Mesenkymala stamceller

Bland regionala stamceller intar mesenkymala stamceller (MSC) en särskild plats, vars derivat utgör den stromala matrisen i alla organ och vävnader i människokroppen. Prioritet i MSC-forskningen tillhör representanter för rysk biologisk vetenskap.

I mitten av förra seklet isolerades för första gången en homogen kultur av multipotenta stromala stamceller från benmärg i A. Friedensteins laboratorium. Mesenkymala stamceller fästa vid substratet bibehöll hög proliferationsintensitet under lång tid, och i kulturer med låg såddäthet bildade de efter fixering på substratet kloner av fibroblastliknande celler som inte hade fagocytisk aktivitet. Upphörandet av MSC-proliferation slutade med deras spontana differentiering in vitro till celler av ben, fett, brosk, muskel eller bindväv. Ytterligare studier gjorde det möjligt att fastställa den osteogena potentialen hos fibroblastliknande celler i benmärgsstroma hos olika däggdjursarter, såväl som deras kolonibildande aktivitet. In vivo-experiment har visat att både hetero- och ortotoptransplantation av kolonibildande fibroblastliknande celler resulterar i bildandet av ben-, brosk-, fibrös och fettvävnad. Eftersom stromala stamceller från benmärg kännetecknas av en hög kapacitet för självförnyelse och mångfacetterad differentiering inom en enda cellinje kallas de multipotenta mesenkymala progenitorceller.

Det bör noteras att över 45 års grundläggande forskning om mesenkymala stamceller har skapats verkliga förutsättningar för användning av deras derivat i klinisk praxis.

Idag råder det ingen tvekan om att alla vävnader i människokroppen bildas från stamceller från olika cellinjer som ett resultat av processerna proliferation, migration, differentiering och mognad. Emellertid trodde man fram till nyligen att stamceller i en vuxen organism är vävnadsspecifika, dvs. kapabla att producera linjer av specialiserade celler endast från de vävnader där de finns. Denna konceptuella position motbevisades av fakta om transformation av hematopoetiska stamceller inte bara till cellulära element i perifert blod, utan också till ovala celler i levern. Dessutom visade sig neurala stamceller vara kapabla att ge upphov till både neuroner och gliaelement, såväl som tidiga engagerade linjer av hematopoetiska progenitorceller. I sin tur kan mesenkymala stamceller, som vanligtvis producerar cellulära element i ben, brosk och fettvävnad, transformeras till neurala stamceller. Det antas att i processen för tillväxt, fysiologisk och reparativ vävnadsregenerering genereras oengagerade progenitorceller från vävnadsospecifika stamreserver. Till exempel kan reparation av muskelvävnad realiseras på grund av att mesenkymala stamceller migrerar från benmärg till skelettmuskler.

Även om sådan korsutbytbarhet av stamceller inte erkänns av alla forskare, är möjligheten till klinisk användning av mesenkymala stamceller som källa för celltransplantation och en cellulär vektor för genetisk information inte längre ifrågasatt av någon, liksom multipotensen hos benmärgsstromala stamceller, vilka relativt enkelt kan isoleras och expanderas in vitro-kultur. Samtidigt fortsätter rapporter om den potentiella pluripotensen hos benmärgsstromala stamceller att dyka upp i den vetenskapliga litteraturen. Som bevis citeras forskningsprotokoll där MSC, under inverkan av specifika transdifferentieringsinducerare, transformeras till nervceller, kardiomyocyter och hepatocyter. Vissa forskare har dock allvarliga tvivel om möjligheten till upprepad aktivering och uttryck av gener från perioden med tidig embryogenes. Samtidigt förstår alla att om förutsättningar hittas för att utöka multipotensen hos mesenkymala stamceller till pluripotensen hos ESC, kommer många etiska, moraliska, religiösa och juridiska problem inom regenerativ plastikmedicin att lösas automatiskt. Eftersom källan till regenerativ stampotential i detta fall blir patientens autologa stromala celler, är problemet med immunavstötning av celltransplantationen också löst. Den närmaste framtiden kommer att visa hur realistiska dessa utsikter är.

[ 1 ], [ 2 ]

Användning av mesenkymala stamceller inom medicin

I kliniken är användningen av mesenkymala stamcellsderivat främst förknippad med restaurering av vävnadsdefekter som uppstår vid omfattande och djupa termiska hudlesioner. I det prekliniska skedet genomfördes en experimentell bedömning av genomförbarheten av att använda allogena fibroblastliknande mesenkymala stamceller för att behandla djupa brännskador. Det visades att benmärgsfibroblastliknande mesenkymala stamceller bildar ett monolager i kultur, vilket gör det möjligt att transplantera dem för att optimera regenereringsprocesserna vid djupa brännskador. Författarna noterar att embryonala fibroblaster har en liknande egenskap, men deras kliniska användning är begränsad av befintliga etiska och juridiska problem. En djup termisk brännskada med skador på alla hudlager modellerades på Wistar-råttor. Brännskadans yta var 18-20% av den totala hudytan. Den första experimentgruppen inkluderade råttor med en djup termisk brännskada och transplantation av allogena fibroblastliknande mesenkymala stamceller. Den andra gruppen bestod av djur med en djup termisk brännskada och transplantation av allogena embryonala fibroblaster. Den tredje gruppen representerades av kontrollråttor med en djup termisk brännskada som inte genomgick cellterapi. En suspension av fibroblastliknande mesenkymala stamceller och embryonala fibroblaster applicerades på ytan av brännskadan med hjälp av en pipett i en mängd av 2 x 10⁻⁴ ^.celler på den andra dagen efter brännskadamodellering och borttagning av den resulterande nekrotiska skorpan. Efter celltransplantation täcktes brännskadytan med en gasbinda fuktad med isoton natriumkloridlösning med gentamicin. Benmärgsceller samlades in för att erhålla MSC med deras efterföljande induktion i en linje av fibroblastliknande mesenkymala stamceller från vuxna Wistar-råttor från lårben. Embryonala fibroblaster erhölls från lungorna hos 14-17 dagar gamla embryon. Embryonala fibroblaster och benmärgsceller för att erhålla MSC odlades preliminärt i petriskålar vid en temperatur av 37 °C i en CO2-inkubator, i en atmosfär med 5 % CO2 vid 95 % luftfuktighet. Embryonala fibroblaster odlades i 4-6 dagar, medan bildandet av ett monolager av MSC krävde 14 till 17 dagar. Därefter kryokonserverades MSC som källmaterial för fibroblastliknande mesenkymala stamceller, vilka erhölls genom upptining och odling av MSC i 4 dagar. Antalet bildade fibroblastliknande mesenkymala stamceller var mer än 3 gånger högre än antalet embryonala fibroblaster som bildades under samma odlingsperiod. För att identifiera de transplanterade cellerna i brännskador i odlingsstadiet märktes deras genom med hjälp av en viral skyttelvektor baserad på rekombinant adenovirus typ V som bär 1ac-2-genen som kodar för E. coli ß-galaktosidas. Levande celler vid olika tidpunkter efter transplantation detekterades immunhistokemiskt i kryosnitt med tillsats av X-Gal-substrat, vilket ger en karakteristisk blågrön färgning. Som ett resultat av dynamisk visuell, planimetrisk och histologisk bedömning av brännsårets tillstånd fastställdes det att redan på den 3:e dagen efter celltransplantation uppträdde signifikanta skillnader i sårprocessens förlopp i de utvalda grupperna. Denna skillnad blev särskilt tydlig på den 7:e dagen efter celltransplantation. Hos djuren i den första gruppen, till vilka fibroblastliknande mesenkymala stamceller transplanterades, fick såret en jämnt intensiv rosa färg, granulationsvävnad växte över hela området till epidermisnivå, och brännskadans storlek minskade avsevärt. Kollagenfilmen som bildades på sårytan blev något tunnare, men den fortsatte att täcka hela brännskadans område. Hos djuren i den andra gruppen, till vilka embryonala fibroblaster transplanterades, steg granulationsvävnaden till epidermisnivå vid sårkanterna, men bara på sina ställen, medan plasmorré från såret var mer intensiv än i den första gruppen, och den initialt bildade kollagenfilmen försvann praktiskt taget. Hos djur som inte fick cellterapi var brännskadan blek, gropig, nekrotisk vävnad täckt med fibrin på den sjunde dagen. Plasmorea noterades över hela brännskadans yta. Histologiskt visade djuren i den första och andra gruppen en minskning av cellulär infiltration och utveckling av det vaskulära nätverket.och dessa tecken på den begynnande regenerativa processen var mer uttalade hos råttorna i den första gruppen. I kontrollgruppen observerades tecken på cellulär infiltration av såret, det histologiska mönstret av nybildade kärl var frånvarande. På observationsdagen 15-30 var arean av brännskadan hos djuren i den första gruppen betydligt mindre än hos råttorna i de andra grupperna, och den granulerande ytan var mer utvecklad. Hos djuren i den andra gruppen minskade även arean av brännskadan jämfört med storleken på brännskador hos råttorna i kontrollgruppen, vilket uppstod på grund av marginell epitelisering. I kontrollgruppen förblev brännskadan blek på sina ställen med sällsynta granuleringar, vaskulära asterisker dök upp på den, det fanns cellöar av fibrinös plack, måttlig plasmorré fortsatte över hela brännskadan och en svårseparerad skorpa fanns kvar på vissa ställen. I allmänhet minskade även sårets storlek hos djuren i den tredje gruppen, men sårets kanter förblev underminerade.

Således noterades under en jämförande studie av sårläkningshastigheten med fibroblastliknande mesenkymala stamceller och embryonala fibroblaster, såväl som utan användning av cellterapi, en acceleration av läkningshastigheten för brännskadans yta som ett resultat av transplantation av fibroblastliknande mesenkymala stamceller och embryonala fibroblaster. Vid användning av allogena fibroblastliknande mesenkymala stamceller var dock sårläkningshastigheten högre än vid transplantation av embryonala fibroblaster. Detta uttrycktes i en acceleration av fasförändringen i den regenerativa processen - tiderna för cellinfiltration minskade, hastigheten för vaskulär nätverkstillväxt ökade, liksom bildandet av granulationsvävnad.

Resultaten av dynamisk planimetri indikerar att den spontana läkningshastigheten för brännsåret (utan användning av cellterapi) var den lägsta. På den 15:e och 30:e dagen efter transplantation av allogena fibroblastliknande mesenkymala stamceller var sårläkningshastigheten högre än vid transplantation av embryonala fibroblaster. Histokemisk metod för att detektera beta-galaktosidas visade att efter transplantation av fibroblastliknande mesenkymala stamceller och embryonala fibroblaster förblir de transplanterade cellerna livskraftiga på ytan och i djupet av de regenererande såren under hela observationsperioden. Författarna tror att den högre hastigheten för regenerering av brännsår vid användning av fibroblastliknande mesenkymala stamceller beror på frisättningen av biologiskt aktiva tillväxtstimulerande faktorer från dessa celler under mognadsprocessen.

Transplantation av auto- eller allogena keratinocyter och allogena fibroblaster för behandling av brännskador har också använts i klinisk praxis. Det bör noteras att kirurgisk behandling av barn med omfattande djupa brännskador är en komplex uppgift på grund av den högtraumatiska naturen och multipla kirurgiska ingrepp, betydande blodförlust och olika reaktioner på de infusionsmedier som används. De största svårigheterna med att utföra hudplastikkirurgi för omfattande djupa brännskador, med en yta som överstiger 40 % av kroppsytan, beror på offrens allvarliga tillstånd och bristen på donatorhudresurser. Användningen av nättransplantat med hög perforeringskoefficient löser inte problemet, eftersom cellerna som bildas efter perforering epiteliseras mycket långsamt, och själva hudflikarna ofta lyserar eller torkar ut. Sådana täckningar av brännskador som xenoskin, kadaverallografter, syntetiska filmtäckningar är inte alltid tillräckligt effektiva, därför utvecklas nya metoder för att täcka brännskador med lager av odlade keratinocyter och fibroblaster. I synnerhet har en metod föreslagits för att täcka brännskador med hjälp av odlade allofibroblaster, vilka vid transplantation har en uttalad stimulerande effekt på proliferationen av epidermocyter som bevarats i såret vid borderline-brännskador, såväl som keratinocyter i septa hos nättransplantationer. L. Budkevichs och medförfattares (2000) arbete presenterar resultaten av att använda denna metod för behandling av brännskador hos barn. Studien omfattade 31 barn med termiskt trauma i åldrarna 1 år till 14 år. Hos tre barn var den totala arean av brännskador av grad IIIA-B - IV 40 %, hos 25 - 50-70 %, hos ytterligare tre - 71-85 % av kroppsytan. Tidig kirurgisk nekrektomi kombinerades med transplantation av odlade allofibroblaster och autodermoplastik. Det första behandlingssteget innebar excision av nekrotisk vävnad, det andra steget innebar transplantation av odlade allofibroblaster på bärarfilmer, och det tredje steget (48 timmar efter transplantation av odlade allofibroblaster) innebar avlägsnande av matrixen och autodermoplastik med hudflikar med ett perforeringsförhållande på 1:4. Tre patienter som inlades på kliniken med svår brännskada fick odlade allofibroblaster transplanterade på granulerande sår. Transplantation av odlade allofibroblaster utfördes en gång på 18 barn, två gånger på 11 barn och tre gånger på två patienter. Den del av sårytan som var täckt med cellkultur varierade från 30 till 3500 cm2. Effektiviteten av odlade allofibroblaster bedömdes utifrån den totala andelen hudtransplantatinplantat, brännskadans läkningstid och antalet dödsfall från allvarligt termiskt trauma. Transplantatinplantatet var fullständigt hos 86 % av patienterna. Delvis utebliven inplantning av hudtransplantat noterades i 14 % av fallen. Trots behandlingen dog sex (19,3 %) barn. Det totala området för hudskador i dem varierade från 40 till 70% av kroppsytan.Transplantation av odlade allofibroblaster var inte associerad med dödlighet vid brännskada hos någon patient.

Vid analys av behandlingsresultaten noterar författarna att tidigare djupa termiska hudskador som täckte 35–40 % av kroppsytan ansågs vara oförenliga med livet (för yngre barn – upp till 3 år – är djupa brännskador som täcker 30 % av kroppsytan kritiska, för äldre barn – över 40 % av kroppsytan). Vid kirurgisk nekrektomi med transplantation av odlade allofibroblaster och efterföljande autodermoplastik med hudflikar med hög perforeringskoefficient är brännskador av IIIB–IV-graden fortfarande kritiska, men för närvarande finns det möjligheter att rädda livet även för sådana offer i många fall. Kirurgisk nekrektomi i kombination med transplantation av odlade allofibroblaster och autodermoplastik hos barn med djupa brännskador har visat sig vara särskilt effektivt hos patienter med utbredda hudskador med brist på donatorplatser. Aktiv kirurgisk taktik och transplantation av odlade allofibroblaster bidrar till snabb stabilisering av det allmänna tillståndet hos sådana patienter, en minskning av antalet infektiösa komplikationer av brännskada, skapande av gynnsamma förutsättningar för inympning av transplantat, en minskning av tiden för återställning av förlorad hud och varaktigheten av slutenvård, en minskning av frekvensen av dödliga utgångar hos offer med omfattande brännskador. Således möjliggör transplantation av odlade allofibroblaster med efterföljande autodermoplastik med hudflikar återhämtning hos barn med svåra brännskador, som tidigare ansågs vara dömda att dö.

Det är allmänt accepterat att det primära målet med behandling av brännskador är den mest fullständiga och snabba återställningen av skadad hud för att förhindra toxiska effekter, infektiösa komplikationer och uttorkning. Resultaten av att använda odlade celler beror till stor del på hur berett brännsåret är för transplantation. Vid transplantation av odlade keratinocyter på sårytan efter kirurgisk nekrektomi, inympas i genomsnitt 55 % (per area) av de transplanterade cellerna, medan inympningsgraden vid granulerande sår minskar till 15 %. Därför kräver framgångsrik behandling av omfattande djupa brännskador först och främst aktiv kirurgisk taktik. Vid brännskador av grad IIIB-IV befrias brännskadan omedelbart från nekrotisk vävnad för att minska berusning och antalet komplikationer av brännskador. Användningen av sådan taktik är nyckeln till att minska tiden från det att en brännskada uppstår tills såren sluter och vårdtiden för patienter med omfattande brännskador på sjukhus, och minskar också avsevärt antalet dödliga utfall.

De första rapporterna om framgångsrik användning av odlade keratinocyter för att täcka brännskador dök upp i början av 1980-talet. Därefter utfördes denna manipulation med lager av odlade keratinocyter, oftast erhållna från autoceller, mycket mer sällan från allokeratinocyter. Tekniken för autokeratinocytoplastik tillåter dock inte skapandet av en cellbank, medan den tid som krävs för att producera en keratinocyttransplantation av tillräcklig yta är lång och uppgår till 3-4 veckor. Under denna period ökar risken för att utveckla infektiösa och andra komplikationer av brännskada kraftigt, vilket avsevärt förlänger patienternas totala sjukhusvistelsetid. Dessutom rotar sig autokeratinocyter praktiskt taget inte när de transplanteras på granulerande brännskador, och den höga kostnaden för speciella tillväxtmedier och biologiskt aktiva stimulatorer av keratinocyttillväxt begränsar deras kliniska användning avsevärt. Andra bioteknologiska metoder, såsom kollagenplastik, transplantation av kryokonserverad xenoskin och användning av olika biopolymerbeläggningar ökar effektiviteten vid behandling av omfattande ytliga, men inte djupa brännskador. Metoden att täcka sårytan med odlade fibroblaster skiljer sig fundamentalt genom att fibroblaster, snarare än keratinocyter, används som huvudkomponent i det odlade cellskiktet.

Förutsättningen för utvecklingen av metoden var data om att pericyter som omger små kärl är progenitor-mesenkymala celler som kan transformeras till fibroblaster som producerar många tillväxtfaktorer och säkerställer sårläkning tack vare en starkt stimulerande effekt på keratinocyters proliferation och vidhäftning. Användningen av odlade fibroblaster för att stänga sårytor avslöjade omedelbart ett antal betydande fördelar med denna metod jämfört med användningen av odlade keratinocyter. I synnerhet kräver erhållande av fibroblaster i kultur inte användning av speciella näringsmedier och tillväxtstimulerande medel, vilket minskar kostnaden för transplantationen med mer än 10 gånger jämfört med kostnaden för att erhålla keratinocyter. Fibroblaster passiveras lätt, under vilken tid de delvis förlorar ytliga histokompatibilitetsantigener, vilket i sin tur öppnar upp möjligheten att använda allogena celler för tillverkning av transplantat och skapandet av deras banker. Tiden som krävs för att erhålla transplantat redo för användning på en klinik minskas från 3 veckor (för keratinocyter) till 1-2 dagar (för fibroblaster). En primär fibroblastkultur kan erhållas genom att odla celler från hudfragment tagna under autodermoplastik, och cellsådddensiteten för att erhålla humana fibroblastsubkulturer är endast 20 x 10³ ^per 1 ^cm².

För att studera effekten av fibroblaster och deras regulatoriska proteiner på proliferationen och differentieringen av keratinocyter utfördes en jämförande analys av morfologin och proliferationen av keratinocyter på substrat av kollagen typ I och III, samt fibronektin i en gemensam kultur med humana fibroblaster. Humana keratinocyter isolerades från hudfragment från patienter med brännskador, tagna under autodermoplastik. Keratinocyternas såddtäthet var 50 x 103 celler per 1 cm2. Den kliniska effekten av odlad fibroblasttransplantation utvärderades hos 517 patienter. Alla patienter delades in i två grupper: Grupp 1 - vuxna offer med brännskador av IIA, B-IV grad; Grupp 2 - barn med djupa brännskador av IIIB-IV grad. Utvärdering av dynamiken i den strukturella och funktionella organisationen av monolagerkulturfibroblaster med hänsyn till glykosaminoglykanernas, fibronektins och kollagens roll i regenereringsprocesserna gjorde det möjligt för författarna att bestämma den 3:e dagen som den mest gynnsamma perioden för att använda fibroblastkulturer för att göra transplantationer. En studie av fibroblasters effekt på proliferation och differentiering av keratinocyter visade att fibroblaster in vitro har en uttalad stimulerande effekt, främst på processerna för keratinocytadhesion, vilket ökar antalet bundna celler och deras fixeringshastighet med mer än 2 gånger. Stimulering av adhesionsprocesser åtföljs av en ökning av intensiteten av DNA-syntes och nivån av keratinocytproliferation. Dessutom visade det sig att närvaron av fibroblaster och den extracellulära matris som bildas av dem är ett nödvändigt villkor för bildandet av keratinocyternas tonofibrillära apparat, intercellulära kopplingar och i slutändan för differentiering av keratinocyter och bildandet av basalmembranet. Vid behandling av barn med djupa brännskador har hög klinisk effektivitet av transplantation av allofibroblastkultur fastställts, särskilt i gruppen patienter med omfattande hudskador vid brist på givarplatser. En omfattande morfofunktionell studie har visat att transplanterade fibroblaster kännetecknas av aktiv syntes av DNA, såväl som kollagen, fibronektin och glykosaminoglykaner, vilka är en del av den extracellulära matrisen som bildas av celler. Författarna pekar på en hög andel engraftment av transplanterade fibroblaster (upp till 96%), en kraftig minskning av tiden för deras mottagande (inom 24-48 timmar istället för 2-3 veckor vid användning av keratinocyter), en signifikant acceleration av epiteliseringen av brännskadans yta, samt en signifikant minskning av kostnaden (med 10 gånger) för tekniken för att odla ett transplantat från fibroblaster jämfört med keratinocyttransplantation. Användningen av transplantation av odlade allofibroblaster gör det möjligt att rädda livet på barn med kritiska brännskador - termisk skada på mer än 50% av kroppsytan.vilket tidigare ansågs vara oförenligt med livet. Det bör noteras att med transplantation av allogena embryonala fibroblaster har man övertygande bevisat inte bara snabbare sårregenerering och konvalescens hos patienter med varierande grad och områden av brännskador, utan också en signifikant minskning av deras dödlighet.

Autologa fibroblaster används också inom ett så komplext område inom plastikkirurgi som rekonstruktiv korrigering av stämbandsskador. För detta ändamål används vanligtvis bovint kollagen, vars verkningstid begränsas av dess immunogenicitet. Eftersom det är ett främmande protein är bovint kollagen känsligt för mottagarens kollagenas och kan orsaka immunreaktioner, och för att minska risken för detta har tekniker för att erhålla kollagenpreparat tvärbundna med glutaraldehyd utvecklats. Deras fördel ligger i större stabilitet och lägre immunogenicitet, vilket har funnit praktisk tillämpning för att eliminera defekter och atrofi av stämbanden. Injektioner av autologt kollagen användes först 1995. Tekniken säkerställde bevarandet av den primära strukturen hos autologa kollagenfibrer, inklusive intramolekylära enzymatiskt katalyserade tvärbindningar. Faktum är att naturliga kollagenfibrer är mer resistenta mot förstörelse av proteaser än rekonstituerat kollagen, där telopeptiderna är kapade. Telopeptidernas integritet är viktig för den kvaternära strukturen hos kollagenfibrer och bildandet av tvärbindningar mellan intilliggande kollagenmolekyler. Till skillnad från bovint kollagenpreparat orsakar autologt kollagen inte immunreaktioner hos mottagaren, men det är inte tillräckligt effektivt som ett påfyllningsmedel. En stabil korrigering kan uppnås genom lokal kollagenproduktion genom transplantation av autologa fibroblaster. Emellertid identifierades vissa svårigheter under studien av effektiviteten av autolog fibroblasttransplantation i kliniken. Under den tidiga perioden efter fibroblasttransplantation var den kliniska effekten svagare jämfört med den efter införandet av bovint kollagen. Vid odling av autologa fibroblaster kan möjligheten till transformation av normala fibroblaster till patologiska, de så kallade myofibroblasterna, som är ansvariga för utvecklingen av fibros och ärrbildning, vilket framgår av kontraktionen av kollagengelen orsakad av den specifika interaktionen mellan fibroblaster och kollagenfibriller, inte uteslutas. Dessutom förlorar fibroblaster förmågan att syntetisera extracellulära matrixproteiner efter seriell passage in vitro.

Emellertid har nu experimentellt en metod för odling av autologa humana fibroblaster utvecklats som eliminerar ovan nämnda brister och inte resulterar i onkogen transformation av normala fibroblaster. Autologa fibroblaster erhållna med denna metod används för att återställa defekter i mjuka ansiktsvävnader. I en studie av G. Keller et al. (2000) behandlades 20 patienter i åldrarna 37 till 61 år med rynkor och atrofiska ärr. Hudbiopsier (4 mm) från den retroaurikulära regionen transporterades till laboratoriet i sterila provrör innehållande 10 ml odlingsmedium (Eagles medium med antibiotika, mykoseptikum, pyruvat och fetalt kalvserum). Materialet placerades i 3-5 odlingsskålar med 60 mm diameter och inkuberades i en termostat med en atmosfär innehållande 5 % CO2. Efter 1 vecka togs cellerna bort från skålarna genom trypsinering och placerades i 25 cm2-ampuller. Cellerna injicerades i patienter i en mängd av 4 x 107. En signifikant och ihållande klinisk effekt observerades hos patienter under korrigering av nasolabialveck, såväl som hos patienter med ärr 7 och 12 månader efter den tredje transplantationen av autologa fibroblaster. Enligt flödescytometri producerade de odlade fibroblasterna en stor mängd typ I-kollagen. In vitro-studier har visat normal kontraktilitet hos de injicerade fibroblasterna. Två månader efter subkutan administrering av odlade fibroblaster i en dos av 4 x 107 celler detekterades inga tumörer hos nakna möss. De injicerade fibroblasterna orsakade inte ärrbildning eller diffus fibros hos patienterna. Enligt författaren kan de inympade autologa fibroblasterna konstant producera kollagen, vilket ger en kosmetisk föryngringseffekt. Samtidigt, eftersom livslängden för differentierade celler är begränsad, är fibroblaster tagna från en ung patient mer effektiva än de som erhållits från äldre personer. I framtiden antas det vara möjligt att kryokonservera en kultur av fibroblaster tagna från en ung donator för att senare transplantera sina egna unga celler till en äldre patient. Sammanfattningsvis är det inte helt korrekt att dra slutsatsen att autologa fibroblaster, förutsatt att de är funktionellt bevarade, är ett idealiskt sätt att korrigera defekter i ansiktets mjukvävnader. Samtidigt noterar författaren själv att vissa problematiska situationer relaterade till användningen av det autologa fibroblast-kollagensystemet uppstod under studien. Den kliniska effekten var ofta svagare än vid användning av bovint kollagen, vilket orsakade besvikelse hos patienterna.

Generellt sett ser litteraturdata om utsikterna för klinisk användning av mesenkymala stamceller ganska optimistiska ut. Försök görs att använda autologa multipotenta mesenkymala progenitorceller från benmärg för att behandla degenerativa ledskador. De första kliniska prövningarna av användningen av odlade mesenkymala progenitorceller vid behandling av komplexa benfrakturer genomförs. Auto- och allogena mesenkymala benmärgsstromala celler används för att skapa broskvävnad för transplantation vid korrigering av ledbroskdefekter på grund av trauma eller autoimmuna lesioner. Metoder utvecklas för klinisk användning av multipotenta mesenkymala progenitorceller för att eliminera bendefekter hos barn med en allvarlig form av ofullständig osteogenes orsakad av mutationer i typ I-kollagengenen. Efter myeloablation transplanteras mottagarbarn med benmärg från HLA-kompatibla friska donatorer, eftersom ofraktionerad benmärg kan innehålla ett tillräckligt antal mesenkymala stamceller för att kompensera för en allvarlig bendefekt. Efter transplantation av allogen benmärg har sådana barn uppvisat positiva histologiska förändringar i trabekulärben, en ökning av tillväxthastigheten och en minskning av incidensen av benfrakturer. I vissa fall uppnås ett positivt kliniskt resultat genom transplantation av närbesläktad allogen benmärg och osteoblaster. MSC-transplantation används också för att behandla medfödd benfragilitet orsakad av en obalans mellan osteoblaster och osteoklaster i benvävnaden. I detta fall uppnås återställning av benbildning genom chimerisering av poolen av stam- och progenitorstromala celler i patienternas benvävnad.

Förbättringen av metoder för genetisk modifiering av donerade mesenkymala stamceller i syfte att korrigera genetiska defekter i stromala vävnader fortsätter. Det antas att mesenkymala progenitorceller inom en snar framtid kommer att användas inom neurologi för riktad chimerisering av hjärnceller och skapande av en frisk pool av celler som kan generera ett defekt enzym eller en faktor som är ansvarig för kliniska manifestationer av sjukdomen. Transplantation av mesenkymala stamceller kan användas för att återställa benmärgsstroma hos cancerpatienter efter strålbehandling och kemoterapi, och i kombination med benmärgsceller - för att återställa hematopoesen. Utveckling av ersättningsterapi som syftar till att eliminera defekter i rörelseapparaten med hjälp av MSC främjas av tekniska framsteg inom området design av matrisbiomaterial eller biomimetika som bildar ramverk befolkade av avkomma från mesenkymala stamceller.

Källor till mesenkymala stamceller

Den huvudsakliga källan till mesenkymala stamceller är benmärg, vars hematopoetiska stamceller i däggdjurs kropp ständigt differentierar till blod- och immunsystemceller, medan mesenkymala stamceller representeras av en liten population av fibroblastliknande celler i benmärgsstroma och bidrar till att bevara det odifferentierade tillståndet hos hematopoetiska stamceller. Under vissa förhållanden differentierar mesenkymala stamceller till brosk- och benvävnadsceller. När de sås på ett odlingsmedium under planteringsförhållanden med låg densitet bildar mononukleära stromala celler i benmärgen kolonier av adhesiva celler, vilka i själva verket är fibroblastliknande multipotenta mesenkymala progenitorceller. Vissa författare tror att odeponerade mesenkymala stamceller deponeras i benmärgen, vilka, på grund av deras förmåga att självförnya sig och höga differentieringspotential, förser alla kroppens vävnader med mesenkymala prekursorer till stromala element under hela däggdjursorganismens liv.

I benmärgen bildar stromala cellelement ett nätverk som fyller utrymmet mellan sinusoiderna och benvävnaden. Halten av vilande MSC i benmärgen hos en vuxen är jämförbar med mängden hematopoetiska stamceller och överstiger inte 0,01-0,001 %. Mesenkymala stamceller som isolerats från benmärg och inte odlats saknar adhesionsmolekyler. Sådana MSC uttrycker inte CD34, ICAM, VCAM, kollagen typ I och III, CD44 och CD29. Följaktligen är det in vitro inte mesenkymala stamceller som fixeras på odlingssubstratet, utan mer avancerade progenitorderivat av mesenkymala stamceller som redan har bildat komponenterna i cytoskelettet och receptorapparaten för celladhesionsmolekyler. Stromala celler med CD34-fenotypen finns även i perifert blod, även om det i benmärgen finns betydligt färre av dem än CD34-positiva mononukleära celler. CD34-celler som isolerats från blodet och överförts till odling fäster vid substratet och bildar kolonier av fibroblastliknande celler.

Det är känt att under embryonalperioden uppstår den stromala basen för alla organ och vävnader hos däggdjur och människor från en gemensam pool av mesenkymala stamceller före och under organogenesens skede. Därför tror man att majoriteten av mesenkymala stamceller i en mogen organism bör finnas i bindväv och benvävnad. Det har fastställts att huvuddelen av de cellulära elementen i stroma av lös bindväv och benvävnad representeras av engagerade progenitorceller, vilka dock behåller förmågan att proliferera och bilda kloner in vitro. När sådana celler introduceras i den allmänna blodomloppet implanteras mer än 20 % av de mesenkymala progenitorcellerna bland de stromala elementen i den hematopoetiska vävnaden och parenkymala organ.

En potentiell källa till mesenkymala stamceller är fettvävnad, bland de stamceller där adipocytprekursorer som bildats i varierande grad har identifierats. De minst mogna progenitorelementen i fettvävnad är stromala-vaskulära celler, vilka, liksom multipotenta mesenkymala prekursorceller i benmärg, kan differentieras till adipocyter under inverkan av glukokortikoider, insulinliknande tillväxtfaktor och insulin. I kultur differentierar stromala-vaskulära celler till adipocyter och kondrocyter, och i fettvävnad med benmärgsursprung finns celler som bildar adipocyter och osteoblaster.

Stromala stamceller har också hittats i muskler. I den primära kulturen av celler isolerade från mänsklig skelettmuskulatur detekteras stellatceller och multinukleära myotuber. I närvaro av hästserum prolifererar stellatceller in vitro utan tecken på cytodifferentiering, och efter tillsats av dexametason till näringsmediet kännetecknas deras differentiering av uppkomsten av cellulära element med fenotypen av skelett- och glattmuskelceller, ben, brosk och fettvävnad. Därför finns både dedikerade och odedikerade multipotenta mesenkymala progenitorceller i mänsklig muskelvävnad. Det har visats att populationen av progenitorceller som finns i skelettmuskulatur härstammar från odedikerade multipotenta mesenkymala progenitorceller i benmärgen och skiljer sig från myogena satellitceller.

Adhesiva stellatceller motsvarande multipotenta mesenkymala progenitorceller i differentieringspotential hittades också i myokardiet hos nyfödda råttor, eftersom de under inverkan av dexametason differentierar till adipocyter, osteoblaster, kondrocyter, glatta muskelceller, skelettmuskulaturmyotuber och kardiomyocyter. Det visades att vaskulära glatta muskelceller (pericyter) är derivat av odifferentierade perivaskulära multipotenta mesenkymala progenitorceller. I kultur uttrycker perivaskulära mesenkymala stamceller glatt muskel-α-aktin och trombocytderiverad tillväxtfaktorreceptor och kan differentiera åtminstone till glatta muskelceller.

En särskild plats, ur stamreservsynpunkt, intas av broskvävnad, vars extremt låga reparativa potential tros bero på en brist på multipotenta mesenkymala progenitorceller eller differentierings- och tillväxtfaktorer. Det antas att multipotenta mesenkymala progenitorceller som är förbundna med kondrogenes och osteogenes kommer in i broskvävnad från andra vävnadskällor.

Vävnadsursprunget och villkoren för infästning av mesenkymala progenitorceller i senor har inte heller fastställts. Experimentella observationer indikerar att under den tidiga postnatala perioden bibehåller kanin-achillessenceller i primärkulturer och vid första passagen uttrycket av typ I-kollagen och dekorin, men med ytterligare odling förlorar de tenocyternas differentieringsmarkörer.

Det bör noteras att svaret på frågan om huruvida multipotenta mesenkymala progenitorceller lokaliserade i olika vävnader faktiskt ständigt finns i deras stroma, eller om vävnadspoolen av mesenkymala stamceller fylls på genom migration av benmärgsstromala stamceller, ännu inte har mottagits.

Förutom benmärg och andra mesenkymala vävnadszoner hos en vuxen organism kan navelsträngsblod vara en annan källa till MSC. Det har visats att navelsträngsvenblod innehåller celler som har liknande morfologiska och antigena egenskaper med multipotenta mesenkymala progenitorceller, är kapabla till adhesion och inte är sämre än multipotenta mesenkymala progenitorceller av benmärgsursprung i differentieringspotential. I kulturer av mesenkymala stamceller från navelsträngsblod hittades 5 till 10 % odedikerade multipotenta mesenkymala progenitorceller. Det visade sig att deras antal i navelsträngsblod är omvänt proportionellt mot graviditetsåldern, vilket indirekt indikerar migrationen av multipotenta mesenkymala progenitorceller till olika vävnader under fosterutvecklingen. Den första informationen har dykt upp om klinisk användning av mesenkymala stamceller isolerade från navelsträngsblod, såväl som de som erhållits från embryonalt biomaterial, vilket är baserat på den kända förmågan hos fosterstamceller att integrera, inkorporera och fungera i organ och vävnadssystem hos vuxna mottagare.

Sök efter nya källor till mesenkymala stamceller

Användningen av mesenkymala stamceller av embryonalt ursprung, liksom andra fosterceller, skapar ett antal etiska, juridiska, rättsliga och lagstiftningsmässiga problem. Därför fortsätter sökandet efter extraembryonalt donatorcellmaterial. Ett försök till klinisk användning av humana hudfibroblaster misslyckades, vilket förutbestämdes inte bara av teknikens höga ekonomiska kapacitet, utan också av den snabba differentieringen av fibroblaster till fibrocyter, vilka har en betydligt lägre proliferationspotential och producerar ett begränsat antal tillväxtfaktorer. Ytterligare framsteg i studiet av biologin hos MSC och multipotenta mesenkymala progenitorceller från benmärg gjorde det möjligt för oss att utveckla en strategi för klinisk användning av autologa mesenkymala stamceller. Tekniken för deras isolering, odling, ex vivo-reproduktion och riktad differentiering krävde först och främst studier av spektrumet av molekylära markörer för MSC. Deras analys visade att primära kulturer av mänsklig benvävnad innehåller flera typer av multipotenta mesenkymala progenitorceller. Proosteoblastfenotypen detekterades i celler som uttrycker markören för stromala progenitorceller STRO-1, men inte bär osteoblastmarkören - alkaliskt fosfatas. Sådana celler kännetecknas av en låg förmåga att bilda mineraliserad benmatrix, såväl som avsaknad av osteopontin och bisköldkörtelreceptoruttryck. Derivat av STRO-1-positiva celler som inte uttrycker alkaliskt fosfatas representeras av intermediärt och fullständigt differentierade osteoblaster. Det visade sig att cellulära element av klonade linjer av STRO-1-positiva humana trabekulära benceller kan differentieras till mogna osteocyter och adipocyter. Differentieringsriktningen för dessa celler beror på effekten av fleromättade fettsyror, proinflammatoriska cytokiner - IL-1b och tumörnekrosfaktor a (TNF-a), såväl som antiinflammatorisk och immunsuppressiv TGF-b.

Det visade sig senare att multipotenta mesenkymala progenitorceller saknar en specifik fenotyp som är inneboende endast i dem, men uttrycker ett komplex av markörer som är karakteristiska för mesenkymala, endotel-, epitel- och muskelceller i frånvaro av uttryck av immunofenotypiska antigener från hematopoetiska celler - CD45, CD34 och CD14. Dessutom producerar mesenkymala stamceller konstitutivt och inducerbart hematopoetiska och icke-hematopoetiska tillväxtfaktorer, interleukiner och kemokiner, och receptorer för vissa cytokiner och tillväxtfaktorer uttrycks på multipotenta mesenkymala progenitorceller. Vilande, eller vilande, celler med en immunofenotyp som är nästan identisk med antigenprofilen hos 5-fluorouracil-obehandlade multipotenta mesenkymala progenitorceller har hittats bland cellerna i den stromala matrisen i människokroppen - båda cellerna uttrycker CD117, vilket markerar "vuxna" stamceller.

Således har en cellmarkör unik för mesenkymala stamceller ännu inte identifierats. Det antas att vilande celler representerar en population av odedikerade multipotenta mesenkymala progenitorceller, eftersom de inte uttrycker markörer för celler dedikerade till osteo- (Cbfa-1) eller adipogenes (PPAR-y-2). Långvarig exponering av långsamt prolifererande vilande celler för fetalt bovint serum leder till bildandet av terminalt differentierande dedikerade progenitorer som kännetecknas av snabb tillväxt. Klonal expansion av sådana mesenkymala stamceller stöds av FGF2. Det verkar som att genomet hos stromala stamceller är ganska tätt "slutet". Det finns rapporter om avsaknad av spontan differentiering i MSC - utan speciella villkor för dedikation transformeras de inte ens till celler av den mesenkymala linjen.

För att studera populationsstrukturen av mesenkymala stamcellsderivat utförs en sökning efter differentieringsmarkörproteiner på stromala cellinjer och i primärkulturer. In vitro-klonal analys av benmärgskolonibildande celler har visat att EGF ökar den genomsnittliga kolonistorleken och minskar klonalt uttryck av alkaliskt fosfatas när det appliceras på primärkulturer, medan tillsats av hydrokortison aktiverar uttrycket av alkaliskt fosfatas, vilket är en markör för den osteogena riktningen för MSC-differentiering. Monoklonala antikroppar mot STRO-1 gjorde det möjligt att separera och studera populationen av STRO-1-positiva adhesiva celler i ett heterogent system av Dexter-kulturer. Ett spektrum av cytokiner har fastställts som reglerar inte bara proliferationen och differentieringen av hematopoetiska och lymfoida celler, utan också deltar i bildandet, bildningen och resorptionen av skelettvävnader genom para-, auto- och endokrina mekanismer. Receptormedierad frisättning av sådana sekundära budbärare som cAMP, diacylglycerol, inositoltrifosfat och Ca2+ används också för marköranalys av olika kategorier av stromala vävnadsceller som uttrycker motsvarande receptorer. Användningen av monoklonala antikroppar som markörer gjorde det möjligt att fastställa tillhörigheten av retikulära celler i stroma i lymfoida organ till de T- och B-beroende zonerna.

Under en tid fortsatte vetenskapliga debatter kring frågan om möjligheten att MSC härstammar från en hematopoetisk stamcell. När benmärgscellsuspensioner explanteras i monolagerkulturer växer det faktiskt separata kolonier av fibroblaster i dem. Det visades dock att närvaron av prekursorer till fibroblastkolonier och olika groddar av hematopoetisk vävnadsdifferentiering i benmärgen inte är bevis på deras gemensamma ursprung från en hematopoetisk stamcell. Med hjälp av diskriminantanalys av benmärgsstamceller fastställdes det att mikromiljön under heterotopisk benmärgstransplantation inte överförs av hematopoetiska celler, vilket bevisar förekomsten av en population av MSC i benmärgen som är histogenetiskt oberoende av hematopoetiska celler.

Dessutom gjorde den selektiva kloningsmetoden det möjligt att identifiera en ny kategori av stromala progenitorceller i monolagerkulturer av benmärgsceller, bestämma deras antal och studera deras egenskaper, proliferativa och differentierande potentialer. Det visade sig att stromala fibroblastliknande celler prolifererar in vitro och bildar diploida kolonier, vilka, när de transplanteras tillbaka in i kroppen, möjliggör bildandet av nya hematopoetiska organ. Resultaten av studien av individuella kloner indikerar att det bland de stromala progenitorcellerna finns en population av celler som, genom sin proliferativa och differentierande potential, kan göra anspråk på rollen som stamceller i stromal vävnad, histogenetiskt oberoende av hematopoetiska stamceller. Cellerna i denna population kännetecknas av självuppehållande tillväxt och differentierar till progenitorcellselement i ben, brosk och retikulär vävnad i benmärgen.

Av stort intresse är resultaten av studierna av R. Chailakhyan och medförfattare (1997-2001), som odlade benmärgsstromala progenitorceller från kaniner, marsvin och möss på a-MEM-näringsmediet med tillsats av fetalt kalvserum. Författarna utförde explantation med en initial densitet på 2-4 x 10³ benmärgsceller per 1 cm2. Homologa eller heterologa strålningsinaktiverade benmärgsceller användes som matningsmedel i en dos som bibehöll matningseffekten men helt blockerade deras proliferation. Två veckor gamla primära diskreta kolonier av fibroblaster trypsinerades för att erhålla monoklonala stammar. Bevis på koloniernas klonala ursprung erhölls med hjälp av en kromosommarkör i blandade benmärgskulturer av han- och honmarsvin, time-lapse-fotografering av levande kulturer och i blandade kulturer av syngen benmärg från CBA- och CBAT6T6-möss. Transplantation av en suspension av färskt isolerade benmärgsceller eller in vitro-odlade stromala fibroblaster under njurkapseln utfördes i ivalon- eller gelatinporösa byggnadsställningar, såväl som inaktiverad svampig benmatrix från kanin. För transplantation av kloner i en benmantel rensades marsvinslårben från mjukvävnad och periosteum, epifyserna trimmades och benmärgen tvättades noggrant. Benet skars i fragment (3-5 mm), torkades och bestrålades med en dos av 60 Gy. Individuella kolonier av fibroblaster placerades i benmantlar och implanterades intramuskulärt. För intraperitoneal transplantation av in vitro-odlade stromala fibroblaster användes diffusionskamrar av typerna A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) och O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

När R. Chailakhyan et al. (2001) studerade tillväxtdynamiken hos klonala stammar fann de att individuella celler som bildar fibroblastkolonier, liksom deras ättlingar, har enorm proliferativ potential. Vid den tionde passagen var antalet fibroblaster i vissa stammar 1,2–7,2 x 10⁶ ^celler. Under deras utveckling utförde de upp till 31–34 celldubbleringar. I detta fall resulterade heterotoptransplantation av benmärgsavledda stammar bildade av stromala prekursorer från flera dussin kloner i överföring av benmärgsmikromiljön och bildandet av ett nytt hematopoetiskt organ i transplantationszonen. Författarna ställde frågan om individuella kloner är kapabla att överföra benmärgsmikromiljön hos stromala celler eller om samarbete mellan flera olika klonogena stromala prekursorer krävs för detta? Och om enskilda kloner kan överföra mikromiljön, kommer den att vara komplett för alla tre hematopoetiska groddar, eller tillhandahåller olika kloner bildandet av mikromiljön för olika hematopoetiska groddar? För att lösa dessa problem utvecklades en teknik för att odla stromala progenitorceller på en kollagengel, vilket gör det möjligt att avlägsna de odlade kolonierna av fibroblaster från ytan för efterföljande heterotoptransplantation. Enskilda kloner av stromala fibroblaster odlade från benmärgsceller från CBA-möss och marsvin skars ut tillsammans med ett fragment av gelbeläggningen och transplanterades heterotopiskt - under njurkapseln hos syngena möss eller in i bukmuskeln hos autologa marsvin. Vid transplantation in i muskeln placerades kolonierna på gelen i benhöljen.

Författarna fann att 50–90 dagar efter transplantation av benmärgsfibroblastkolonier observerades utveckling av ben eller ben och hematopoetisk vävnad i transplantationszonen i 20 % av fallen. Hos 5 % av mottagardjuren innehöll de bildade benvävnadsfokusen en kavitet fylld med benmärg. Inuti bencylindrarna hade sådana fokus en rundad form och en kapsel byggd av benvävnad med osteocyter och ett välutvecklat osteoblastiskt lager. Benmärgshålan innehöll retikulär vävnad med myeloida och erytroida celler, vars proportionella förhållande inte skilde sig från det i normal benmärg. I njuren var transplantatet ett typiskt benmärgsorgan som bildades under transplantation av nativ benmärg, där benkapseln endast täckte benmärgshålan från sidan av njurkapseln. Den hematopoetiska vävnaden inkluderade myeloida, erytroida och megakaryocytiska element. Stroma i benmärgshålan hade ett välutvecklat sinussystem och innehöll typiska fettceller. Samtidigt hittades benvävnad utan tecken på hematopoies i transplantationszonen hos vissa kolonier under njurkapseln. Studien av de individuella klonernas proliferativa och differentierande potentialer fortsatte på monoklonala benmärgsstammar från kaniner, vars celler resuspenderades i ett näringsmedium och i en separat ivalonsvamp med en massa av 1-2 mg transplanterades under njurkapseln hos en kanin-benmärgsdonator. Celler från 21 monoklonala stammar utsattes för sådan autotransplantation. Resultaten beaktades efter 2-3 månader. Författarna fann att i 14% av fallen bildade de transplanterade monoklonala stammarna ett benmärgsorgan bestående av benvävnad och en benmärgskavitet fylld med hematopoetiska celler. I 33% av fallen bildade de transplanterade stammarna ett kompakt ben av varierande storlek med osteocyter inbäddade i kaviteterna och ett utvecklat osteoblastiskt lager. I vissa fall utvecklades retikulär vävnad utan ben eller hematopoetiska element i svamparna med transplanterade kloner. Ibland bildades retikulärt stroma med ett välutvecklat nätverk av sinusoider, men det befolkades inte med hematopoetiska celler. Således liknade de erhållna resultaten de data som erhölls vid klontransplantation på kollagengel. Om transplantation av kloner odlade på ett substrat resulterade i bildandet av benmärgsvävnad i 5% av fallen, benvävnad i 15% och retikulär vävnad i 80% av fallen, observerades vid transplantation av monoklonala stammar bildandet av benmärgselement i 14% av fallen, benvävnad i 53% och retikulär vävnad i 53% av fallen. Enligt författarna indikerar detta att förutsättningarna för implementering av proliferativ och differentierande potential hos stromala fibroblaster under transplantation på porösa byggnadsställningar var mer optimala än under deras transplantation i benhöljen och på ett kollagensubstrat.Det är möjligt att användningen av mer avancerade metoder för odling och omvänd transplantation av kloner kan förbättra förutsättningarna för att kloner ska kunna förverkliga deras differentieringspotential och förändra dessa förhållanden. På ett eller annat sätt, men den huvudsakliga betydelsen av de genomförda studierna är att vissa kloner av stromala celler kan bilda benvävnad och samtidigt tillhandahålla en stromal hematopoetisk mikromiljö för tre skott av benmärgshematopoies samtidigt: erytroid, myeloid och megakaryocytisk, vilket skapar ganska stora plattformar av hematopoetisk vävnad och en del benmassa.

Författarna behandlade sedan frågan om individuella klonogena stromala progenitorcellers förmåga att genomgå dessa typer av celldifferentiering i ett slutet system av diffusionskamrar. Dessutom var det nödvändigt att avgöra om individuella kloner har polypotens eller om manifestationen av differentieringspotential kräver kooperativ interaktion mellan flera kloner med en fast cytodifferentieringsegenskap, vars olika förhållanden bestämmer den preferentiella bildningen av ben-, retikulär- eller broskvävnad. Genom att kombinera två metodologiska metoder - att erhålla monoklonala stammar av benmärgsstromala progenitorceller och transplantera dem till diffusionskamrar - erhöll R. Chailakhyan och medförfattare (2001) resultat som gjorde det möjligt för dem att komma närmare förståelsen av den strukturella organisationen av benmärgsstroma. Transplantation av monoklonala stammar av stromala progenitorceller till O-typkammare resulterade i bildandet av både ben- och broskvävnad, vilket indikerar förmågan hos ättlingar till en enda stromal kolonibildande cell att samtidigt bilda ben- och broskvävnad. Antagandet att ben- och broskvävnad härrör från en gemensam stromal progenitorcell har upprepade gånger framförts. Denna hypotes hade dock ingen korrekt experimentell bekräftelse. Bildningen av ben och brosk i diffusionskamrar var det nödvändiga beviset på existensen av en gemensam progenitorcell för dessa två typer av vävnad bland stromala stamceller i benmärg.

Därefter placerades 29 klonala stammar av andra-tredje passagerna, erhållna från primära kulturer av kaninbenmärg, i diffusionskamrar och implanterades intraperitonealt i homologa djur. Studierna visade att 45 % av de monoklonala benmärgsstammarna har osteogen potential. Nio kammare innehöll uteslutande retikulär vävnad, men den fanns tillsammans med ben- och broskvävnad i ytterligare 13 kammare, vilket utgjorde 76 % av alla stammar. I typ O-kamrar, där differentiering av både ben- och broskvävnad var möjlig, studerades 16 stammar. I fyra kammare (25 %) bildades både ben- och broskvävnad. Det bör återigen noteras att i studierna av R. Chailakhyan et al. (2001) genomgick individuella progenitorceller 31 till 34 fördubblingar inom en cellstam, och deras avkomma bestod av 0,9–2,0 x 10 ^{^} celler. Antalet mitoser som progenitorceller från polyklonala stammar genomgick var praktiskt taget identiskt med det för monoklonala stammar. Utvecklingshastigheten för polyklonala stammar, särskilt i den första fasen av deras bildning, berodde i betydande utsträckning på antalet kolonier som användes för att initiera stammarna. Diploida stammar av humana embryonala fibroblaster (WI-38) bildade också kolonier som skilde sig åt i diameter och cellinnehåll när de återklonades vid 12-15:e fördubblingsnivåerna. Stora kolonier innehållande mer än 103 celler utgjorde endast 5-10%. Med en ökning av antalet delningar minskade andelen stora kolonier. Mono- och polyklonala stammar av benmärgsstromala fibroblaster behöll en diploid uppsättning kromosomer efter 20 eller fler fördubblingar, och tendensen för deras utveckling var jämförbar med dynamiken i utvecklingen av diploida stammar av embryonala fibroblaster. Analys av differentieringspotentialen hos individuella benmärgsstromala progenitorceller, utförd genom transplantation av monoklonala stammar i diffusionskammare, visade att hälften av dem var osteogena. Stora kolonier stod för 10% av deras totala antal. Följaktligen motsvarade antalet osteogena kolonibildande celler ungefär 5 % av deras totala population. Den totala massan av osteogena progenitorceller som identifierades av författarna inkluderade celler som kunde bilda ben- och broskvävnad samtidigt. Dessutom fastställdes det för första gången att dessa två typer av vävnad i en vuxen organism har en gemensam progenitorcell: 25 % av de testade klonerna skapades av sådana celler, och deras antal bland den totala populationen av progenitorceller var minst 2,5 %.

Heterotoptransplantation av individuella kloner av benmärgsfibroblaster har således avslöjat nya aspekter av den strukturella organisationen av populationen av mesenkymala progenitorceller. Stromala progenitorceller har hittats som kan överföra en specifik mikromiljö för alla hematopoetiska groddar samtidigt, vars antal bland de stora klonerna som studerats i olika modeller varierar från 5 till 15% (0,5-1,5% av det totala antalet detekterade progenitorceller). Tillsammans med kloner som överför hela benmärgsmikromiljön finns det progenitorceller som endast är bestämda för osteogenes, vilka, när de överförs i ett öppet system, bildar benvävnad som inte stöder utvecklingen av hematopoes. Deras antal av det totala antalet progenitorceller är 1,5-3%. Vissa av dessa celler kan bilda benvävnad med en begränsad period av självunderhåll. Följaktligen är populationen av stromala progenitorceller heterogen i sin differentieringspotential. Bland dem finns en kategori av celler som påstår sig vara stromala stamceller, kapabla att differentiera i alla tre riktningar som är karakteristiska för benmärgsstromalvävnad, och bilda ben, brosk och retikulär vävnad. De presenterade uppgifterna ger oss hopp om att det, med hjälp av olika cellmarkörer, kommer att vara möjligt att bestämma bidraget från varje typ av stromala celler till organisationen av en specifik mikromiljö och stödet av hematopoesen i Dexter-kulturer.

Egenskaper hos mesenkymala stamceller

På senare år har det fastställts att multipotenta mesenkymala progenitorceller i stationära benmärgskulturer representeras av en begränsad population av små agranulära celler (RS-1-celler) som kännetecknas av en låg kolonibildande kapacitet och avsaknad av uttryck av Ki-67-antigenet specifikt för prolifererande celler. De antigena parametrarna för vilande RS-1-celler skiljer sig från spektrumet av antigener hos snabbt prolifererande engagerade stromala progenitorceller. Det har fastställts att en hög proliferationshastighet av engagerade progenitorceller endast observeras i närvaro av RS-1-celler. I sin tur ökar RS-1-celler sin tillväxthastighet under påverkan av faktorer som utsöndras av de mest mogna derivaten av multipotenta mesenkymala progenitorceller. Det verkar som att RS-1-celler är en underklass av icke-engagerade MSC:er som kan återvinnas. In vitro kännetecknas 5-fluorouracilresistenta benmärgsstromala progenitorceller av lågt RNA-innehåll och högt uttryck av ornitindekarboxylasgenen, en markör för icke-prolifererande celler.

Intensiv proliferation av stromala progenitorceller börjar efter att de fixerats på substratet. I detta fall uttrycks markörprofilen för dåligt differentierade celler: SH2 (TGF-(3)-receptor), SH3 (signalproteindomän), kollagen typ I och III, fibronektin, adhesionsreceptorer VCAM-1 (CD106) och ICAM (CD54), cadherin-11, CD44, CD71 (transferrinreceptor), CD90, CD120a och CD124, men utan uttryck av karakteristiska markörer för hematopoetiska stamceller (CD34, CD14, CD45). Klonal tillväxt gör det möjligt att upprepade gånger passera mesenkymala stamceller med bildandet av ett flertal genetiskt homogena pluripotenta stromala progenitorceller i kultur. Efter 2-3 passager når deras antal 50-300 miljoner. I en kultur med tillräcklig densitet, efter att proliferationen har stoppats, differentierar stromala progenitorceller, till skillnad från hematopoetiska vävnadsfibroblaster, till adipocyter, myocyter, brosk- och benceller. En kombination av tre regulatoriska differentieringssignaler, inklusive 1-metyl-isobutylxantin (en inducerare av intracellulär cAMP-bildning), dexametason (en hämmare av fosfolipaserna A och C) och indometacin (en hämmare av cyklooxygenas, vilket också minskar aktiviteten hos tromboxansyntas), omvandlar upp till 95 % av de mesenkymala progenitorcellerna till adipocyter. Bildningen av adipocyter från omogna stromala element bekräftas genom uttryck av lipoproteinlipasgenen, histokemisk detektion av apolipoproteiner och peroxisomala receptorer. Celler av samma klon under inverkan av TGF-b i ett serumfritt medium skapar en homogen population av kondrocyter. Flerskiktscellkulturen av denna broskvävnad kännetecknas av en utvecklad intercellulär matrix bestående av proteoglykan och typ II-kollagen. I ett näringsmedium med 10 % effekt av ett differentieringssignalkomplex bestående av b-glycerofosfat (en oorganisk fosfatdonator), askorbinsyra och dexametason i samma kultur av stromala progenitorceller leder till bildandet av cellulära aggregat. I sådana celler observeras en progressiv ökning av alkaliskt fosfatasaktivitet och osteopontinnivåer, vilket indikerar bildandet av benvävnad, vars mineralisering av cellerna bekräftas av en progressiv ökning av intracellulärt kalciuminnehåll.

Enligt vissa data kombineras mesenkymala stamcellers förmåga till obegränsad delning och reproduktion av olika typer av celler i den mesenkymala differentieringslinjen med en hög grad av plasticitet. När de introduceras i hjärnans ventriklar eller vita substans migrerar mesenkymala stamceller till nervvävnadens parenkym och differentierar till derivat av glia- eller neuronala cellinjer. Dessutom finns det information om transdifferentiering av MSC till hematopoetiska stamceller både in vitro och in vivo. En mer djupgående analys i vissa studier har fastställt en exceptionellt hög plasticitet hos MSC, vilket manifesteras i deras förmåga att differentiera till astrocyter, oligodendrocyter, neuroner, kardiomyocyter, glatta muskelceller och skelettmuskelceller. Ett antal studier om MSC:s transdifferentieringspotential in vitro och in vivo har fastställt att multipotenta mesenkymala progenitorceller av benmärgsursprung terminalt differentierar till cellinjer som bildar ben-, brosk-, muskel-, nerv- och fettvävnad, samt senor och stroma som stöder hematopoesen.

Andra studier har dock inte kunnat visa några tecken på begränsning av pluripotensen hos det mesenkymala stamcellsgenomet och progenitorpopulationerna av stromala celler, även om mer än 200 kloner av MSC isolerade från en primärkultur studerades för att testa eventuell pluripotens hos stromala celler. Den överväldigande majoriteten av klonerna in vitro behöll förmågan att differentiera i osteogena, kondrogena och adipogena riktningar. När man uteslöt sannolikheten för migration av mottagarceller genom transplantation av mesenkymala stamceller under njurkapseln eller i diffusionskammare, visade det sig att stromala progenitorceller in situ behåller en heterogen fenotyp, vilket indikerar antingen avsaknaden av restriktionsfaktorer i transplantationszonen eller avsaknaden av MSC-pluripotens som sådan. Samtidigt är förekomsten av en sällsynt typ av somatiska pluripotenta stamceller, vilka är vanliga prekursorer till alla vuxna stamceller, tillåten.

Multipotensen, men inte pluripotensen, hos äkta mesenkymala stamceller, vilka utgör en mycket liten andel av benmärgscellerna och kan proliferera under vissa förhållanden under in vitro-odling utan att differentiera, bevisas av deras inducerade bindning till ben-, brosk-, fett- och muskelvävnadsceller, såväl som tenocyter och stromala element som stöder hematopoiesen. Som regel provocerar långvarig exponering för ett odlingsmedium med fetalt kalvserum frisättningen av MSC till engagerade stromala progenitorceller, vars avkomma genomgår spontan terminal differentiering. In vitro är det möjligt att uppnå riktad bildning av osteoblaster genom att tillsätta dexametason, ß-glycerofosfat och askorbinsyra till konditioneringsmediet, medan en kombination av dexametason- och insulindifferentieringssignaler inducerar bildandet av adipocyter.

Det har fastställts att benmärgs-MSC:er initialt differentierar till fibroblastliknande mesenkymala stamceller under vissa odlingsförhållanden, innan de inträder i stadiet av terminal differentiering. Derivat av dessa celler deltar in vivo i bildandet av ben, brosk, senor, fett- och muskelvävnad, såväl som stroma som stöder hematopoesen. Många författare förstår termen "multipotenta mesenkymala progenitorceller" som både MSC:erna själva och dedikerade stromala progenitorceller från benmärg och mesenkymala vävnader. Klonal analys av multipotenta mesenkymala progenitorceller av benmärgsursprung visade att drygt en tredjedel av alla kloner differentierar till osteo-, kondro- och adipocyter, medan cellerna från de återstående klonerna endast har osteogen potential och endast bildar kondro- och osteocyter. En klon av multipotenta mesenkymala progenitorceller såsom BMC-9 differentierar under lämpliga mikromiljöförhållanden till celler med fenotypen och funktionella egenskaper hos inte bara osteoblaster, kondrocyter och adipocyter, utan även stromala celler som stöder hematopoiesen. En klon av RCJ3.1-celler isolerade från råttfosters benmärg differentierar till mesenkymala celler av olika fenotyper. Under den kombinerade verkan av askorbinsyra, b-glycerofosfat och dexametason bildar de cellulära elementen i denna klon först multinukleära myocyter, och sedan, sekventiellt, adipocyter, kondrocyter och cellöar av mineraliserad benvävnad. Populationen av granulära celler från råttfosters periosteum motsvarar odelade multipotenta mesenkymala progenitorceller, eftersom den kännetecknas av en låg proliferationshastighet, inte uttrycker differentieringsmarkörer och under odlingsförhållanden differentierar till kondro-, osteo- och adipocyter, såväl som glatta muskelceller.

Det bör således erkännas att frågan om pluri- eller multipotensen hos mesenkymala stamcellers genom förblir öppen, vilket följaktligen också påverkar idéerna om stromala progenitorcellers differentieringspotential, vilken inte heller har fastställts definitivt.

En experimentellt bevisad och viktig egenskap hos mesenkymala stamceller är deras förmåga att lämna vävnadsnischen och cirkulera i den allmänna blodomloppet. För att aktivera det genetiska differentieringsprogrammet måste sådana cirkulerande stamceller komma in i lämplig mikromiljö. Det har visats att med systematisk introduktion av MSC i blodomloppet hos mottagardjur implanteras omogna celler i olika organ och vävnader, och differentieras sedan till blodkroppar, myocyter, adipocyter, kondrocyter och fibroblaster. Följaktligen sker signalreglerande interaktioner i lokala vävnadszoner mellan odedikerade och dedikerade stromala progenitorceller, såväl som mellan dem och de omgivande mogna cellerna. Det antas att differentiering induceras av parakrina reglerande faktorer av mesenkymalt och icke-mesenkymalt ursprung (tillväxtfaktorer, eikosanoider, extracellulära matrixmolekyler), vilka ger rumsliga och tidsmässiga kopplingar i mikromiljön hos multipotenta mesenkymala progenitorceller. Därför bör lokala skador på mesenkymvävnad leda till bildandet av zoner i mikromiljön hos multipotenta mesenkymala progenitorceller som kvalitativt skiljer sig från komplexet av regleringssignaler i intakta vävnader, där fysiologiska snarare än reparativa regenereringsprocesser sker. Denna skillnad är extremt viktig när det gäller specialiseringen av den cellulära fenotypen i den normala och skadeinducerade mikromiljön.

Enligt koncepten är det här som mekanismerna för den grundläggande skillnaden mellan de två kända processerna - fysiologisk regenerering och inflammatorisk proliferation - är inbäddade. Den första av dem slutar med återställandet av vävnadens specialiserade cellulära sammansättning och dess funktion, medan resultatet av implementeringen av proliferationsprocessen är bildandet av mogna bindvävselement och förlusten av funktion i den skadade vävnadszonen. För att utveckla optimala program för användning av multipotenta mesenkymala progenitorceller inom regenerativ-plastisk medicin är det därför nödvändigt med en grundlig studie av egenskaperna hos mikromiljöfaktorers inverkan på differentieringen av MSC.

Beroendet av stamcellsavdelningens struktur på cellulära para- och autokrina regulatorer, vars uttryck moduleras av externa signaler, råder ingen tvekan om. Bland de regulatoriska faktorernas funktioner är de viktigaste kontrollen av asymmetrisk delning av MSC och uttrycket av gener som bestämmer stadierna av delningar och antalet celldelningar. Externa signaler, som vidare utveckling av MSC är beroende av, tillhandahålls av deras mikromiljö. I ett omoget tillstånd prolifererar MSC under lång tid, samtidigt som de bibehåller förmågan att differentieras till linjer av adipocyter, myofibroblaster, hematogent vävnadsstroma, brosk- och benceller. Det har fastställts att en begränsad population av CD34-negativa stromala cellulära element som cirkulerar i blodet återvänder från den allmänna blodomloppet till benmärgsstroma, där de omvandlas till linjer av CD34-positiva hematopoetiska stamceller. Dessa observationer tyder på att recirkulation av progenitormesenkymala celler i blodomloppet upprätthåller vävnadsbalansen av stromala stamceller i olika organ genom att mobilisera en gemensam pool av omogna stromala element i benmärgen. Differentiering av MSC till celler med multipla mesenkymala fenotyper och deras deltagande i regenerering eller reparation av ben, brosk, fettvävnad och senor in vivo har bevisats med hjälp av adoptiva överföringsmodeller i försöksdjur. Enligt andra författare kombineras avlägsen migration av MSC längs kärlbädden med kortdistans- eller lokal förflyttning av multipotenta mesenkymala progenitorceller i vävnaden under broskreparation, muskelregenerering och andra återställande processer.

Lokala stamreserver i stromalvävnadsbasen fungerar som en cellkälla i processerna för fysiologisk vävnadsregenerering och fylls på genom fjärrtransport av MSC när stamresurserna i stromalvävnaden förbrukas. Men vid behov av akut mobilisering av reparativ cellpotential, till exempel vid polytrauma, deltar hela MSC-echelonen i processerna för reparativ regenerering, och mesenkymala progenitorceller i benmärgen rekryteras till periferin genom det allmänna blodflödet.

Mesenkymal stamcellstransplantation

Vissa paralleller kan spåras mellan processerna för fysiologisk vävnadsregenerering och deras bildning under intrauterin utveckling. Vid mänsklig och däggdjurs embryogenes sker bildandet av olika typer av specialiserade celler från ekto-, meso- och endodermala poolen av groddlager, men med obligatoriskt deltagande av mesenkymet. Det lösa cellulära nätverket av embryonal mesenkymal vävnad utför ett flertal reglerande, metaboliska, ramverksmässiga och morfogenetiska funktioner. Läggningen av provisoriska organ sker först efter kondensationen av mesenkymet på grund av den klonogena tillväxten av progenitorceller, vilka genererar de primära morfogenetiska signalerna för organogenes. Stromala derivat av det embryonala mesenkymet skapar det cellulära ramverket för provisoriska organ och utgör grunden för deras framtida energiplastiska försörjning på grund av tillväxten av primära blod- och lymfkärl. Med andra ord uppstår de stromala elementen i den mikrocirkulerande enheten hos fosterorgan före bildandet av deras strukturella och funktionella enheter. Dessutom ger aktiv migration av mesenkymala celler under organogenesen rumslig orientering av utvecklande organ genom att markera deras volymgränser genom begränsning av homeotiska Hox-typer. Det stromala ramverket fungerar också som bas för sammansättningen av strukturella och funktionella enheter i parenkymala organ, vilka ofta inkluderar morfogenetiskt och funktionellt helt olika celler. Följaktligen är mesenkymets funktioner primära under embryogenesen och realiseras genom generering av regleringssignaler som aktiverar regional proliferation och differentiering av progenitorceller. Embryonala mesenkymceller producerar tillväxtfaktorer såsom HGF-b, HGF-b, CSF, för vilka parenkymala progenitorceller har motsvarande receptorer. I differentierad mogen vävnad hos en vuxen organism genererar det stromala nätverket av celler också signaler för att upprätthålla livskraften och proliferationen av progenitorceller av icke-mesenkymalt ursprung. Spektrumet av stromala regulatoriska signaler vid postnatal ontogenes är dock annorlunda (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) och syftar till att säkerställa fysiologisk regenerering eller reparation av skadade vävnadszoner. Dessutom är de spektrala egenskaperna hos stromala regulatoriska faktorer olika i varje vävnadstyp och även inom ett organ. I synnerhet förekommer hematopoies och lymfopoes med proliferation och differentiering av hematopoetiska och immunkompetenta celler endast i vissa organ, inom vilkas gränser den stromala mikromiljön verkar, vilket ger förutsättningar för mognad av hematopoetiska och lymfoida celler. Hematopoetiska och lymfoida cellers förmåga att återbefolka ett givet organ, proliferera och mogna i dess mikrostrukturella nischer beror på mikromiljöns regulatoriska faktorer.

Bland komponenterna i den extracellulära matrisen som multipotenta mesenkymala progenitorceller producerar bör fibronektin, laminin, kollagen och proteoglykaner, samt CD44 (hyaluronan- och osteopontinreceptor), nämnas, vilka spelar en viktig roll i att organisera intercellulära interaktioner och bilda den extracellulära matrisen i benmärg och benvävnad. Det har bevisats att multipotenta mesenkymala progenitorceller i benmärg skapar en stromal mikromiljö som ger induktiva och reglerande signaler inte bara till MSC, utan även till hematopoetiska progenitorceller och andra icke-mesenkymala stamceller i benmärgen. Det är känt att MSC:ers deltagande i hematopoiesen bestäms av deras förmåga att differentiera till stromala celler som stöder hematopoiesen, och denna instruktiva signal tas emot av MSC direkt från hematopoetiska stamceller. Det är därför nätverket av stromala progenitorceller i kultur fungerar som en matarbas för utvecklingen av alla kloner av hematopoetiska celler.

I en mogen organism är intensiteten av hemo- och lymfopoesen i ett tillstånd av dynamisk jämvikt med "förbrukningen" av mogna blodkroppar och immunsystemceller i periferin. Eftersom stromala celler i benmärgen och lymfoida organ förnyas extremt sällan, sker ingen betydande omstrukturering av stromala strukturer i dem. Systemet kan tas ur dynamisk jämvikt genom mekanisk skada på vilket som helst av hemo- eller lymfopoesorganen, vilket leder till enhetliga sekventiella förändringar som inte bara och inte så mycket berör de hematopoetiska eller lymfoida elementen som de stromala strukturerna i det skadade organet. I processen med reparativ regenerering bildas först den stromala basen, som sedan återbefolkas av hematopoetiska eller immunkompetenta celler. Detta länge kända faktum gör posttraumatisk regenerering till en bekväm modell för att studera den stromala mikromiljön i hematopoetiska organ. I synnerhet används mekanisk tömning av märghålan i rörformiga ben för att studera reparativ regenerering av benmärg - skrapning, vilket möjliggör snabb och effektiv avlägsnande av hematopoetisk vävnad från dynamisk jämvikt. Vid studier av processerna för reparativ regenerering av de hematopoetiska och stromala komponenterna i benmärg efter mekanisk tömning av märghålan i tibia hos marsvin, fann man att det inte finns någon direkt korrelation mellan indexen för regenerering av hematopoetiska och stromala celler (antalet hematopoetiska celler, koncentrationen och antalet stromala progenitorceller). Dessutom visade det sig att en ökning av populationen av stromala progenitorceller sker tidigare efter skrapning, och de stromala fibroblasterna själva blir fosfataspositiva, vilket är typiskt för osteogen vävnad. Det har också fastställts att skrapning av 3–5 rörformiga ben leder till tillväxt av denna cellpopulation i benmärgen hos icke-opererade ben och även i mjälten, som hos marsvin är ett uteslutande lymfopoietiskt organ.

Den morfologiska bilden av reparativa processer i benmärgen hos kurerade skenben hos marsvin motsvarar i allmänhet de data som beskrivs i litteraturen som erhållits i experiment på djur av andra arter, och dynamiken i förändringar som sker efter avlägsnande av hematopoetisk vävnad är densamma för alla djurarter och skillnaden gäller endast tidsparametrar. Morfologiskt består fasordningen för hematopoetisk återställning i den tömda märghålan av successiva processer för blodproppsorganisation, bildning av grov fibrös benvävnad, dess resorption, utveckling av sinusoider och bildning av retikulärt stroma, som därefter återbefolkas av hematopoetiska element. I detta fall ökar antalet hematopoetiska stamceller i processen för regenerering av benmärgsvävnad parallellt med ökningen av innehållet av hematopoetiska stamceller.

Yu. Gerasimov och medförfattare (2001) jämförde förändringar i antalet hematopoetiska celler och antalet stromala progenitorceller i enskilda faser av regenereringsprocessen. Det visade sig att kvantitativa förändringar i benmärgsceller i kurerat ben motsvarar dynamiken i regenereringens morfologiska egenskaper. Författarna associerar minskningen av cellinnehållet i regenereringen under de första tre dagarna med döden av hematopoetiska celler på grund av den ogynnsamma effekten av mikromiljön som skapas av den prolifererande retikulära vävnaden i den bevarade benmärgen i epifysregionen, samt med bildandet av osteoidvävnadsfokus i den senare och kärlskador under skrapningen. På den 7:e-12:e dagen sammanfaller en ökning av nivån av kärnförsedda celler med uppkomsten av individuella fokus för myeloid hematopoies i zonerna för proliferation av stromala element. På den 20:e dagen uppträder betydande områden med regenererad benmärg och välutvecklade bihålor, vilket åtföljs av en signifikant ökning av det totala antalet celler. Antalet hematopoetiska element under denna period är dock 68 % av kontrollnivån. Detta överensstämmer med tidigare publicerade data som visar att antalet hematopoetiska celler efter skrapning når normen först på den 35:e–40:e dagen efter operationen.

Under den tidiga posttraumatiska perioden är den huvudsakliga källan för återställandet av hematopoesen lokala cellulära element som bevarats under skrapningen. I senare stadier är den huvudsakliga källan för regenerering av benmärgens hematopoetiska vävnad stamceller som återbefolkar fria stromala zoner. När det gäller enskilda kategorier av stromala celler (endoteliala, retikulära och osteogena) är de källor som säkerställer deras bildning under reorganisationen av benmärgshålan fortfarande oklara. Resultaten av studien av Yu. V. Gerasimov och medförfattare (2001) indikerar att i benmärg som bevarats efter skrapning är koncentrationen av celler som bildar fibroblasterkolonier signifikant högre än i normal benmärg. Författarna anser att skrapning resulterar i en mer intensiv selektiv utspädning av hematopoetiska celler jämfört med kolonibildande stromala celler, vilka deltar i bildandet av stroma och är starkare associerade med dess huvudsubstans än hematopoetiska celler.

Dynamiken i förändringen i antalet celler som bildar fibroblastkolonier korrelerar med intensiteten av osteogenesprocesser, efterföljande resorption av bentrabekler och bildandet av retikulärt stroma, vilket är befolkat av hematopoetiska celler. De flesta av de stromala progenitorcellerna bildar under de specificerade regenereringsperioderna grov fibrös benvävnad och retikulärt stroma. Vid lårbensfrakturer under förhållanden med långvarig osteosyntes ökar koncentrationen och antalet celler som bildar fibroblastkolonier på den 5:e dagen i regenereringszonen, och under perioden med intensiv benbildning ökar deras antal med 6 gånger. Det är känt att benmärgsceller som bildar fibroblastkolonier har osteogena egenskaper. Antalet stromala progenitorceller ökar innan det kurerade benmärgsterritoriet etableras av hematopoetiska celler. Detta stämmer väl överens med data om att stromala celler ger bildandet av en hematopoetisk mikromiljö. Tydligen motsvarar skapandet av en hematopoetisk mikromiljö en viss nivå av stromal vävnadsregenerering, och antalet hematopoetiska celler ökar med expansionen av den stromala plattformen som är lämplig för hematopoies.

Av största intresse är författarnas data att antalet stromala progenitorceller i de avlägsna delarna av skelettet omedelbart efter skrapning ökar. Från och med den sjätte timmen och fram till och med den tjugonde dagen observeras en mer än tvåfaldig ökning av både koncentrationen och antalet celler som bildar fibroblastkolonier i den kontralaterala tibia. Mekanismen för detta fenomen är förmodligen förknippad med det faktum att massiv benmärgsskada leder till bildandet av ett stort antal blodproppar med samtidig destruktion av ett betydande antal blodplättar och frisättning av trombocytderiverad tillväxtfaktor (PDGF) i blodet, vilket är känt för att orsaka proliferation av celler som bildar fibroblastkolonier belägna i kroppen utanför den proliferativa poolen. I experiment på kaniner främjar lokal administrering av MSC återställningen av broskvävnad i den kirurgiskt skadade knäleden, vilket kan vara förknippat med bildandet av kondrocyter som härrör från de injicerade MSC:erna. Reparativ regenerering av bendefekter hos laboratorieråttor förbättras dock avsevärt genom att använda mesenkymala stamceller inneslutna i ett keramiskt ramverk. Därför kan man anta att om inte RBOC, så utövar någon annan faktor som härrör från skadade stromala celler en avlägsen stimulerande effekt på proliferationen av mesenkymala progenitorceller i intakta benmärgszoner och stimulerar deras migration till området med benmärgsdefekter. Detta motsägs i sin tur av litteraturdata från tidigare år som indikerar att stromala celler som ansvarar för mikromiljön, till skillnad från hematopoetiska celler, inte är kapabla till migration och härrör från lokala källor.

Resultaten av studien av Yu. Gerasimov och medförfattare (2001) indikerar dock att mekaniskt trauma inte bara orsakar en kraftig omstrukturering av stromalvävnaden i det kurerade benet, utan också signifikanta förändringar i stroma i avlägsna intakta ben, dvs. det finns ett systemiskt svar från stromalvävnaden på lokalt trauma. Dessutom, när polytrauma tillfogas - multipel kurettage - förstärks denna reaktion och observeras inte bara i det opererade benet och avlägsna delar av skelettet, utan även i lymfoida organ, särskilt i mjälten. Mekanismen för ett sådant systemiskt svar från stromalvävnaden i benmärgen och mjälten på lokalt trauma och polytrauma är fortfarande okänd. Det antas att denna process är förknippad med verkan av en humoral faktor som utsöndras av det mesenkymala stroma i benmärgens märghåla. Möjligheten för produktion av en organospecifik humoral faktor som är ansvarig för proliferationen av celler som bildar fibroblastkolonier genom stromala celler i benmärg och mjälte bevisas av data om deras kolonistimulerande aktivitet i monolagerkulturer av benmärg.

I detta avseende är det värt att notera att vid systemisk administrering av multipotenta mesenkymala progenitorceller återbefolkar deras derivat inte bara benmärg utan även andra vävnader, vilket används särskilt för genterapi. Det har visats att vid intravenös administrering av stora mängder MSC med ett vildtypsgenom till möss med en mutation i kollagen I-genen ersätter donatorceller upp till 30 % av cellerna i ben- och broskvävnaden hos mottagarna, och transfekterade musmesenkymala stamceller som utsöndrar humant IL-3 stöder effektivt hematopoiesen i 9 månader vid samtidig administrering med humana hematopoetiska stamceller till immunbristfälliga möss.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetisk modifiering av mesenkymala stamceller

Bland framgångarna med experimentell genetisk modifiering av MSC är det värt att notera transfektionen av faktor IX-genen in i humana MSC med efterföljande överföring av transfektanta celler till immunbristfälliga möss, vilket leder till uppkomsten av antihemofil faktor B i blodet under 8 veckor efter transplantation. I detta experiment utfördes posttranslationell modifiering av faktor IX med y-glutamylkarboxylas i de transfekterade cellerna. Transduktion av MSC med en retroviral vektor som kodar för human faktor IX var mindre framgångsrik - efterföljande administrering av dessa celler till en hund med hemofili B gav en terapeutisk nivå av faktor IX, vilket bibehöll normal intensitet av koagulationshemostasen, i endast 12 dagar.

Transplantation av mesenkymala stamceller till hjärnparenkym hos djur har visat att omogna donatorceller transformeras till både neuronala och gliapopulationer. Inplantning av neuronala derivat av frisk donatormesenkymal vävnad gör det teoretiskt möjligt att korrigera genetiska avvikelser i hjärnmetabolismen hos patienter med Gauchers sjukdom och andra störningar i lipid-, gangliosid- eller kolhydratmetabolismen.

Den experimentella sökningen efter förhållanden för transdifferentiering av stromala stamceller från benmärg till neurala och levervävnadsprogenitorceller pågår. Forskarnas uppmärksamhet är inriktad på kombinationer av differentieringsinducerare och speciella konditionerade medier. För att isolera den primära kulturen av stromala celler sås benmärgsceller som tvättats och resuspenderats i DMEM/F12 (1/1) odlingsmedium med 10 % fetalt kalvserum ut vid en densitet av 200 000/cm2. Efter 24 timmar avlägsnas icke-vidhäftande celler och fibroblastliknande celler som fästs vid plasten odlas i en vecka. För differentiering av benmärgsstromala celler till neuroblaster används ett konditionerat medium erhållet genom tre dagars odling av den primära kulturen av musembryonala fibroblaster, samt DMEM/F12-medium (1/1) med 2 % fetalt kalvserum och tillsats av 20 ng/ml NF eller 10-6 M retinsyra (neuroinducerare som används för neural differentiering av mus- och humana embryonala stamceller). Differentiering av benmärgsstromala celler till hepatocytprekursorceller induceras i ett konditionerat medium som skapats som ett resultat av tre dagars odling av den primära kulturen av musembryonala leverceller i DMEM/F12-medium (1/1) med tillsats av 10 % fetalt kalvserum.

Här bör det återigen noteras att de kolonibildande cellerna i benmärgsstroma är heteromorfa och kan delas in i två typer. Den första typen innefattar fibroblastliknande celler som bildar filopodier med stora kärnor och en eller två nukleoler. Den andra typen representeras av små spindelformade celler. Vid odling av celler av båda typerna i ett konditionerat medium erhållet på ett matarlager av primära musembryonala fibroblaster, uppträder celler som liknar neuroblaster i kulturen på den 3:e till 4:e dagen. I detta skede har de oftast en spindelformad form med en eller två långa utskott som slutar i filopodier. Mindre vanliga är pyramidala eller stellatformade celler med korta dendriter. Dendriterna hos vissa neuroblaster har karakteristiska expansioner (tillväxtknoppar) och grenar i sin distala del, medan andra har distinkta tillväxtkottar med filopodier, genom vilka dendriterna växer. Liknande morfologiska egenskaper (knoppar och tillväxtkottar med filopodier) som är inneboende i neuroblaster som differentierar till neuroner har beskrivits i detalj i studier om neurogenes. Baserat på detta drar vissa författare slutsatsen att cellerna de fann i kulturen är neuroblaster. I synnerhet fann E. Shchegelskaya och medförfattare (2002) efter att ha odlat en primärkultur av stromala celler i två veckor i ett konditionerat medium som byttes var tredje till fjärde dag att några av cellerna prolifererade medan de bibehöll ett odifferentierat tillstånd. Utåt sett liknade sådana celler fibroblaster och detekterades i kulturen tillsammans med differentierande neuroblaster. Majoriteten av cellerna (cirka 80 %) befann sig i olika stadier av differentiering till celler i nervvävnaden, främst till neuroner. De dendritiska utskotten i dessa celler var i nära kontakt med varandra, så att cellerna gradvis bildade sektioner av nervnätverket på substratet i form av långa flercelliga strängar. Neuroblasternas dendritiska processer blev betydligt längre, vissa av dem översteg själva neuronkroppens längd med 8-10 gånger. Andelen pyramidala och stellatformade celler ökade gradvis. Dendriterna i stellatformade celler förgrenade sig. Enligt författarna motsvarar den senare differentieringen av pyramidala och stellatformade celler jämfört med spindelformade celler sekvensen av stadier i normal neurogenes hos djur. Som ett resultat drar författarna slutsatsen att benmärgsstromala stamceller genomgår inducerad neurogenes, under vilken alla tre huvudtyper av neuroner bildas från neuroblaster in vitro. Nervcellsprekursorer detekterades också under odling av benmärgsstromala celler i 3-4 dagar i ett medium med 2% fetalt serum och 20 ng/ml LIF. Men i detta fall delade sig stamcellerna mycket långsamt, neuroblastdifferentiering inträffade endast i 30% av fallen och de bildade inte neuronala nätverk. Med retinsyra som en av inducerarna av nervcellsdifferentiering erhöll författarna upp till 25-30% av nervcellerna i kulturen,med övervägande gliaelement - astrocyter och oligodendrocyter. Neuroner utgjorde endast en tredjedel av alla nervceller, även om de representerades av alla tre typer: spindelformade, pyramidala och stellatceller. På den sjätte dagen av odling av stromala celler i ett medium med retinsyra blev nervcellerna mer differentierade, och axoner hittades i enskilda pyramidala neuroner, vilka vid normal neuroontogenes uppträder senare än bildandet av dendritiska processer. Enligt författarna har retinsyrainduktionsmetoden, trots det låga utbytet av nervceller, sina fördelar: oligodendrocyter och astrocyter utför myeliniserande och näringsmässiga funktioner under tillväxten av dendriter och axoner och är nödvändiga för normal bildning av nervvävnad. Därför är det bättre att använda en suspension av neuroner berikade med gliaceller för reparation av dess skadade områden in vivo.

I den andra experimentserien försökte författarna inducera differentiering av benmärgsstromala celler till leverceller. Efter tre dagars odling av benmärgsstromala stamceller i ett konditionerat medium erhållet genom inkubering av musembryonala hepatocyter, hittades stora, sfäriska celler, ofta binukleära, med cytoplasmatiska inneslutningar av varierande storlek. Dessa celler befann sig i olika differentieringsstadier och skilde sig åt i storlek, antal kärnor och inneslutningar i cytoplasman. Glykogen detekterades i de flesta av dessa celler, på basis av vilket författarna identifierade dem som hepatocytprekursorceller. Eftersom inga celler liknande neuroblaster hittades i kulturen, drogs slutsatsen att det konditionerade mediet som erhölls som ett resultat av odling av embryonala hepatocyter saknade differentieringsfaktorer för nervceller och, omvänt, innehöll faktorer som inducerar differentiering av benmärgsstromala celler till hepatocytprekursorceller. Sammanfattningsvis föreslår författarna förekomsten av pluripotens i benmärgsstromala celler, eftersom de differentierar in vitro till nerv- eller levervävnadsceller beroende på det specifika konditionerade mediet och de inducerare som används.

Vissa studier har faktiskt korrekt visat differentieringen av benmärgsstromala celler till kardiomyocyter, brosk, ben och nervvävnadsceller. Det finns bevis för att det bland benmärgsceller finns populationer av stamceller som kan differentieras till hepatocyter. Mot bakgrund av dessa data kan resultaten av ovanstående experiment på möss fortfarande betraktas som ytterligare bekräftelse på förekomsten i benmärgen av pluripotenta mesenkymala stamceller som kan differentieras till celler i olika vävnader hos en vuxen organism.

Mesenkymal stamcellstransplantation

Inom klinisk transplantation kan humana mesenkymala stamceller användas för att säkerställa expansionen av hematopoetiska stamceller, såväl som deras tidiga, förutbestämda avkommor. I synnerhet accelererar introduktionen av autologa hematopoetiska stamceller och MSC till cancerpatienter efter högdoskemoterapi återställningen av antalet neutrofiler och blodplättar i perifert blod. Allo- och autologa transplantationer av mesenkymala stamceller används för att behandla multipelt myelom, aplastisk anemi och spontan trombocytopeni - sjukdomar associerade med en primär defekt i stroma i hematopoetisk vävnad. Effektiviteten av cellterapi vid onkohematologisk patologi är i många fall högre vid samtidig introduktion av stromala och hematopoetiska stamceller, vilket manifesteras av en minskning av den postoperativa perioden för hematopoetisk återställning, en minskning av antalet dödliga utfall på grund av icke-selektiv destruktion av regionala och cirkulerande cancerceller, där patientens egna hematopoetiska stamceller också dör. Möjligheterna att använda MSC och andra multipotenta mesenkymala progenitorceller i klinisk praxis beror på den relativa lättheten att utvinna dem från benmärgsaspirat, expansion i kultur och transfektion av terapeutiska gener. Samtidigt kan lokal implantation av multipotenta mesenkymala progenitorceller användas för att kompensera för lokala vävnadsdefekter, och vid systemiska dysfunktioner i vävnader av mesenkymalt ursprung är deras introduktion i den allmänna blodomloppet inte utesluten.

Författarna till verk där möjligheterna för användning av MSC för lokal, systemisk transplantation och genterapi analyseras ur stromal cellbiologisk synvinkel är mer försiktiga i sitt resonemang. Postnatal benmärg betraktas traditionellt som ett organ bestående av två huvudsystem av tydligt definierade cellinjer - själva hematopoetiska vävnaden och det stödjande stroma som är associerat med det. Därför betraktades mesenkymala stamceller från benmärg initialt uteslutande som en källa till stromal bas för produktion av reglerande faktorer i den hematopoetiska mikromiljön. Sedan riktades forskarnas uppmärksamhet mot att studera MSC:s roll som en stamkälla för skelettvävnader. De senaste uppgifterna indikerar en oväntad potential för differentiering av benmärgsstromala celler med bildandet av nerv- eller muskelvävnad. Med andra ord uppvisar mesenkymala stamceller transgermal plasticitet - förmågan att differentiera till celltyper som fenotypiskt är orelaterade till cellerna i den ursprungliga vävnaden. Samtidigt förblir vissa aspekter av biologin hos benmärgsstromala celler oklara och olösta, både i allmänna biologiska termer och i individuella detaljer, inklusive identifiering, natur, ursprung, utveckling och funktion in vivo hos benmärgsstromala celler, såväl som den tillåtna differentieringspotentialen ex vivo och möjligheterna till terapeutisk användning in vivo. De data som erhållits om potentialen hos MSC, liksom resultaten av studier av den regenerativa potentialen hos andra stamceller, står i skarp motsägelse av de dogmer som etablerats inom biologin.

När de odlas vid låg densitet bildar benmärgsstromala stamceller distinkta kolonier, där var och en härstammar från en enda progenitorcell. Procentandelen stromala progenitorceller i kärnförsedda benmärgsceller, bestämd av kolonibildande förmåga, är starkt beroende av både odlingsförhållanden och MSC-arter. Till exempel är närvaron av bestrålade benmärgsmatarceller och serum i kulturen absolut nödvändig hos gnagare för att erhålla maximalt antal stromala progenitorceller, medan hos människor är den kolonibildande effektiviteten hos mesenkymala stamceller oberoende av både mataren och odlingsmediet. Antalet kända mitogena faktorer som stimulerar stromala progenitorcellers proliferation är begränsat. Dessa inkluderar PDGF, EGF, FGF, TGF-b och IGF1. Under optimala odlingsförhållanden kan polyklonala MSC-linjer motstå mer än 50 celldelningar in vitro, vilket gör det möjligt att erhålla miljarder benmärgsstromala celler från 1 ml av dess aspirat.

Populationen av benmärgsstromala celler är emellertid heterogen, vilket manifesteras av både variation i kolonistorlekar, olika hastigheter för deras bildning och en variation i cellmorfologi, som täcker intervallet från fibroblastliknande spindelformade till stora platta celler. Under utvecklingen av sådana kulturer noteras även fenotypisk heterogenitet efter 20 dagar. Vissa kolonier kännetecknas av högt uttryck av alkaliskt fosfatas, andra uttrycker det inte alls, och kolonier av den tredje typen är fosfataspositiva i den centrala regionen och fosfatasnegativa i periferin. Enskilda kolonier bildar noduler av benvävnad (starten av matrixmineralisering markeras genom färgning med alizarinrött eller för kalcium enligt Van Koss). I andra kolonier sker fettansamling, identifierad genom G-färgning med oljerött. Mer sällan bildar kolonier av mesenkymala stamceller brosk färgat med Alcianblått).

Efter ektopisk transplantation till försöksdjur bildar polyklonala MGK-linjer ektopiskt ben med ett retikulärt stroma associerat med myelopoies och adipocyter, och, mer sällan, med broskvävnad. När monoklonala linjer av benmärgsstromala celler transplanteras observeras chimärism i vissa fall, där de novo-benet består av benvävnadsceller, innehåller stroma och adipocyter av donatorursprung, medan cellerna i den hematopoetiska linjen och kärlsystemet härstammar från mottagaren.

Resultaten av dessa studier bekräftar stamnaturen hos den benmärgsstromala progenitorcell från vilken den klonala linjen härleddes. De indikerar också att inte alla celler som är klonogena i kultur är verkligt multipotenta stamceller. Vissa forskare tror, och vi delar deras åsikt, att den mest tillförlitliga informationen om den verkliga differentieringspotentialen hos individuella kloner endast kan erhållas in vivo efter transplantation, och inte genom att bestämma fenotypen av deras derivat in vitro. Uttrycket i kultur av fenotypiska markörer för osteo-, kondro- eller adipogenes (bestämt med mRNA eller genom histokemiska tekniker) och till och med produktionen av mineraliserad matrix återspeglar inte graden av pluripotens hos en enskild klon in vivo. Därför är identifiering av stamceller i en grupp stromala celler endast möjlig a posteriori, under lämpliga förhållanden för en biologisk transplantationsanalys. I synnerhet observeras kondrogenes mycket sällan i öppna transplantationssystem, medan broskbildning är långt ifrån ovanlig i slutna system såsom diffusionskammare eller in vitro-mikromasskulturer av stromala celler, där lokalt lågt syretryck uppnås, vilket främjar bildandet av broskvävnad. Därför påverkar även transplantationstekniken, såväl som ospecifika in vitro-odlingsförhållanden, avsevärt MSC-differentieringens omfång.

Experimentell transplantation under specificerade experimentella förhållanden är guldstandarden för att bestämma differentieringspotentialen hos benmärgsstromala celler och en nyckelfaktor i deras identifiering. Historiskt sett är studier av benmärgsstromala celltransplantationer förknippade med det allmänna problemet med benmärgstransplantation. Det har fastställts att den hematopoetiska mikromiljön skapas genom transplantation av benmärgsstromala cellinjer och ger ektopisk utveckling av hematopoetisk vävnad i transplantationszonen. Ursprunget till mikromiljön från donatorn och den hematopoetiska vävnaden från värden gör att vi kan betrakta ektopiskt ben som en verkligt "inverterad" benmärgstransplantation. Lokal transplantation av benmärgsstromala celler främjar effektiv korrigering av bendefekter, mer uttalad än vid spontan reparativ regenerering. Flera prekliniska studier på experimentella modeller har övertygande visat möjligheten att använda benmärgsstromala celltransplantationer inom ortopedi, även om det mest noggranna arbetet och analysen krävs för att optimera dessa metoder, även i de enklaste fallen. I synnerhet har de optimala förhållandena för expansion av osteogena stromala celler ex vivo ännu inte fastställts, strukturen och sammansättningen av den ideala bäraren, liksom antalet celler som är nödvändiga för volumetrisk benregenerering, förblir outvecklade.

Förutom användningen av ex vivo expanderade benmärgsstromala celler för regenerering av vävnader av mesenkymalt ursprung, öppnar den oortodoxa plasticiteten hos MSC potentiella tillämpningar för regenerering av nervceller eller leverans av genprodukter till CNS. I princip förenklar detta cellterapi för skador på nervsystemet, eftersom det inte finns något behov av att erhålla autologa humana nervstamceller. Potentiella tillämpningar av benmärgsceller för generering av kardiomyocyter och myogena progenitorceller av både äkta stromalt och extrastromalt ursprung har rapporterats.

Experiment utförs med systemisk transplantation av benmärgsstromala celler för behandling av vanliga skelettsjukdomar. Det råder ingen tvekan om att benmärgsstromala celler är den population som är ansvarig för genetiska störningar i skelettsjukdomar, vilket väl illustreras av vektoröverföringen av genetisk information med hjälp av dessa celler, vilket leder till bildandet av patologisk benvävnad hos försöksdjur. Stromala cellers förmåga att implantera, inympa, proliferera och differentiera i skelettben efter att de införts i den allmänna blodomloppet har dock ännu inte bevisats.

Detta beror delvis på att stromat vid standardbenmärgstransplantation inte transplanteras tillsammans med den hematopoetiska vävnaden, så strikta kriterier för att bedöma framgångsrik inympning av systemiskt administrerade stromala celler ännu inte har utvecklats. Man bör komma ihåg att närvaron av markörgener i vävnadsextrakt eller isolering av celler av donatorursprung i kultur inte indikerar inympning av cellerna, utan bara deras överlevnad. Även intraarteriell injektion av benmärgsstromala celler i en musben kan leda till praktiskt taget ingen inympning, trots att celler av donatorursprung finns i stort antal i benmärgsmikrovaskulaturen. Tyvärr beskrivs sådana celler vanligtvis som "inympade" enbart på grundval av detektion av markörgener för donatorceller i ex vivo-kultur. Dessutom måste övertygande bevis för långsiktig integration av differentierade och funktionellt aktiva celler av donatorursprung i de studerade vävnaderna tillhandahållas. I många publicerade artiklar som rapporterar om inympning av benmärgsstromala celler i skelettet är avsaknaden av tydliga data av detta slag slående. Det bör dock noteras att vissa korrekta djurförsök verkligen har etablerat en begränsad men verklig inympning av stromala progenitorceller efter deras systemiska administrering.

Dessa data överensstämmer med resultaten från studier om möjligheten att leverera myogena progenitorceller från benmärg till muskler via kärlsystemet. Man bör dock inte glömma att både skelett- och muskelvävnad bildas under utveckling och tillväxt baserat på extravaskulära cellrörelser som använder migrationsprocesser som inte involverar blodcirkulation. Om en oberoende cirkulationsväg för att leverera progenitorceller till fastfasvävnader existerar, är det möjligt att anta att det finns fysiologiskt cirkulerande mesenkymala progenitorceller? Vad är ursprunget för dessa celler i både den utvecklande och postnatala organismen, och hur penetrerar de kärlväggen? Lösningen på dessa frågor verkar absolut nödvändig och kräver den mest noggranna prekliniska analysen. Även efter att svar på dessa frågor har hittats kommer problematiska kinetiska aspekter i samband med skeletttillväxt och bindvävsremodellering att förbli olösta. Samtidigt verkar behandling av osteogenesstörningar genom att ersätta hela populationen av muterade skelettprogenitorceller med friska stromala element vara en verklig klinisk möjlighet. I detta fall kan lokala frakturzoner eller deformationer på grund av patologisk osteogenes, såväl som destruktiva förändringar i benvävnad, korrigeras med hjälp av stromala stamceller odlade in vitro. Därför är det lämpligt att fokusera framtida forskning på problemen med transformation eller genetisk korrigering av autologa muterade osteogena progenitorceller ex vivo.

Genteknik av celler, kortvarig eller permanent, har blivit grunden för cell- och molekylärbiologi och källan till många vetenskapliga upptäckter gällande enskilda proteiners roll i cellmetabolismen in vitro och in vivo. Användningen av molekylära teknologier för korrigering av ärftlig patologi och mänskliga sjukdomar är mycket lovande för praktisk medicin, eftersom egenskaperna hos benmärgsstromala stamceller gör det möjligt att utveckla unika transplantationsscheman för korrigering av genetiska sjukdomar i skelettet. Samtidigt kan mesenkymala prekursorceller lätt erhållas från den framtida mottagaren, de är mottagliga för genetisk manipulation och kan föröka sig i stora mängder på kort tid. Användningen av mesenkymala stamceller gör det möjligt att undvika de begränsningar och risker som är förknippade med leverans av genetiskt informationsmaterial direkt till patienten genom intravaskulära vektorkonstruktioner. En liknande strategi är tillämplig på embryonala stamceller, men autologa postnatala benmärgsstromala celler är ett mer föredraget material, eftersom deras introduktion utesluter eventuella immunologiska komplikationer efter transplantation. För att uppnå en kortsiktig effekt, till exempel för att accelerera benregenerering, är den mest optimala metoden genetisk modifiering av mesenkymala stamceller med hjälp av elektroporering, kemisk fusion, lipofektion, plasmider och adenovirala konstruktioner. I synnerhet har viral transfektion in i benmärgsstromala celler BMP-2 visat sig effektiv för att accelerera benregenerering vid experimentell polytrauma. Skapandet av adenovirala vektorkonstruktioner är att föredra på grund av avsaknaden av toxicitet. Emellertid kännetecknas genetisk modifiering av benmärgsstromala celler i detta fall av extremt låg stabilitet. Dessutom kräver normala transformerade benmärgsstromala celler användning av vektorbärare av genetisk information som är 10 gånger mer infektiösa än andra celltyper, vilket avsevärt ökar andelen transfekterade cellers död.

Behandling av recessiva sjukdomar orsakade av låg eller ingen biologisk aktivitet hos vissa gener kräver långsiktig eller permanent modifiering av mesenkymala stamceller, vilket kräver användning av adenoassocierade virus, retrovirus, lentivirus eller adenoretrovirala chimärer. Transportregionerna hos dessa virus kan överföra stora DNA-transfekter (upp till 8 kb). Den vetenskapliga litteraturen har redan rapporterat om den exogena biologiska aktiviteten hos benmärgsstromala celler transfekterade med retrovirala konstruktioner som kodar för syntesen av regulatoriska och markörmolekyler - IL-3, CD2, faktor VIII, samt enzymer involverade i syntesen av L-DOPA. Men även i dessa studier påpekar författarna ett antal begränsningar som måste övervinnas innan den praktiska tillämpningen av denna teknik. Det första problemet är att optimera processen för MSC-modifiering ex vivo. Det är känt att långsiktig (3-4 veckor) proliferation av benmärgsstromala celler in vitro minskar deras transfektion. Samtidigt, för att uppnå en hög nivå av genetisk modifiering av MSC, är det nödvändigt att genomföra flera transfektionscykler. Det andra problemet är förknippat med varaktigheten av terapeutiskt genuttryck, som ännu inte överstiger fyra månader. En naturlig minskning av effektivt genuttryck beror på promotorinaktivering och död av modifierade celler. Med tanke på de allmänna utsikterna att överföra genetisk information med hjälp av mesenkymala stamceller, indikerar resultaten av preliminära studier behovet av ytterligare optimering av ex vivo-transfektionsmetoder, valet av en adekvat promotor som reglerar biologisk aktivitet i önskad riktning, och en ökning av förmågan hos modifierade benmärgsstromala celler att självupprätthålla sig in vivo efter transplantation. Det bör noteras att användningen av retrovirala konstruktioner för att modifiera benmärgsstromala celler i önskad riktning inte alltid kräver deras obligatoriska inympning. Transfekterade mesenkymala stamceller kan utföra en korrigerande funktion mot bakgrund av stabil vistelse och utan obligatorisk aktiv fysisk inkorporering och funktion i bindväv. I detta fall bör de betraktas som en biologisk minipump som in vivo producerar en faktor, vars brist bestämmer manifestationen av genetisk patologi.

Användningen av transformerade benmärgsstromala celler för behandling av dominant genetisk patologi, som kännetecknas av uttrycket av en gen med patologisk eller onormal biologisk aktivitet, är mycket mer problematisk, eftersom det i detta fall är nödvändigt att blockera överföringen eller implementeringen av förvrängd genetisk information. En av metoderna för genteknik är homolog rekombination av embryonala stamceller för att skapa transgena djur. Emellertid är det osannolikt att den extremt låga graden av homolog rekombination i kombination med problemen med identifiering, separation och expansion av sådana rekombinanter kommer att bidra till en utbredd användning av denna metod inom en snar framtid, även om nya tekniska metoder utvecklas. Det andra tillvägagångssättet inom genterapi för dominant patologi är baserat på automatisk korrigering av skadat DNA, eftersom genetiska mutationer kan korrigeras genom att introducera exogent DNA med önskad sekvens (korta DNA-oligonukleotider eller chimära RNA/DNA-oligonukleotider), som binder till homologer i det skadade genomet. Det tredje alternativet innebär att blockera överföringen av patologisk information, vilket uppnås genom användning av specifikt utformade oligonukleotider som binder till en specifik gen för att bilda en ternär spiralstruktur som eliminerar möjligheten till transkription.

Även om korrigering av en genetisk sjukdom på genomnivå fortfarande är den mest optimala och föredragna terapeutiska metoden, är mRNA också en lovande vektor (möjligen ännu mer tillgänglig) för att blockera en dominant negativ gen. Proteinmolekyler med antisense-oligonukleotider eller kompletta sekvenser som blockerar mRNA-bindning till den cellulära biosyntetiska apparaten har länge använts för att hämma translation och/eller öka mRNA-nedbrytning. Dessutom inducerar dubbelsträngat RNA snabb mRNA-nedbrytning, vars mekanism fortfarande är oklar. Det är dock osannolikt att enbart eliminering av mRNA transkriberat från en mutant allel med korta eller enstaka mutationer kommer att främja uttrycket av mRNA från den normala allelen. Ett alternativ är användningen av hammerhead- och hairpin-ribosynteser, vilka har förmågan att binda till mycket specifika regioner av mRNA med efterföljande induktion av deras klyvning och inaktivering under translation. Möjligheten att använda denna metod vid behandling av patologisk osteogenes studeras för närvarande. Oavsett exakt vad målet är – genomiska eller cytoplasmatiska element – kommer framgången för nya genterapitekniker att bestämmas av effektiviteten i införandet av reagens i benmärgsstromala celler ex vivo, det optimala valet av en specifik vektor och den stabila förmågan hos mesenkymala stamceller att uttrycka de nödvändiga faktorerna in vivo.

Upptäckten av mesenkymala stamceller med deras oväntade egenskaper skapar således ett nytt konceptuellt schema för utveckling av cellinjer. Ytterligare tvärvetenskaplig forskning behövs dock för att förstå den biologiska rollen hos stromala stamceller, deras natur, deras förmåga att transdifferentiera eller dedifferentiera, deras fysiologiska betydelse under embryonal utveckling, postnatal tillväxt, mognad och åldrande, samt vid mänskliga sjukdomar.