunsystemceller i periferin. Eftersom benmärgsstromaceller och lymfoida organ sällan uppdateras inte betydande omstrukturering stromala strukturer inte förekomma i dem. Föra systemet för dynamisk jämvikt är möjlig med hjälp av mekanisk skada på några organ Hemo eller lymfopoies, vilket leder till samma typ av sekventiella förändringar som påverkar inte bara och inte så mycket av hematopoietiska eller lymfoida celler, såsom stromala strukturer skadade organ. I processen för reparativa regenere primärt bildade stromal ram, som sedan återinplantering hematopoetiska eller immunceller. Denna lång känt faktum gör posttraumatisk regenere bekväm modell för att studera den stromala mikromiljön av blodbildande organ. I synnerhet, för undersökning av reparativa regenerering av benmärg används mekanisk tömning märghålan av långa ben - skrapning, vilket tillåter att föra snabbt och effektivt den hematopoietiska vävnaden från ett tillstånd av dynamisk jämvikt. När man studerar processen för reparativa regenerering av hematopoetiska och stromala benmärgs komponenter efter mekanisk tömning av medullär kavitet av skenbenet marsvin fann att mellan indikatorer regenerering av hematopoetiska och stromala celler (antalet hematopoietiska celler, koncentrationen och mängden av stromal progenitorceller) det inte finns någon direkt korrelation. Dessutom visade det sig att ökningen i populationen av stromala stamceller inträffar vid en tidigare tidpunkt efter skrapning, och själva stromala fibroblaster är fosfatazopolozhitelnymi, som är karakteristisk för osteogen vävnad. Det konstaterades också att skrapnings 3-5 långa ben leder till tillväxten av cellpopulationen i benmärgen och icke-operatör ben även i mjälten, som i marsvin är bara lymphopoietic kropp.

Morfologiska bilden reparativa processer i benmärgen kyuretirovannyh tibia marsvin motsvarar generellt litteraturdata erhållna i experiment på djur av andra arter, är samma dynamik förändringar som äger rum efter avlägsnande av den hematopoietiska vävnaden för alla arter och skillnaden endast avser de tidsparametrar . Morfologiskt fas proceduren för återställning hematopoies i märghålan töms i successiva processer organiseringsblodproppsbildning grova fibrer ben, dess resorption, av sinuskurvor och retikulär bildning stroma, vilket ytterligare återinplantering hematopoetiska element. Antalet hematopoetiska progenitorceller i benmärg vävnadsregenerering processen ökar i parallell ökning i innehållet av hematopoietiska stamceller.

Gerasimov Yu et al (2001) jämförde förändringarna i antalet hematopoietiska celler och mängden av stromala cellföregångare i de enskilda faserna av regenereringsprocessen. Det konstaterades att kvantitativa förändringar i benmärgsceller i ben kyuretirovannoy matchar dynamik morfologiska regenereringsegenskaper. Minskning under de första tre dagarna av cellinnehållet i regenererar författare tillskriver förlusten av hematopoetiska celler på grund av de negativa effekterna av mikromiljön, vilket skapar retikulär vävnad växer i den återstående benmärg i epifysen och i det senare för att bilda foci osteoid och kärlskada med skrapning. 7-12: e dag höja yaderosoderzhaschih celler sammanfaller med utseendet på den individuella foci i myeloida hematopoetiska stromala celler spridningszoner. På den 20: e dagen det finns betydande delar av den regenererade benmärgen och väl utvecklade bihålor, vilket åtföljs av en betydande ökning av totala cellantalet. Antalet hematopoetiska element i denna period är dock 68% av kontrollnivån. Detta överensstämmer med tidigare publicerade data som visar att antalet blodbildande celler efter skrapning når standarder endast 35-40 dagar efter operationen.

I den tidiga posttraumatiska perioden är den huvudsakliga cellkällan för restaurering av hemopoiesis de cellulära elementen bevarade i curettagen. I senare termer är huvudkällan för regenerering av benmärgshomatopoetisk vävnad stamceller som repopulerar de fria stromalzonen. När det gäller vissa kategorier av stromaceller (endotelceller, retikulära och osteogena), källorna för sin utbildning i omstruktureringen av märghålan, fortfarande oklara. Resultaten av Yu.V. Gerasimova et al (2001) visar att i den återstående märgben efter skrapning cellkoncentration av kolonibildande fibroblaster signifikant högre än i normal benmärg. Författarna menar att med skrapning är mer intensiv selektiv eluering av hematopoietiska celler jämfört med stromal kolonibildande celler som är involverade i bildningen av stroma och mer fast förbundna med dess basisk substans än hematopoietiska celler.

Dynamiken i förändringarna i antalet celler som bildar kolonier fibroblaster korrelerar med intensiteten av osteogenes processer efterföljande trabekulärt benresorption och bildning retikulära stroma som befolkar hematopoietiska celler. De flesta stromala progenitorcellerna bildar en grovfibrer benvävnad och en retikulär stroma vid de angivna regenereringstiderna. För frakturer i lårbenet i villkoren för förlängd osteosyntes på 5: e dagen i regenereringszonen ökar koncentrationen av celler och antalet kolonibildande fibroblaster, och benbildning i intensiv deras antal ökas med 6 gånger. Det är känt att benmärgsceller som bildar fibroblastkolonier har osteogena egenskaper. Antal stromal progenitorceller ökar innan lösa territorium kyuretirovannogo benmärg hematopoetiska celler. Detta är i god överenskommelse med bevisen att stromceller ger bildandet av en hematopoetisk mikromiljö. Uppenbarligen, skapandet av hematopoetiska mikromiljön motsvarar en viss nivå av regenerering av stromal vävnad, och ökar antalet hematopoetiska celler vid expansion stromal brohuvud lämplig för hematopoies.

Av största intresse är författarna till data som omedelbart efter skrapning ökar antalet stromala cellprekursorer i avlägsna delar av skelettet. Med början från den sjätte timmen, och av den tjugonde dagen inklusive den kontra tibia observeras i mer än tvåfaldig ökning i de koncentrationer och antalet celler som bildar kolonier av fibroblaster. Mekanismen för detta fenomen är förmodligen samman med det faktum att en massiv benmärgsskada resulterande i bildandet av ett stort antal blodproppar och samtidigt förstöra ett stort antal blodplättar och frisättningen in i blodplättshärledda tillväxtfaktor (RBSK), som är känd för att orsaka proliferation av celler som bildar kolonier fibroblaster belägna i kroppen utanför den proliferativa poolen. I försök på kaniner lokal administrering MSCs främjar återställande av kirurgiskt skadat brosk i knäet, vilket kan vara associerat med bildningen av kondrocyter härledda från MSCs introduceras. Emellertid reparativa regenerering av bendefekter i laboratorieråttor förbättras avsevärt vid användning av mesenkymala stamceller inneslutna i en keramisk ram. Därför kan vi anta att om du inte RBOK, då någon annan faktor, som härrör från de skadade stromaceller har en avlägsen stimulerande effekt på spridningen av mesenkymala stamceller i intakta områden av benmärgen och stimulerar deras migration in i området för defekten benmärgsvävnad. I sin tur detta i motsats till litteraturdata från tidigare år, vilket indikerar att stromaceller är ansvariga för mikro, till skillnad från hematopoetiska celler inte kan migrera och komma från lokala källor.

Icke desto mindre, resultaten av studien Gerasimov Yu et al (2001) tyder på att tillämpningen av mekaniskt trauma orsakar inte bara en kraftig omstrukturering av stromal vävnad i kyuretirovannoy ben, men också betydande förändringar i stroma avlägsna ben intakt, det vill säga, det finns ett systemiskt svar stromavävnad för lokal trauma. Och när den tillämpas polytrauma - flera skrapning - denna reaktion förstärks och observeras inte bara i den opererade benet och avlägsna delar av skelettet, men även i lymfoida organ, särskilt mjälten. Mekanismen av ett sådant system svar hos den stromala vävnaden i benmärgen och mjälten och den lokala trauma polytrauma förblir okänd. Det antas att denna process är förknippad med verkan av humoral faktor frisätts mesenkymala stroma medullär benmärgshålighet. Möjligheten att göra benmärgsstromaceller och mjälte organonespetsificheskogo humoral faktor som ansvarar för cellproliferation, kolonibildande fibroblaster indikerar uppgifter om deras kolonistimulerande aktivitet i monoskiktsodlingar av benmärg.

I detta avseende är det värt att notera att när de administreras systemmultipotenta mesenkymala prekursorceller återinplantering deras derivat inte bara benmärgs, men även andra vävnader, som används, i synnerhet för genterapi. Det visas att efter intravenös administrering av stora mängder av MSCs med genomet av vildtyp möss med mutant kollagen-gen I donatorceller ersätta upp till 30% av cellerna i ben- och broskvävnad hos mottagaren, och de transfekterade mesenkymala stam musceller som utsöndrar IL-3 mänsklig, under 9 månader effektivt stödja hematopoies i händelse av deras samtidiga administrering med humana hematopoietiska stamceller till möss med immunbrist.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Genetisk modifiering av mesenkymala stamceller

Ytterligare experimentella framgången för den genetiska modifieringen bör noteras MSCs transfektion Faktor IX-genen i humana MSC: er, följt av överföring av celltransfektanter möss med immunbrist, vilket leder till uppkomsten i blod antihemofilifaktor B över 8 veckor efter transplantation. I detta experiment utfördes posttranslationell modifiering av faktor IX med y-glutamylkarboxylas i transfekterade celler. Transduktion av MSC med en retroviral vektor som kodar human faktor IX, har varit mindre framgångsrik - efterföljande införande av dessa celler med hemofili hund i en terapeutisk nivå av faktor IX, som stöder normal intensitet koagulering hemostas, endast 12 dagar.

Transplantation av mesenkymala stamceller i hjärnparenkymen hos djur har visat att donatoromogna celler transformeras både i populationen av neuroner och glia. Engraftment neuronala derivat frisk donator mesenkymala vävnaden teoretiskt möjliggör korrigering av genetiska avvikelser i hjärnans metabolism hos patienter med Gauchers sjukdom och andra störningar i lipidmetabolismen, kolhydrat eller gangliosider.

Fortsatta experimentella sökvillkor transdifferentiering av stamceller i benmärgs stromala prekursorceller i nervvävnad och lever. Forskarnas uppmärksamhet är inriktad på kombinationer av differentieringsinduktorer och speciella konditioneringsmedier. I synnerhet, för att isolera den primära kultur med 10% fetalt kalvserum, benmärg stromala cellerna tvättades och resuspenderades i DMEM / F12-odlingsmedium (1/1) ympas vid en densitet av 200 tusen / cm2. Efter 24 timmar, är icke-adherenta celler avlägsnas och fästas till plast fibroblastceller odlas i en vecka. För differentiering av stromala benmärgsceller till neuroblaster användes konditionerat medium som erhållits genom odling av tre dagars odling av primär mus embryonala fibroblaster, liksom bland DMEM / F12 (1/1) med 2% fetalt kalvserum och kompletterat med 20 ng / ml eller 10-6 M LiF retinoinsyra (neyroinduktory vilka matas till den neurala differentieringen av mus embryonala stamceller och human). Differentieringen av stromala benmärgsceller till stamceller till hepatocyter inducerades konditionerad miljö skapas som ett resultat av tre dagars odling av en primär kultur av embryonala musleverceller i DMEM / F12 (1/1) medium supplementerat med 10% fetalt kalvserum.

Här bör det noteras igen att de kolonbildande cellerna i benmärgsstroma är heteromorfa och kan delas in i två typer. Den första typen innefattar fibroblastliknande celler som bildar filopodia celler med stora kärnor och en eller två nukleoler. Den andra typen representeras av små celler med en spindelformad form. I båda typerna av cellkultur i det konditionerade mediet som erhölls på ett matarlager av primärt mus embryonala fibroblaster, och på den Z-4-e dagen i odlingsceller förefaller Liknar neuroblaster. På detta stadium har de ofta en spindelformad form med en eller två långa processer som slutar med filopodier. Pyramidala eller stellatceller med korta dendriter är mindre vanliga. Dendriter en neuroblaster har typisk expansion (njure tillväxt) och förgrening i dess distala del, den andra - med en distinkt tillväxtkoner filopodia, genom vilken dendrittillväxt inträffar. Liknande morfologiska egenskaper (njure tillväxtkoner och filopodia a) inneboende neuroblastom, differentierar till neuroner, beskrivs i detalj i artiklar av neurogenes. På grundval av detta grundar vissa författare att cellerna de upptäcker i kultur är neuroblaster. I synnerhet, Schegelskaya E. Et al (2002), efter en primär kultur av stromala celler odlade under två veckor i en utbytbar vid varje Z-och-4: e dagen konditionerat medium fann att en del av de prolifererande celler, behålla odifferentierat tillstånd. Utåt såg sådana celler ut som fibroblaster och identifierades i kultur tillsammans med differentierande neuroblaster. De flesta cellerna (cirka 80%) var i olika steg av differentiering i celler i nervvävnaden, huvudsakligen i neuroner. De dendritiska processer av dessa celler i nära kontakt med varandra, så att gradvis celler bildas på substratpartierna neurala nätverk i form av långa strängar flercelliga. Dendritiska processer av neuroblaster växte mycket längre, några av dem 8-10 gånger högre än själva kroppens längd. Gradvis ökade andelen pyramidala och stellatceller. Dendriter av stellatceller grenade. Enligt författarna, senare differentiering av pyramidala och stellatceller jämfört med spindly motsvarar sekvensen av de normala stadierna av neurogenes hos djur. Som ett resultat, författarna menar att stamcellema enligt benmärgsstromaceller exponeras inducerad neurogenes i vilket förfarande in vitro genererade neuroblaster från alla tre större typer av neuroner. Prekursorer av neurala celler hittades också i kulturen av benmärgsstromaceller i 3-4 dagar i medium med 2% fetalt serum och 20 ng / ml LIF. Men i detta fall har de stamceller delas mycket långsamt, differentiering av neuroblaster förekommer endast i 30% av fallen, och att de inte bildar de neuronala nätverk. Användning som en nervcelldifferentiering inducerare retinsyra, författarna erhållna i kultur till 25-30% av nervcellerna med en dominans av gliaceller - astrocyter och oligodendrocyter. Nervceller var bara en tredjedel av alla nervceller, trots att de presenterades alla tre typer: fusiforma, pyramidala och stellate celler. På den 6: e dagen av odling av stromala celler i retinsyra medel nervceller blev mer differentierade, medan enskilda axoner av pyramidala neuroner fann att i den normala neuroontogenesis visas senare bildningen av de dendritiska processerna. Enligt författarna, trots det låga utbytet av nervceller, har metoden att inducera retinsyra fördelar: astrocyter och oligodendrocyter och myeliniserande driva matningsfunktioner under tillväxten av axoner och dendriter och är nödvändiga för normal nervvävnadsbildning. Därför är det bättre att använda en suspension av neuroner berikade med glialceller för att reparera sina skadade platser in vivo.

I den andra serien av experiment, författarna försökte att inducera differentiering av stromala benmärgsceller i levercellerna. Efter tre dagars odling av benmärgs stromala stamceller i det konditionerade mediet som erhölls genom att inkubera musembryonala hepatocyter, har stora, sfäriska formade celler visat, ofta två-nukleära, cytoplasmiska inklusioner med olika storlekar. Dessa celler var i olika stadier av differentiering, och skilde sig i storlek, antalet kärnor och cytoplasma inneslutningar. I de flesta av dessa celler påvisades glykogen, där vi har identifierat dem som hepatocyte prekursorceller. Eftersom odlingen inga celler detekterades Liknar neuroblaster, följt av en slutsats att i det konditionerade mediet som erhölls genom odling av embryonala hepatocyter, det finns inga faktorer för differentiering av nervceller och, omvänt, det finns faktorer som inducerar differentiering av stromala benmärgsceller till progenitorceller av hepatocyter . Författarna föreslår närvaron av pluripotenta celler från benmärg stroma, eftersom de differentiera in vitro till celler av lever- eller nervvävnad beroende på rade specifika medier, och induktorer.

I vissa arbeten visas differentieringen av benmärgstromaceller i kardiomyocyter, brosk, ben och neurala vävnadsceller korrekt. Det finns information som bland cellerna i benmärgen finns populationer av stamceller som kan skilja sig åt i hepatocyter. I ljuset av dessa resultat över experiment på möss fortfarande kan betraktas som en bekräftelse på närvaron i benmärgs pluripotenta mesenkymala stamceller med förmåga att differentiera till celler av olika vävnader hos den vuxna organismen.

Transplantation av mesenkymala stamceller

I klinisk transplantation av humana mesenkymala stamceller kan användas för expansion av hematopoetiska stamceller och deras tidiga ättlingar prekommitirovannyh. I synnerhet,-snabbar högt upp återhämtning i neutrofiler och trombocyter i perifert blod införandet av autologa hematopoietiska stamceller och patienter MSCs cancerpatienter efter kemoterapi genom. Autologa och allogen transplantation av mesenkymala stamceller används för att behandla multipelt myelom, aplastisk anemi, spontan trombocytopeni - sjukdomar associerade med primära defekten hematopoietisk stromal vävnad. Effektiviteten för cellterapi i hematologiska patologier i många fall över, medan införandet av stromala och hematopoietiska stamceller, som manifesterade en minskning av den postoperativa återhämtningsperioden, blod, minskning av antalet dödsfall på grund av icke-selektiva förstörelse regionala och cirkulerande cancerceller i vilka dynan och dess egen progenitor hematopoetiska patientceller. MSCs lovande applikationer och andra multipotenta mesenkymala prekursorceller i klinisk praxis på grund av deras relativa lätthet att erhålla benmärgsaspirat, expansion i kultur och transfektion av den terapeutiska genen. Sålunda för att kompensera för lokala vävnadsdefekter kan använda en lokal implantering av multi mesenkymala prekursorceller och i systemisk dysfunktion av vävnader av mesenkymalt ursprung är inte uteslutet deras införande i den allmänna cirkulationen.

Mer försiktiga i sina argument författarnas av verk i vilka perspektiv MSCs för lokal, systemisk transplantation och genterapi analyseras ur synvinkel av biologi stromaceller. Postnatal benmärg är traditionellt betraktas som ett organ som består av två huvudsakliga system för distinkta cellinjer - faktiskt hematopoetisk vävnad och dess tillhörande stöd stroma. Därför, benmärgs mesenkymala stamceller betraktas ursprungligen endast som en källa för stromal grunden för produktion av regulatoriska faktorer hematopoetisk mikromiljö. Därefter bytte forskarnas uppmärksamhet åt att studera MSC: s roll som stamkälla av skelettvävnader. Senaste data indikerar den oväntade potentialen av differentiering av stromala benmärgsceller för att bilda neural eller muskelvävnad. Med andra ord, de mesenkymala stamceller uppvisar transgermalnuyu plasticitet - förmågan att differentiera till celltyper som fenotypiskt icke-ursprungliga vävnadsceller. Men vissa aspekter av biologi benmärgsstromaceller fortfarande oklara och olösta i allmänhet biologisk plan och i detalj, inklusive identifiering, natur, ursprung och utveckling och funktion in vivo benmärgs stromaceller samt den tillåtna potential differentiering ex vivo och möjligheten terapeutisk användning in vivo. Data på de potentiella möjligheterna för MSCs, liksom resultaten av studier av andra regenerativ potential av stamceller, i skarp kontrast med den etablerade dogma i biologi.

När odlas i låga densitet stromala benmärgsstamceller bilda distinkta kolonier, vilka var och en är ett derivat av en av prekursorceller. Den procentuella andelen av stromal cellprekursorer i benmärgskärnförsedda celler som definieras av deras förmåga att bilda kolonier beror mycket på odlingsbetingelserna och de arter av MSCs som hör. Till exempel, i gnagare för att erhålla den maximala mängden av stromala progenitorceller är absolut nödvändigt, i närvaro av bestrålade matar kultur av benmärgsceller och serum, medan den kolonibildande effektiviteten av humana mesenkymala stamceller är oberoende av mataren, eller från odlingsmediet. Antalet kända mitogena faktorer som stimulerar proliferationen av stromala progenitorceller är begränsade. Dessa innefattar PDGF, EGF, FGF, TGF-b och även IGFl. Under optimala förhållanden, odling av MSC: er polyklonala linjer som upprätthålls in vitro under mer än 50 celldelningar, som gör det möjligt att ta emot de miljarder benmärgsstromaceller från 1 ml av aspirat det.

Emellertid, är populationen av benmärgsstromaceller heterogena, som visar sig som variabiliteten i de storlekar av kolonierna, annan hastighet av deras bildning och en mängd cellmorfologi, som omfattar en rad fibroblast-liknande spindeln till stora platta celler. Med utvecklingen av sådana grödor efter 20 dagar noteras fenotypisk heterogenitet också. Del av kolonin kännetecknas av högt uttryck av alkaliskt fosfatas, andra inte uttrycka det, och den tredje typen kolonierna är fosfatazopozitivnymi i den centrala regionen och fosfatazonegativnymi på periferin. Separata kolonier bildar noduler av benvävnad (början av matrismineraliseringen markeras när den färgas med alizarinröd eller på kalcium av Van-Koss). I andra kolonier sker fettackumulering, identifierad genom G-färgning med oljedröd. Mindre ofta bildar kolonierna i de mesenkymala stamcellerna brosk som är färgade med alcyanblå).

Efter ektopisk transplantation i försöksdjur polyklonala MGK linjer bildar ektopiskt ben stroma med setchatoobraznoy associerad med myelopoes och adipocyter, liksom, men sällan, med broskvävnad. I monoklonal linjer transplantation av benmärgsstromaceller i vissa fall där chimerism, varvid de novo bildade benvävnaden består av benceller, adipocyter innefattar stroma och donatorursprung, medan cellinjer av hematopoetiskt och kärlsystemet är härledda från mottagaren.

Resultaten av dessa studier bekräftar stamnaturen hos stromalbenmärgsprekursorn, från vilken klonlinjen erhölls. De visar också samtidigt att inte alla kloning i odlingsceller är faktiskt multipotenta stamceller. Vissa forskare tror, och vi delar deras åsikt, att den mest exakta information om den verkliga potentialen för differentiering av enskilda kloner endast kan uppnås in vivo efter transplantation, snarare än genom att bestämma fenotypen av deras derivat in vitro. Expression i osteo- kultur fenotypiska markörer hondro- eller adipogenes (bestämt genom mRNA eller via histokemiska tekniker), och även produktion av mineraliserad matrisen inte återspegla graden av pluripotens enda klon in vivo. Därför kommer identifieringen av stamceller i stromala celler grupp endast är tillgängliga i efterhand, under lämpliga förhållanden transplantation biologiskt prov. I synnerhet, kondrogenes mycket sällan observerats i transplantations öppna system, medan bildandet av brosk är inte ovanligt i slutna system, såsom diffusionskammare eller i mikromassnyh kulturer av stromala celler in vitro, varvid uppnås lokalt låg syrespänning, bidrar till bildningen av brosk. Därför, även transplantationsteknik, såväl som icke-specifik in vitro odlingsbetingelser påtagligt påverka intervallet av differentiering av MSC: er.

Experimentell transplantation med iakttagande av givna försöksbetingelser är den gyllene standarden för bestämning av potentialen för differentiering av benmärgsstromceller och huvudelementet i deras korrekta identifiering. Historiskt är benmärgsströmma benmärgstransplantationsstudier associerade med ett vanligt benmärgstransplantationsproblem. Det fastställdes att hemopoietisk mikromiljö skapas genom transplantation av benmärgsstromceller och ger ektopisk utveckling av hemopoietisk vävnad i transplantationszonen. Microenvironmentens ursprung från donatorn och hematopoetisk vävnad - från värden tillåter oss att behandla det ektopiska benet som en sann "inverterad" benmärgstransplantation. Lokal transplantation av benmärgsstromceller främjar effektiv korrigering av bendefekter, mer uttalad än vid spontan reparativ regenerering. I flera prekliniska studier i djurmodeller på ett övertygande sätt visat möjligheten att transplantationer av benmärgsstromaceller inom ortopedi, trots att optimera dessa metoder, även i de enklaste fallen, kräver mest noggrant arbete och analys. I synnerhet, optimala betingelser för expansion ex vivo osteogena stromala celler är ännu inte satt, ingen struktur avgaser och sammansättning är idealiska bärare och antalet celler som behövs för regenerering av benvolym.

Förutom att tillämpa förökade ex vivo stromala benmärgsceller för vävnadsregenerering av mesenkymalt ursprung okonventionella duktilitet MSC öppnar den potentiella användningen för regenerering av neurala celler, eller leveransen av genprodukter i CNS. I princip förenklar detta cellterapi i nervsystemet, eftersom det inte finns något behov av att erhålla autologa neurala stamceller från människor. Rapporterade om möjligheten att använda benmärgsceller för generering av hjärtmuskelceller och myogenic stamceller som verkligen stromal så vnestromalnogo ursprung.

Experiment pågår vid systemisk transplantation av benmärgsstromceller för behandling av vanliga skelettsjukdomar. Ingen tvekan om att benmärgs stromaceller är en population ansvariga för genetiska störningar i sjukdomar i skelettet, som är väl illustreras av vektoröverföring genom att använda den genetiska informationen av cellerna, vilket leder till bildningen av patologiska benvävnad hos försöksdjur. Stromacellers förmåga att implantera, växa, multiplicera och differentiera i skelettens ben efter införandet i den allmänna blodströmmen har emellertid ännu inte bevisats.

Detta beror delvis på det faktum att standardförfarandet för benmärgs stroma inte transplanteras med hematopoetisk vävnad, så strikta kriterier för utvärdering framgångsrik inympning av systemiskt administrera stromaceller har ännu inte utvecklats. Man bör komma ihåg att närvaron av markörgener i vävnadsextrakt eller frisättning i kulturen av donatorhärledda celler vittnar inte inympning av celler, men endast om deras överlevnad. Även intraarteriell injektion av benmärgsstromaceller i musen lem kan leda till praktiskt taget noll resultat engraftment, trots det faktum att donatorhärledda celler finns i stort antal inom den mikrovaskulära benmärgs nätverk. Tyvärr beskrivs sådana celler vanligen som "engrafted" endast på basis av resultaten av bestämningen av markördonorgener under ex vivo odlingsbetingelser. Dessutom är det nödvändigt att tillhandahålla övertygande bevis på långsiktig integrering i vävnaderna hos differentierade och funktionellt aktiva celler av donatorväxel. I många publicerade verk, där det rapporteras om engraftment av benmärgsstromceller i skelettet, är bristen på tydliga data av detta slag slående. Det bör dock noteras att i vissa korrekta försök på djur har dock en begränsad men verklig engraftment av stromal progenitorceller efter deras systemiska administrering etablerats.

Dessa data överensstämmer med resultaten av studien av möjligheten att leverera myogena benmärgsprekursorceller till musklerna genom kärlsystemet. Man bör dock inte glömma att både skelett- och muskelvävnaden bildas under utveckling och tillväxt baserad på extravaskulära celler förskjutningar som använder migrationsprocesser som inte involverar blodcirkulationen. Om det i själva verket finns det en oberoende cirkulationsbana för leverans-predshestvonnrshov celler i fast vävnad fas, är det möjligt att förhindra förekomsten av fysiologiskt cirkulerande mesenkymala progenitorceller? Vad är ursprunget för dessa celler i både den utvecklings- och postnatala organismen, och hur tränger de in i kärlväggen? Lösningen av dessa frågor är absolut nödvändig och kräver den mest grundliga prekliniska analysen. Även efter att svaren på dessa frågor har hittats kvarstår de problematiska kinetiska aspekterna i samband med skeletttillväxt och ombyggnad av bindväv oupplöst. Samtidigt verkar behandling av osteogenesproblem genom att ersätta hela populationen av muterade skelettprogenitorceller med friska stromala celler ett verkligt kliniskt perspektiv. I detta fall kan lokal deformation eller brott på grund av patologiska zonen osteogenes och ben destruktiva förändringar korrigeras genom användning av in vitro odlade stromala stamceller. Följaktligen är det riktningen för framtida studier lämpligt att fokusera på problem eller genetisk transformation korrigering muterade autologa ex vivo osteogena prekursorceller.

Genteknik av celler, temporärt eller permanent, blev basen av cell- och molekylärbiologi, källan till många vetenskapliga rön om rollen av individuella proteiner i cellulär metabolism in vitro ämnen och in vivo. Användningen av molekylära tekniker för att korrigera ärftliga sjukdomar och humana sjukdomar är mycket lovande för praktisk medicin, eftersom egenskaperna hos stromal benmärgsstamceller får utvecklas unika kretsar transplantation för korrigering av genetiska sjukdomar i skelettet. I detta fall kan de mesenkymala stamceller kan erhållas helt enkelt från framtiden mottagaren, de är mottagliga för genetisk manipulation och kan föröka sig i stort antal på kort tid. Användning av mesenkymala stamceller undviker de begränsningar och risker som är förknippade med leverans av genetisk information material direkt till patienten via vrtrusnye vektorkonstruktioner. Denna strategi är tillämplig på de pi embryonala stamceller, men postnatala autologa benmärgsstromaceller - ett föredraget material eftersom deras administrering utesluter möjliga immunologiska posttransplantation komplikationer. I syfte att uppnå kortsiktig effekt, exempelvis för att påskynda benregenerering, är den optimala metoden för genetisk modifiering av mesenkymala stamceller med användning elektroporatsrsh, kemisk fusion, lipofektion, plasmider och adenovirala konstruktionerna. I synnerhet viral transfektion i BMM-celler i benmärgsströmmen var effektiv för att accelerera regenerering av ben i experimentell polytrauma. Skapandet av adenovirala vektorkonstruktioner är att föredra på grund av frånvaro av toxicitet. Emellertid kännetecknas den genetiska modifieringen av benmärgsstromceller i detta fall av extremt låg stabilitet. Dessutom normala transformerade benmärgs stromaceller kräver användning av vektor bärare av genetisk information 10 gånger mer smittsamt än andra celltyper, vilket avsevärt ökar den procentandel av döden av de transfekterade cellerna.

För behandling av recessiva sjukdomar orsakade av låg eller noll biologiska aktiviteten av vissa gener nödvändiga långvarig eller permanent modifiering av mesenkymala stamceller, som kräver användning av adenoassocierade virus, retrovirus, lentivirus och adeno-retroviral chimär. Transportplatser av dessa virus kan transportera stora DNA-transfekter (upp till 8 kb). Den vetenskapliga litteraturen har redan dykt information om biologisk aktivitet av exogena benmärgsstromaceller transfekterade med retrovirala konstruktioner som kodar för syntes av regulatoriska molekyler och markörer - IL-3, CD2, faktor VIII, och de enzymer som är involverade i syntesen av L-DOPA. Men i dessa verk pekar författarna på ett antal begränsningar som måste övervinnas innan den praktiska tillämpningen av denna teknik börjar. Det första problemet är att optimera MCK ex vivo modifieringsprocessen. Det är känt att en långvarig (3-4 veckors) proliferation av benmärgsstromaceller in vitro minskar deras transfektion. Samtidigt krävs flera transfusionscykler för att uppnå en hög nivå av genetisk modifiering av MSC. Det andra problemet är relaterat till varaktigheten av uttryck av den terapeutiska genen, som ännu inte överskrider fyra månader. En naturlig minskning av effektivt genuttryck beror på inaktivering av promotorer och död av modifierade celler. I allmänhet utsikter överföring av genetisk information genom att använda mesenkymala stamceller resultat från preliminära studier indikerar behovet av ytterligare optimering av transfektionsmetoder ex vivo, välja en lämplig promotor som reglerar den biologiska aktiviteten i rätt riktning, och öka förmågan hos de modifierade stromala benmärgsceller att självförnyas in vivo efter transplantation. Det bör noteras att användningen av retrovirala konstruktioner för modifiering av benmärgs stromaceller i önskad riktning inte alltid kräver sin obligatoriska engraftment. Transfekterades mesenkymal stamcell kan utföra en korrigerande funktion på bakgrunden av stabila och vistelse utan att kräva aktiv fysisk inkorporering och fungerar i bindväven. I detta fall bör de betraktas som en biologisk mini-pump, som producerar in vivo faktor, bristen på som bestämmer manifestation av en genetisk sjukdom.

Användning av transformerade stromala benmärgsceller för behandling av dominant genetisk sjukdom som kännetecknas av expression av genen eller onormal patologisk biologisk aktivitet, är mycket mer problematisk eftersom det i detta fall är det nödvändigt att blockera överföringen eller försäljningen av den genetiska informationen förvrängd. En av de metoder för genteknik - homolog rekombination av embryonala stamceller för att generera transgena djur. Det är dock osannolikt att främja en utbredd användning av denna teknik inom en snar framtid den extremt låga nivån på homolog rekombinant, i kombination med problemen med identifiering, separation och utbyggnad av sådana rekombinanter, även om utvecklingen av nya tekniska metoder. Den andra tillvägagångssätt för genterapi grundar sig på den dominerande patologi automatisk korrigering av skadat DNA som genetiska mutationer kan korrigeras genom införandet av det exogena DNA med den önskade sekvensen (kort DNA-oligonukleotider, eller chimära RNA / DNA-oligonukleotider) som binder till homologer i den skadade genomet. Den tredje utföringsformen tillhandahåller patologisk informationsöverföring lås som uppnås genom användning av specifikt utformade oligonukleotider som binder till en särskild gen för att bilda ternära spiralformig struktur, vilket utesluter möjligheten av transkription.

Även om korrigering av genetiska sjukdomar i genomet nivån är optimal och föredragen terapeutisk metod, är mRNA också en lovande vektor (kanske ännu mer tillgängliga) för blockering en dominant negativ gen. För att inhibera översättning och / eller ökning av mRNA-nedbrytning har länge använts med proteinmolekyler antisensoligonukleotid sekvenser eller fullständig blockering bindning av mRNA biosyntetiska apparaten hos cellen. Dessutom inducerar dubbelsträngat RNA snabb nedbrytning av mRNA, vars mekanism förblir oklart. Det är dock osannolikt att enbart avlägsnandet av mRNA transkriberade från en mutant allel med korta eller enstaka mutationer kommer att främja mRNA uttryck för den normala allelen. Ett alternativ är att använda ribozinov hammar och hårnål, har förmågan att binda till mycket specifika platser i mRNA med efterföljande induktion av deras klyvning och inaktive under translation. För närvarande studeras möjligheten att använda denna metod vid behandling av patologisk osteogenes. Oberoende av vad exakt är målet - genomiska eller cytoplasmatiska element framgång för ny genterapiteknologi kommer att bestämmas av effektiviteten av införlivande av reagens i stromala benmärgsceller ex vivo, den optimala val av en speciell vektor och stabil förmåga av mesenkymala stamceller som uttrycker de önskade faktorerna in vivo.

Upptäckten av mesenkymala stamceller med sina oväntade egenskaper skapar således ett nytt konceptuellt system för utveckling av cellinjer. Men för att förstå den biologiska rollen av stromal stamceller av sin art, förmågan att transdifferentiering eller dedifferentiering, deras fysiologiska betydelse i processen för embryonal utveckling, postnatal tillväxt, mognad och åldrande, liksom i mänskliga sjukdomar kräver ytterligare tvärvetenskaplig forskning.