Laboratoriediagnos av tuberkulos

Tuberkulos är en sjukdom som är lätt att diagnostisera under moderna förhållanden och vetenskapliga landvinningar. Laboratoriediagnostik av tuberkulos intar en central plats bland andra diagnostiska metoder, näst efter röntgenundersökningsmetoder.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Kliniskt blodprov

Hos patienter med tuberkulos är förändringar i det allmänna blodprovet inte patognomoniska. Vid begränsade och lågaktiva former av tuberkulos är hypokromi av erytrocyter med ett normalt antal karakteristiskt. Vid massiva infiltrat eller caseös lunginflammation, med utbredd caseös lymfadenit, specifik tarmskada, såväl som vid stora lung- eller postoperativa blödningar, noteras erytropeni och mikrocytos, oligokromasi och polykromasi. Makrocytos, och särskilt poikilocytos, förekommer mycket mer sällan, vanligtvis vid svår anemi. Antalet retikulocyter i det kompenserade stadiet av tuberkulos varierar från 0,1 till 0,6%, i det subkompenserade stadiet - från 0,6 till 1,0%, och för det dekompenserade stadiet är 1% retikulocyter karakteristiska.

I vissa fall av tuberkulos kan måttlig leukocytos (upp till 15 tusen leukocyter) observeras, mindre ofta leukopeni, vilket förekommer i 2-7% av fallen hos patienter med begränsade och milda former av processen och i 12,5% vid destruktiv och progressiv lungtuberkulos.

Oftast sker förändringar i leukocytformeln. Både relativ och absolut neutrofili noteras, en måttlig förskjutning av leukocytformeln åt vänster mot promyelocyter. Myelocyter påträffas mycket sällan vid okomplicerad tuberkulos. En ökning av antalet neutrofiler med patologisk granularitet i hemogrammet hos en patient med tuberkulos indikerar alltid processens varaktighet: hos patienter med svår tuberkulos innehåller nästan alla neutrofiler patologisk granularitet. När ett tuberkulosutbrott avtar återgår kärnförskjutningen till det normala relativt snabbt. Patologisk granularitet hos neutrofiler kvarstår vanligtvis längre än andra förändringar i hemogrammet.

Halten av eosinofiler i perifert blod varierar också beroende på processens fas och organismens allergiska tillstånd. Deras antal minskar till aneosinofili vid svåra och långvariga utbrott av sjukdomen och ökar omvänt under resorption av infiltrat och pleurautgjutning, såväl som vid tidiga former av primär tuberkulos.

De flesta former av primär tuberkulos åtföljs av lymfopeni, som ibland observeras i flera år även efter ärrbildning av specifika förändringar. Sekundär tuberkulos i den akuta fasen kan, beroende på processens svårighetsgrad, åtföljas av antingen ett normalt antal lymfocyter eller lymfopeni.

Bland testerna för att bedöma tuberkulosprocessen intar en särskild plats bestämningen av erytrocytsedimenteringshastigheten (ESR), vilket är viktigt för att bedöma tuberkulosprocessens förlopp och identifiera dess aktiva former. En ökning av ESR indikerar närvaron av en patologisk process (infektiös och inflammatorisk, purulent, septisk, hemoblastos, lymfogranulomatos, etc.) och fungerar som en indikator på dess svårighetsgrad, men normala ESR-värden indikerar inte alltid frånvaron av patologi. Acceleration av erytrocytsedimentering underlättas av en ökning av innehållet av globuliner, fibrinogen, kolesterol i blodet och en minskning av blodets viskositet. En avmattning av erytrocytsedimentering är karakteristisk för tillstånd som åtföljs av hemokoncentration, en ökning av innehållet av albuminer och gallsyror.

Hemogrammet hos tuberkulospatienter förändras under behandlingen. Ju mer framgångsrik den terapeutiska interventionen är, desto snabbare försvinner de hematologiska förändringarna. Samtidigt bör man ha i åtanke effekten av olika antibakteriella läkemedel på hematopoiesen. De orsakar ofta eosinofili, i vissa fall leukocytos, och oftare leukopeni upp till agranulocytos och lymfoid-retikulär reaktion. Systematisk hematologisk övervakning och korrekt analys av de erhållna data är avgörande för att bedöma patientens kliniska tillstånd, processens dynamik och behandlingens effektivitet.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinisk urinanalys

Vid tuberkulos i urinvägarna är urinanalys den huvudsakliga laboratoriediagnosmetoden. Leukocyturi, erytrocyturi, proteinuri, hypoisostenuri, tuberkulös mykobakteriuri och ospecifik bakteriuri kan observeras.

Leukocyturi är det vanligaste symptomet på urinvägstuberkulos före specifik kemoterapi och saknas endast i undantagsfall, såsom fullständig utplåning av urinledarens lumen. Nechiporenkos test (bestämning av antalet leukocyter i 1 ml urin) hjälper till att mer objektivt bedöma graden av leukocyturi vid nefrotuberkulos, och i vissa fall att upptäcka den med en normal allmän urinanalys. Det bör dock beaktas att leukocyturi kan förekomma vid akut och kronisk pyelonefrit, cystit, uretrit, njursten och urinledare.

Erytrocyturi, liksom leukocyturi, anses vara ett av de vanligaste laboratorietecknen på urogenital tuberkulos. Frekvensen av hematuri beror på processens förekomst; den ökar när den destruktiva tuberkulösa processen i njuren utvecklas. Erytrocyturi utan leukocyturi är mer typiskt för de tidiga stadierna av njurtuberkulos. Hematuri, som råder över leukocyturi, är ett viktigt argument för njurtuberkulos när man skiljer den från ospecifik pyelonefrit.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokemiskt blodprov

Vid tuberkulos beror förändringar i vissa biokemiska index främst på processens fas, komplikationer och olika samtidiga sjukdomar. Hos patienter med inaktiv tuberkulos i lungor och andra organ förändras inte det totala proteinet och proteinfraktionerna i blodserumet och bestämmer deras normala innehåll.

Vid akuta former av sjukdomen, såväl som vid förvärring och progression av kroniska former av tuberkulos, minskar albumin-globulin-koefficienten.

Av betydande betydelse för att bedöma leverns funktionella tillstånd och organiska skador vid tuberkulos och dess komplikationer är bestämningen av direkt och totalt bilirubin, aspartataminotransferas (AST) och alaninaminotransferas (ALAT) i blodserumet. Dynamisk bestämning av nivån av aminotransferaser. Bilirubin vid behandling av patienter med tuberkulos, särskilt i dess svåra former, är en obligatorisk del av den biokemiska undersökningen av patienter med tuberkulos och utförs månadsvis.

Utvärdering av njurarnas funktionella tillstånd inkluderar bestämning av serumkreatinin och beräkning av glomerulär filtrationshastighet med hjälp av Cockcroft-Gault-formeln. Beräkning av glomerulär filtrationshastighet med hjälp av Reberg-testet ger mindre noggranna resultat.

Huvudmålet med dynamiska biokemiska studier av patienter med tuberkulos är att övervaka processens förlopp, i tid upptäcka biverkningar av läkemedel och adekvat korrigering av framväxande homeostasstörningar.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Tillämpning av biokemiska forskningsmetoder vid extrapulmonell tuberkulos

Den mest informativa indikatorn anses vara innehållet av tuberkulostearinsyra i biologiska vätskor, men dess bestämning är förknippad med tekniska svårigheter (behovet av att använda gaskromatografi och masspektrometri).

Det är lovande att mäta aktiviteten av adenosindeaminas - ett enzym som bestäms i vätskor: synovial, perikardiell, ascitisk eller cerebrospinal. De huvudsakliga producenterna av adenosindeaminas är lymfocyter och monocyter. Bestämning av aktiviteten av adenosindeaminas i biologiska vätskor underlättar diagnosen av tuberkulös synovit, tuberkulos i lymfkörtlarna, tuberkulös hjärnhinneinflammation och tuberkulös serosit.

Vissa biokemiska indikatorer bestäms, på grund av deras icke-specificitet, endast i biologiska vätskor nära lesionen. Nivån av indikatorer mäts som svar på subkutan eller intradermal administrering av tuberkulin (vanligtvis före administrering samt 48 och 72 timmar efter den). Därefter beräknas graden av ökning av markörnivån (i %) i förhållande till den initiala nivån.

Optimalt bestäms aktiviteten hos det organspecifika enzymet transamidinas i urin; dess förekomst noteras vid njurskador av olika ursprung. Studier av transamidinas är endast motiverade vid subkutan administrering av tuberkulin för att förvärra den lokala inflammatoriska processen. Transamidinasaktivitet bestäms initialt i urin och 24–72 timmar efter administrering av 50 TE tuberkulin. En ökning av fermenturi med 2 gånger eller mer gör det i 82 % av fallen möjligt att differentiera aktiv njurtuberkulos från förvärring av kronisk pyelonefrit.

Vid tuberkulos i kvinnliga könsorgan bestäms koncentrationerna av haptoglobin och malondialdehyd i blodet under provokativa tuberkulintester. Tuberkulin administreras subkutant i en dos av 50 TE och en upprepad biokemisk studie utförs efter 72 timmar. Vid tuberkulös etiologi är graden av ökning av haptoglobinnivån minst 28 % och nivån av malondialdehyd är 39 % eller mer. Bestämning av aktiviteten av adenosindeaminas i peritonealvätskan som erhållits från Douglas-påsen används också. Punktionen undersöks igen 72 timmar efter intradermal administrering av tuberkulin i doser av 0,1 TE och 0,01 TE i området för de inre könsorganens projektion på den främre bukväggen. En ökning av aktiviteten av adenosindeaminas med 10 % eller mer jämfört med initialvärdet indikerar en tuberkulös process.

Vid ögonskada undersöks den fokala reaktion som uppstår i ögat som svar på antigenstimulering. I detta fall är utvecklingen av ett skarpt uttryckt svar åtföljt av en minskning av synfunktioner oönskad. Eftersom bedömningen av minimala fokala reaktioner ofta är svår rekommenderas det att parallellt fokusera på graden av ökning av haptoglobin eller adenosindeaminas i blodserumet för att objektivisera slutsatsen.

Alla biokemiska studier bör utföras i kombination med andra metoder.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Studie av blodkoagulationssystemet

Relevansen av att studera blodkoagulationssystemets tillstånd inom ftisiologin beror på förekomsten av hemoptys eller lungblödningar hos ett antal patienter med lungtuberkulos, såväl som hemokoagulationskomplikationer vid kirurgisk behandling av tuberkulos. Dessutom påverkar den naturligt medföljande latenta intravaskulära hemokoagulationen sjukdomsförloppet och effektiviteten av kemoterapi.

Hos patienter med lungtuberkulos med en övervägande exsudativ komponent av inflammation observeras en minskning av blodets antikoagulerande aktivitet. Hos patienter med låg prevalens av specifik lungskada med en övervägande produktiv komponent av inflammation uttrycks intravaskulär hemokoagulation obetydligt. Hos patienter med lungtuberkulos med hemoptys och lungblödningar är tillståndet i blodkoagulationssystemet annorlunda: hos patienter med mindre blodförlust vid hemoptöns höjdpunkt eller omedelbart efter dess upphörande observeras en kraftig ökning av blodets koagulationskapacitet på grund av en uttalad intensifiering av trombinbildningsprocesser samtidigt som ökad "strukturell" koagulerbarhet bibehålls. Hos patienter med massiv blodförlust observeras en minskning av koagulationspotentialen på grund av en minskning av koncentrationen av fibrinogen, faktor XIII-aktivitet och trombocytantal. I skedet av kirurgisk behandling hos patienter med begränsade former av lungtuberkulos uppstår inga signifikanta störningar i homeostassystemet. Hos patienter med utbredda processer, vid pneumonektomi eller pleuropneumonektomi, utvecklas ofta DIC-syndrom, vilket kan ta formen av en "andra sjukdom".

För att övervaka blodkoagulationssystemets tillstånd hos patienter med lungtuberkulos är det nödvändigt att bestämma aktiverad partiell tromboplastintid (APTT), fibrinogen, trombintid, protrombinindex, samt blödningstid och blodkoagulationstid.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonella studier

Moderna experimentella och kliniska observationer indikerar förekomsten av förändringar i hormonstatus vid specifik tuberkulös inflammation i lungorna. Det har bevisats att korrigering av dysfunktion i hypofys-binjure-, hypofys-sköldkörtel- och pankreasfunktionen i kombination med antituberkulosbehandling bidrar till aktivering av fibrogenes och reparationsprocesser i fokus för specifik inflammation.

Hypofys-sköldkörtelsystemets funktionella tillstånd bedöms utifrån halten av trijodtyronin (T3), tyroxin (T4) och hypofysiskt tyreoideastimulerande hormon (TSH) i blodserumet _. Det _har fastställts att subklinisk hypotyreos upptäcks hos 38–45 % av patienter med lungtuberkulos, och det diagnostiseras oftast i disseminerade och fibrösa-kavernösa former av processen. I dessa former är nivåerna av både T3 och T4 mest kraftigt reducerade _, och _en obalans av dessa hormoner uppstår i form av en ökning av T4 _/ T3 _{-förhållandet}.

Binjurebarkens funktion bedöms genom serumkortisolnivån, och bukspottkörtelns endokrina funktion bedöms genom koncentrationen av immunreaktivt insulin. I den akuta fasen av en infektionssjukdom ökar behovet av endogent kortisol och insulin. Hyperinsulinemi indikerar också insulinresistens i kroppsvävnader, vilket är typiskt för alla aktiva inflammatoriska processer, särskilt en specifik sådan. Bestämning av binjurarnas glukokortikoidfunktion vid aktiv lungtuberkulos gör det möjligt att upptäcka förekomsten av hyperkorticism hos de flesta patienter. Normala kortisolkoncentrationer i blodet hos en patient med infektiös inflammation under den akuta perioden bör betraktas som en relativ insufficiens av binjurebarkens glukokortikoidfunktion, vilket kan tjäna som grund för ersättningsbehandling med adekvata doser glukokortikoider.

Nästan en tredjedel av patienterna med lungtuberkulos har en låg insulineminivå som närmar sig den nedre gränsen för normen, medan 13–20 % har betydande hyperinsulinism. Både relativ hypo- och hyperinsulinism är högriskfaktorer för utveckling av kolhydratmetabolismrubbningar av varierande svårighetsgrad. Dessa förändringar i den funktionella aktiviteten hos pankreatiska B-celler kräver regelbunden glykemiövervakning hos patienter med tuberkulos och snabb förebyggande av diabetes mellitus. Dessutom tjänar detta som ett ytterligare skäl till lämpligheten av att använda fysiologiska doser av insulin i den komplexa behandlingen av tuberkulos.

I allmänhet är minskningen av sköldkörtelhormonnivåerna, deras obalans, hyperkortisolemi och hyperinsulinism mest uttalad hos patienter med en svår tuberkulosprocessen, med omfattande lungskador och uttalade symtom på tuberkulosförgiftning.

Mikrobiologisk diagnostik av tuberkulos

Mikrobiologiska undersökningar är nödvändiga för att identifiera patienter med tuberkulos, verifiera diagnosen, övervaka och korrigera kemoterapi, bedöma behandlingsresultat, med andra ord, från det ögonblick en patient med tuberkulos registreras tills hen tas bort från registret.

Alla epidemiologiska program och projekt baseras på en bedömning av antalet bakterieutsöndrare, vilket är omöjligt att göra utan användning av laboratoriemetoder för att upptäcka tuberkulosmykobakterier. När man undersöker den så kallade oorganiserade befolkningens attraktionskraft når andelen bakterieutsöndrare 70 eller mer, vilket gör laboratoriemetoder till ett ganska effektivt sätt att identifiera tuberkulospatienter bland denna befolkningsgrupp.

Traditionella mikrobiologiska metoder för att diagnostisera tuberkulos är bakterioskopiska och odlingsstudier. Moderna metoder inkluderar odling av tuberkulosmykobakterier i automatiserade system och PCR. Alla dessa metoder kombineras dock nödvändigtvis med klassiska bakteriologiska metoder.

Insamling av diagnostiskt material

Effektiviteten av laboratorietester beror till stor del på kvaliteten på det diagnostiska materialet. Efterlevnaden av reglerna för insamling, lagring och transport av diagnostiskt material och den exakta implementeringen av patientundersökningsalgoritmen påverkar direkt resultatet och säkerställer biologisk säkerhet.

En mängd olika material används för att testa för tuberkulos. Eftersom lungtuberkulos är den vanligaste formen av tuberkulös infektion, anses det huvudsakliga materialet för testning vara sputum och andra typer av trakeobronkial trädsekret: övre luftvägssekret erhållet efter aerosolinhalationer: bronksköljvatten; bronkoalveolära lavage; material erhållet under bronkoskopi, transtrakeal och intrapulmonell biopsi: bronkialaspirat, larynxutstryk, exsudat, sårutstryk etc.

Forskningens effektivitet ökar om kontrollerad insamling av material från patienten utförs. För detta ändamål tilldelas ett specialutrustat rum eller så köps speciella bås in. Insamling av material är en farlig procedur, därför måste material för forskning samlas in i enlighet med infektionsskyddsregler.

Material för testning för Mycobacterium tuberculosis samlas in i sterila ampuller med tätt skruvade lock för att förhindra kontaminering av miljön och skydda det insamlade materialet från kontaminering.

Flaskor för insamling av diagnostiskt material måste uppfylla följande krav:

• måste vara tillverkad av slagtåligt material;
• bör smälta lätt vid autoklavering;
• vara av tillräcklig volym (40–50 ml):
• ha en bred öppning för uppsamling av slem (diameter minst 30 mm);
• vara lätt att hantera, transparent eller genomskinlig, så att kvantiteten och kvaliteten på det insamlade provet kan bedömas utan att locket öppnas.

För att uppnå optimala forskningsresultat måste följande villkor vara uppfyllda:

• insamling av material bör utföras före påbörjad kemoterapi;
• Materialet för studien måste samlas in innan man äter eller tar mediciner på morgonen;
• För studien är det lämpligt att samla minst 3 morgonsputumprover. Sputum samlas in under 3 dagar i följd;
• Det insamlade materialet måste levereras till laboratoriet så snart som möjligt:
• I de fall där det är omöjligt att leverera materialet till laboratoriet omedelbart, förvaras det i kylskåp vid en lufttemperatur på 4 °C i högst 48 timmar;
• Vid transport av materialet är det nödvändigt att ägna särskild uppmärksamhet åt flaskornas integritet.

Korrekt insamlat sputum har en slemmig eller mukopurulent karaktär. Den optimala volymen av den undersökta sputumdelen är 3-5 ml.

Sputum samlas in under överinseende av en sjukvårdspersonal. Personer som ansvarar för att samla in slem måste se till att vissa regler följs:

• Det är nödvändigt att förklara för patienten syftet med undersökningen och behovet av att hosta upp, inte saliv eller nasofaryngealt slem, utan innehållet i de djupa delarna av luftvägarna. Detta kan uppnås som ett resultat av en produktiv hosta som uppstår efter flera (2-3) djupa andetag. Det är också nödvändigt att varna patienten att han först måste skölja munnen med kokt vatten för att ta bort huvuddelen av mikrofloran som vegeterar i munhålan och matrester som komplicerar undersökningen av sputum;
• Den medicinska arbetaren som är involverad i uppsamling av slem måste, förutom skyddsrock och mössa, bära mask, gummihandskar och ett gummiförkläde;
• stående bakom patienten rekommenderas han att hålla flaskan så nära läpparna som möjligt och omedelbart separera sputumet i den medan han hostar upp det, samtidigt som det är nödvändigt att säkerställa att luftflödet riktas bort från vårdpersonalen:
• När sputumuppsamlingen är klar ska sjukvårdspersonalen noggrant stänga flaskan med locket och bedöma mängden och kvaliteten på det uppsamlade sputumet. Flaskan märks sedan och placeras i en speciell låda för transport till laboratoriet.

Om patienten inte producerar slem, bör patienten kvällen innan och tidigt på morgonen på dagen för materialinsamling ges ett slemlösande medel: extrakt av marshmallowrötter (mucaltin), bromhexin, ambroxol, etc. - eller en irriterande inhalation, med hjälp av utrustning installerad i rummet för uppsamling av slem. Materialet som samlas in på detta sätt är inte föremål för konservering och bör undersökas på insamlingsdagen. För att undvika att det "kasseras" i laboratoriet bör en särskild anteckning göras i remissen.

Om mikrobiologiska undersökningar inte utförs vid en given institution, ska det insamlade diagnostiska materialet levereras centralt till laboratoriet, förutsatt att materialet förvaras i kylskåp eller med konserveringsmedel mellan leveranserna. Materialet levereras till laboratoriet i transportlådor som lätt kan desinficeras. Varje prov ska vara försett med en lämplig etikett, och hela partiet ska ha en ifylld medföljande blankett.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Metoder och frekvens för undersökning av patienter

Under den inledande, så kallade diagnostiska, undersökningen av en patient för tuberkulos är det nödvändigt att undersöka minst 3 portioner sputum som samlats in under överinseende av medicinsk personal under loppet av 2 eller 3 dagar, vilket ökar mikroskopins effektivitet.

Primär screening för tuberkulos bör utföras av alla medicinska och diagnostiska institutioner inom hälso- och sjukvårdssystemet. För att öka effektiviteten av primärundersökningen har man nyligen organiserat så kallade mikroskopicentra baserat på kliniska diagnostiska laboratorier, utrustade med moderna mikroskop och utrustning för att säkerställa epidemisäkerhet.

Antituberkulosinstitutioner använder ett undersökningsschema som möjliggör minst 3-faldig undersökning av sputum eller annat diagnostiskt material inom 3 dagar. Under behandlingen utförs mikrobiologiska studier regelbundet minst en gång i månaden i den intensiva kemoterapifasen. Vid övergång till uppföljningsfasen utförs studierna mer sällan - med intervaller på 2-3 månader, medan studiernas frekvens reduceras till två.

Funktioner vid insamling av diagnostiskt material för extrapulmonell tuberkulos

Ett kännetecken för patologiskt material i extrapulmonära former av tuberkulos är den låga koncentrationen av mykobakterier tuberkulos i den, vilket kräver mer känsliga metoder för mikrobiologisk forskning, främst metoder för sådd på ett näringsmedium.

Vid urogeniterkulos är urin det lättillgängliga materialet för undersökning. Urininsamling bör utföras av en specialutbildad sjuksköterska.

De yttre könsorganen tvättas med vatten och tvål eller en svag lösning av kaliumpermanganat. Urinrörets yttre mynning behandlas noggrant. Den mellersta delen av morgonurinen samlas upp i en steril flaska: hos män - naturligtvis, hos kvinnor - med hjälp av en kateter. Urin från njurbäckenet samlas upp i sterila provrör under kateterisering av en eller två njurar, i det senare fallet - nödvändigtvis separat från varje njure. En liten mängd av denna urin centrifugeras, sedimentet undersöks.

Hos män centrifugeras spermier, testikelpunktioner och prostatasekret för att få ett sediment. Vid lokalisering av en specifik process i könsorganet hos män kan prostatamassage främja frisättningen av sekret som innehåller tuberkulosmykobakterier.

Menstruationsblod samlas in från kvinnor genom sugning eller med hjälp av en Kafka-kapsyl. Det resulterande materialet befrias från erytrocyter genom att tvätta det med destillerat vatten och sedan centrifugeras. Sedimentet undersöks.

Utsläpp från livmoderns livmoderhalskanal samlas upp i någon behållare eller Kafka-lock, det vill säga det är önskvärt att ackumulera 1-2 ml patologiskt material.

Material som erhållits vid kirurgiska ingrepp på njurar, könsorgan, biopsier och skrap från endometriet homogeniseras. För detta ändamål placeras det i en steril mortel och krossas noggrant med en steril sax. Steril flodsand tillsätts till den resulterande suspensionen i en mängd som motsvarar dess massa, sedan tillsätts 0,5-1,0 ml isoton natriumkloridlösning och allt mals tills en mosig massa bildas med tillsats av isoton natriumkloridlösning (4-5 ml). Därefter får massan stå och sätta sig i 1-1,5 minuter, och supernatanten undersöks.

Tuberkulos i ben och leder. Punktionen (pus från abscesser) som tagits med en steril spruta placeras i en steril behållare och levereras omedelbart till laboratoriet. Med hjälp av en steril pipett, som tidigare fuktats med steril isoton natriumkloridlösning, tas 2-5 ml pus, överförs till en flaska med pärlor och ytterligare 2-3 ml isoton natriumkloridlösning tillsätts. Flaskan försluts med en propp och skakas i en skakmaskin i 8-10 minuter. Den homogeniserade suspensionen undersöks.

Vid fistulära former av osteoartikulär tuberkulos tas pus från fisteln. Riklig utsöndring samlas upp direkt i ett provrör. Vid sparsam pusutsöndring tvättas fistelkanalen med en steril isoton natriumkloridlösning, och tvättvattnet som samlats i ett provrör eller en bit tampong indränkt i pus skickas för undersökning.

Kirurgiskt material som erhålls vid kirurgiska ingrepp på ben och leder kan bestå av purulent-nekrotiska massor, granulationer, ärrvävnad, benvävnad, synovialmembranvävnad och andra substrat. Bearbetningen utförs som vid njurtuberkulos.

Mikrobiologisk undersökning av synovialvätska i en 3% natriumcitratlösning (i förhållandet 1:1) för att förhindra koagulering utförs omedelbart efter punktion.

Tuberkulos i lymfkörtlarna. Var som tagits vid punktion av lymfkörtlarna undersöks på samma sätt som var från abscesser. Lymfkörtelvävnad som tagits vid kirurgiska ingrepp och biopsier undersöks som vid andra former av tuberkulos.

Studien av avföring för Mycobacterium tuberculosis utförs extremt sällan på grund av den nästan fullständiga avsaknaden av positiva resultat.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopi av mykobakterier

Sputummikroskopi är en relativt snabb, enkel och billig metod som bör användas i alla fall där tuberkulos misstänks. Dessutom utförs denna studie för att bedöma effekten av kemoterapi och för att bekräfta återhämtning eller behandlingsmisslyckande i avsaknad av odlingsresultat.

Två metoder för mikroskopisk undersökning används:

• direktmikroskopimetod, när ett utstryk framställs direkt från det diagnostiska materialet;
• en metod för mikroskopi av sediment framställt från material behandlat med dekontamineringsmedel för kulturforskning.

Den första metoden används i de laboratorier där endast mikroskopiska studier utförs (kliniska diagnostiska laboratorier inom det allmänna medicinska nätverket).

De bästa resultaten av mikroskopisk undersökning erhålls genom att koncentrera det diagnostiska materialet (till exempel genom centrifugering).

För att kunna upptäcka Mycobacterium tuberculosis med 50 % sannolikhet med mikroskopi måste 1 ml sputum innehålla mer än 5 000 mikrobiella celler. Sputum från patienter med pulmonella former av tuberkulos innehåller vanligtvis ett betydande antal syrafasta bakterier, vilket gör att de kan detekteras tillförlitligt med bakterioskopi. Den diagnostiska känsligheten för denna metod kan ökas genom att undersöka flera sputumprover från en patient. Ett negativt bakterioskopiskt undersökningsresultat utesluter inte diagnosen tuberkulos, eftersom sputumet hos vissa patienter innehåller färre Mycobacterium än vad som kan detekteras med mikroskopi. Dålig förberedelse av sputumutstryk kan också vara orsaken till ett negativt bakterioskopiskt undersökningsresultat.

Den vanligaste metoden för att detektera syrafasta mykobakterier i ett utstryk är Ziehl-Neelsen-färgning. Metoden baseras på penetrationen av karbolfuchsin in i en mikrobiell cell genom ett membran som inkluderar ett vax-lipidlager, med samtidig effekt av uppvärmning och fenols starka etsningsverkan. Efterföljande avfärgning av utstryket med en 25% lösning av svavelsyra eller 3% saltsyra leder till avfärgning av alla icke-syrafasta strukturer. De avfärgade elementen i utstryket färgas med en 0,3% lösning av metylenblått. Mykobakterier uppfattar inte konventionella anilinfärgämnen, vilket resulterar i att syrafasta mykobakterier färgas hallonröda, och andra mikrober och cellulära element färgas blå.

För att undersöka utstryk färgade enligt Ziehl-Neelsen används ett ljuskikarmikroskop med immersionsobjektiv (90- eller 100-faldig förstoring) och ett okular med 7- eller 10-faldig förstoring. 100 synfält undersöks, vilket är tillräckligt för att detektera enskilda mykobakterier i utstryket. Om resultatet av en sådan undersökning är negativt rekommenderas att ytterligare 200 synfält undersöks för bekräftelse. Resultaten registreras och anger antalet detekterade syrafasta mykobakterier (AFB).

Utöver denna metod används fluorokromfärgning för luminescerande mikroskopi, vilket möjliggör bästa resultat. Användningen av denna metod ökar mikroskopins effektivitet med 10-15%. När mykobakterier behandlas med luminescerande färgämnen (auramin, rodamin, etc.) binder dessa ämnen också till de vaxliknande strukturerna i den mikrobiella cellen. När färgade celler bestrålas med en exciterande ljuskälla (ett visst spektrum av ultraviolett strålning) börjar de lysa orange eller ljusrött mot en svart eller mörkgrön bakgrund. På grund av den höga ljusstyrkan och kontrasten i den synliga bilden kan mikroskopets totala förstoringsgrad minskas med 4-10 gånger, vilket utökar synfältet och minskar betraktningstiden för preparatet. Tillsammans med detta, på grund av det betydligt större skärpedjupet, kan studiens komfort ökas.

Vid användning av fluorescensmikroskopi tar det betydligt kortare tid att granska samma område av ett utstryk än att ljusmikroskopera utstryk färgade enligt Ziehl-Neelsen. Om en mikroskopist granskar cirka 20–25 sådana utstryk under en arbetsdag kan hen med hjälp av fluorescensmikroskopi undersöka mer än 60–80 prover samtidigt. Erfarna mikroskopister vet att färgning av celler med en blandning av auramin och rodamin på något sätt är specifikt för syrafasta mykobakterier, som i detta fall har utseendet av gyllene stavar. Saprofyter färgas grönaktigt.

En annan viktig fördel med fluorescensmikroskopimetoden är möjligheten att detektera förändrade mykobakterier som har förlorat sina syrabeständiga egenskaper under inverkan av ett antal ogynnsamma faktorer, i synnerhet intensiv kemoterapi, och därför inte detekteras med Ziehl-Neelsen-färgning.

Nackdelarna med fluorescensmikroskopimetoden inkluderar den relativt höga kostnaden för mikroskopet och dess drift. I centraliserade eller andra stora laboratorier, där arbetsbelastningen överstiger normen för tre laboratorietekniker som arbetar med tre konventionella mikroskop, är det dock billigare att använda ett fluorescensmikroskop istället.

Bakterioskopiska metoder har en ganska hög specificitet (89–100 %). Cirka 97 % av de positiva resultat som erhålls med någon mikroskopimetod bekräftas tydligt av såresultaten.

Det bör noteras att mikroskopisk undersökning av ett utstryk av patologiskt material inte tillåter artbestämning av de detekterade syraresistenta mykobakterierna. Den mikroskopiska metoden tillåter endast en slutsats om närvaron eller frånvaron av syraresistenta mikroorganismer i preparatet, vilket förklaras av förekomsten i naturen av ett stort antal icke-tuberkulösa syraresistenta mikroorganismer som morfologiskt liknar mykobakterier i tuberkuloskomplexet.

Utvärderingen av mikroskopiresultat utförs i semi-kvantitativa enheter.

För att kunna jämföra resultaten från olika mikroskopimetoder introduceras empiriska koefficienter. För att till exempel jämföra resultaten från ett utstryk färgat med fluorescerande färgämnen med data från en ljusmikroskopistudie (1000-faldig förstoring) är det nödvändigt att dividera antalet syrafasta mykobakterier som detekterats med ett fluorescerande mikroskop med motsvarande koefficient: vid 250-faldig förstoring av mikroskopet - med 10, vid 450-faldig - med 4, vid 630-faldig - med 2.

Funktioner av mikroskopi vid extrapulmonell tuberkulos

Direktmikroskopi utförs, liksom mikroskopi av utstryk framställda efter anrikning med efterföljande färgning enligt Ziehl-Neelsen eller fluorescerande färgämnen. Direktmikroskopi av utstryk är ineffektivt på grund av den låga koncentrationen av mykobakterier i materialet, och därför är det mer rationellt att använda anrikningsmetoder. Centrifugering är det mest effektiva. Om det biologiska materialet är visköst används centrifugering med samtidig homogenisering och kondensering av materialet, vilket utförs med höghastighetscentrifuger med en centrifugeringskraft på 3000 g och hypokloritlösningar. Andra anrikningsmetoder, såsom mikroflotation, används för närvarande inte på grund av bildandet av biologiskt farliga aerosoler.

[ 37 ]

Odlingsmetod för att diagnostisera tuberkulos

Såningsmetoden, eller odlingsmetoden, är känsligare än smearmikroskopi och har ett antal fördelar jämfört med den senare. Den möjliggör detektion av flera dussin livskraftiga mykobakterier i det undersökta materialet och har ett högt diagnostiskt värde. Detta är särskilt viktigt vid undersökning av material från nydiagnostiserade eller behandlade patienter som utsöndrar ett litet antal mykobakterier.

Jämfört med mikroskopi möjliggör odlingsforskning att öka antalet upptäckta tuberkulospatienter med mer än 15–25 %, samt att verifiera tuberkulos i tidigare stadier, när sjukdomen fortfarande är lättbehandlad. En mycket viktig fördel med odlingsforskning anses vara möjligheten att erhålla en patogenkultur, som kan identifieras och studeras i relation till läkemedelskänslighet, virulens och andra biologiska egenskaper.

Nackdelarna med odlingsmetoder inkluderar deras varaktighet (väntetiden för material når 10 veckor), högre kostnad och komplexiteten i bearbetningen av diagnostiskt material.

Principer för behandling av diagnostiskt material före sådd

Konventionella mikrobiologiska metoder kan inte användas för att utföra tuberkulosprov. Detta beror på att tuberkulosmykobakterier växer mycket långsamt, och de flesta kliniska prover innehåller snabbväxande pyogena och förruttnelseframkallande mikroorganismer och svampar. Deras snabba tillväxt på rika näringsmedier hindrar utvecklingen av mykobakterier och gör det omöjligt att isolera tuberkulospatogenen, så det diagnostiska materialet måste förbehandlas före sådd. Dessutom är mykobakterier som frigörs från patientens luftvägar vanligtvis omgivna av en stor mängd slem, vilket gör det svårt att koncentrera dem. I detta avseende måste de innan sådd av sputum och andra liknande material göras flytande och dekontamineras.

Alla rengöringsmedel och dekontamineringsmedel har en mer eller mindre uttalad toxisk effekt på mykobakterier. Som ett resultat av behandlingen kan upp till 90 % av mykobakterierna dö. För att bevara en tillräcklig andel av mykobakteriepopulationen är det nödvändigt att använda skonsamma behandlingsmetoder som å ena sidan gör det möjligt att undertrycka snabbväxande pyogena och förruttnelseframkallande mikroorganismer, och å andra sidan att maximalt bevara livskraften hos mykobakterier som finns i materialet.

Beroende på materialet, dess homogenitet och kontamineringsgrad används olika dekontamineringsmedel för behandling före sådd: för sputum - 4 % natriumhydroxidlösning, 10 % trinatriumfosfatlösningar, bensalkoniumklorid trinatriumfosfat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cystein-natriumhydroxid) med en slutlig NaOH-koncentration på 1 %, för urin och andra flytande material - 3 % svavelsyralösning, för kontaminerade prover, fettinnehållande material - oxalsyralösning upp till 5 %. Dessutom används i vissa fall enzymer och tensider (detergenter). Användningen av Tween och vissa andra detergenter åtföljs av mindre död av mykobakteriella celler (40-50 % överlever). De kan dock bara användas för flytande material. NALC-NaOH, som produceras i kit, är den mest använda i världen. Denna metod gör det möjligt att isolera mer än 85 % av mykobakteriecellpopulationen. Dekontaminering av vävnadsinnehållande fasta material är svårare, eftersom det är svårt att gissa materialets dispersionsgrad under homogenisering. Till exempel åtföljs ofta bearbetning av lymfkörtelbiopsier av en ökad frekvens av kontaminering med främmande flora. I detta fall kan 1 % etonium användas.

Icke-homogent material homogeniseras med hjälp av glaspärlor i närvaro av dekontamineringsmedel. Flytande material förcentrifugeras och endast sedimentet bearbetas.

Teknik för sådd och inkubation

Efter förberedande bearbetning centrifugeras materialet, vilket fäller ut mykobakterierna och ökar deras innehåll i sedimentet ("sedimentanrikning"). Det resulterande sedimentet neutraliseras och inokuleras på ytan av täta näringsmedier eller provrör med flytande (halvflytande) medier. Utstryk för mikroskopisk undersökning framställs från det återstående sedimentet. Såningstekniken måste förhindra korskontaminering av det diagnostiska materialet.

För tillförlitlig klinisk tolkning av resultaten av mikrobiologisk forskning måste följande regel följas: mikroskopiska och kulturella studier måste utföras parallellt från samma prov av diagnostiskt material.

De inokulerade rören placeras i en termostat vid 37 ^° C i 2 dagar i horisontellt läge. Detta säkerställer en mer jämn absorption av materialet i näringsmediet. Efter 2 dagar flyttas rören till vertikalt läge och försluts hermetiskt med gummi- eller silikonproppar för att förhindra att det inokulerade mediet torkar ut.

Grödorna förvaras i en termostat vid 37 ^° C i 10–12 veckor med regelbunden veckovis inspektion. Följande parametrar registreras vid varje kontrollinspektion:

• period av visuellt observerbar tillväxt från sådddagen;
• tillväxthastighet (antal CFU);
• kontaminering av kulturen med främmande mikrobiell flora eller svampar (sådana provrör tas bort);
• ingen synlig tillväxt. Rören lämnas kvar i termostaten till nästa inspektion.

Näringsmedier

Olika näringsmedier används för att odla mykobakterier: fasta, halvflytande, flytande. Emellertid har inget av de kända näringsmedierna egenskaper som säkerställer tillväxten av alla mykobakteriella celler. I detta avseende, för att förbättra effektiviteten, rekommenderas det att använda 2-3 näringsmedier med olika sammansättningar samtidigt.

Som standardmedium för primärisolering av tuberkulospatogenen och bestämning av dess läkemedelskänslighet rekommenderar WHO Löwenstein-Jensen-medium. Detta är ett tätt äggmedium på vilket mykobakterietillväxt erhålls på 20-25 dagen efter sådd av bakterioskopiskt positivt material. Sådd av bakterioskopiskt negativt material kräver en längre inkubationsperiod (upp till 10-12 veckor).

I vårt land har Finn-II-äggmediet som föreslagits av ER Finn blivit utbrett. Det skiljer sig genom att det istället för L-asparagin använder natriumglutamat, vilket utlöser andra vägar för syntesen av aminosyror i mykobakterier. Tillväxten sker på detta medium något tidigare, och frekvensen av mykobakterieisolering är 6-8 % högre än på Lowenstein-Jensen-mediet.

För att öka effektiviteten i den bakteriologiska diagnostiken av extrapulmonell tuberkulos är det lämpligt att inkludera modifierade Finn-II-medier i komplexet av näringsmedier. För att påskynda tillväxten tillsätts dessutom 0,05 % natriumtioglykolat i Finn-II-näringsmediet, vilket minskar syrekoncentrationen. För att skydda mykobakteriernas enzymsystem från toxiska produkter från lipidperoxidation tillsätts antioxidanten α-tokoferolacetat i Finn-II-näringsmediet i en koncentration av 0,001 μg/ml. Det diagnostiska materialet sås med standardmetoden.

I anti-tuberkuloslaboratorier i Ryssland används även andra modifieringar av täta näringsmedier: näringsmediet "Novaya" som föreslagits av GG Mordovsky, näringsmedierna A-6 och A-9 som utvecklats av VA Anikin, etc.

På grund av att skador uppstår på olika metaboliska system i den mikrobiella cellen under kemoterapi, förlorar en del av mykobakteriepopulationen förmågan att utvecklas normalt på konventionella näringsmedier och behöver osmotiskt balanserade (halvflytande eller flytande) näringsmedier.

Utvärdering och registrering av resultaten av diagnostisk materialodling

Vissa stammar och typer av mykobakterier växer långsamt, tillväxt kan förekomma redan vid den 90:e dagen. Antalet sådana kulturer är litet, men detta tvingar sådderna att förvaras i en termostat i 2,5-3 månader.

Virulenta kulturer av Mycobacterium tuberculosis växer vanligtvis på fasta äggmedier som R-formade kolonier av varierande storlek och utseende. Kolonierna är torra, skrynkliga, elfenbensfärgade och lätt pigmenterade. På andra medier kan Mycobacterium tuberculosis-kolonier vara fuktigare. Efter en kemoterapikur eller under behandling kan släta kolonier med fuktig tillväxt (S-former) isoleras.

Vid isolering av kulturer används en uppsättning specialstudier för att skilja tuberkulosmykobakterier från icke-tuberkulösa mykobakterier och syrafasta saprofyter.

Ett positivt svar ges efter en obligatorisk mikroskopisk undersökning av ett utstryk från de odlade kolonierna färgade enligt Ziehl-Neelsen. Vid mykobakterietillväxt finns klarröda stavar i utstryken, liggande enskilt eller i grupper, och bildar kluster i form av filt eller flätor. I unga kulturer, särskilt de som isolerats från patienter som behandlats med kemoterapi under lång tid, kännetecknas mykobakterier av uttalad polymorfism, upp till närvaron av korta, nästan kokkoida eller avlånga varianter som liknar svampmycel, tillsammans med stavformade former.

Intensiteten av mykobakteriell tillväxt anges enligt följande schema: (+) - 1–20 CFU i ett provrör (låg bakteriell utsöndring); (++) - 20–100 CFU i ett provrör (måttlig bakteriell utsöndring); (+++) - >100 CFU i ett provrör (riklig bakteriell utsöndring). Vid laboratoriediagnostik av tuberkulos räcker det inte att ge ett svar som anger huruvida mykobakterier har upptäckts med en viss metod eller inte. Det är också nödvändigt att ha en detaljerad uppfattning om volymen och naturen hos mykobakteriepopulationen, dess sammansättning och egenskaper. Det är dessa data som gör det möjligt att korrekt tolka processens tillstånd, planera taktik och snabbt justera behandlingen.

På senare år har agarbaserade näringsmedier med olika tillväxttillsatser och användning av en speciell gasblandning föreslagits för att accelerera tillväxten av mykobakterier. För att uppnå tillväxt av mykobakterier på dessa medier skapas en atmosfär med en ökad halt av koldioxid (4-7 %) under odlingen. För detta ändamål används speciella CO2-inkubatorer _. Automatiserade system för mykobakterieodling har dock fått den största utvecklingen: MGIT-BACTEC-960 och MB/Bact.

Ett sådant system är MGIT-systemet (mycobacteria growth indicating tube), vilket är en högteknologisk utveckling och är utformad för accelererad bakteriologisk diagnostik av tuberkulos och bestämning av mykobakteriers känslighet för förstahandsläkemedel och vissa andrahandsläkemedel. MGIT är utformat för användning som en del av VASTEC-960-enheten. Mikroorganismer odlas i speciella provrör med ett flytande näringsmedium baserat på ett modifierat Middlebrook-7H9-medium. För att stimulera tillväxten av mykobakterier och undertrycka tillväxten av främmande mikroflora används MGIT Growth Supplement och en blandning av PANTA-antibakteriella läkemedel.

Mikroorganismers tillväxt registreras optiskt. Den baseras på fluorescens, vilket sker när mykobakterier förbrukar syre under sin tillväxt. Ett syreberoende fluorokromfärgämne finns i botten av ett speciellt provrör och täcks med ett lager silikon. Reproduktion av mykobakterier leder till en minskning av mängden syre i provröret och en minskning av dess koncentration, vilket orsakar en ökning av fluorescensen, som blir synlig när provröret bestrålas med ultraviolett ljus och registreras automatiskt av fotosensorer inbyggda i VASTES-960-enheten. Luminescensintensiteten registreras i tillväxtenheter (GU). Tillväxtdata matas automatiskt in i en dator, där de kan sparas. Datoranalys av tillväxtkurvor kan ge information om förekomsten av olika pooler av mykobakterier, inklusive icke-tuberkulösa, och hjälper också till att utvärdera tillväxtegenskaperna hos mykobakterier.

Till följd av införandet av sådana system har tiden för mykobakteriernas tillväxt minskat avsevärt, med ett genomsnitt på 11 dagar på VASTEC-960 och 19 dagar på MB/Bact jämfört med 33 dagar på ett standardiserat tätt näringsmedium. Det bör noteras att dessa system kräver högkvalificerad personal. Sådd av material på flytande medier åtföljs nödvändigtvis av sådd på Löwenstein-Jensen-medium, vilket fungerar som backup i de fall där tuberkulosmykobakterier inte växer på andra medier.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Bestämning av läkemedelskänslighet hos mykobakterier

Bestämning av mykobakteriers spektrum och känslighetsgrad för antituberkulosläkemedel är av stor klinisk betydelse, såväl som för den epidemiologiska bedömningen av spridningen av läkemedelsresistent tuberkulos. Dessutom gör övervakning av läkemedelsresistens det möjligt att bedöma effektiviteten av antituberkulosprogrammet som helhet, vilket är en integrerad indikator på arbetet med alla komponenter i antituberkulosåtgärderna.

Frekvens och tidpunkt för läkemedelskänslighetstestning:

• innan behandlingen påbörjas, en gång för att bestämma behandlingsstrategi och taktik:
• Vid isolering av kulturer från olika material från en patient (sputum, BAL, urin, exsudat, cerebrospinalvätska etc.) undersöks alla isolerade stammar:
• i slutet av den intensiva behandlingsfasen i frånvaro av klinisk och radiologisk dynamik:
• om det är nödvändigt att ändra behandlingsregimen i händelse av:
  • frånvaro av sputumnegativitet;
  • omodling efter negativ sputumprov;
  • en kraftig ökning av mängden AFB i ett utstryk efter en initial minskning. Det är välkänt att stammar av Mycobacterium tuberculosis med olika läkemedelskänslighet isoleras från material från en patient med tuberkulos. Stammarnas känslighet för antituberkulosläkemedel kan variera i läkemedelsspektrum, grad, frekvens och hastighet av resistensutveckling.

Graden av läkemedelsresistens hos Mycobacterium tuberculosis bestäms i enlighet med etablerade kriterier, vilka är inriktade på resistensens kliniska betydelse och beror på läkemedlets antituberkulosaktivitet, dess farmakokinetik, koncentration i lesionen, maximal terapeutisk dos etc.

Bestämning av läkemedelskänslighet hos mykobakterier utförs för närvarande med hjälp av mikrobiologiska metoder:

• absoluta koncentrationer (utspädningsmetod på fast eller flytande näringsmedium),
• proportioner,
• resistanskoefficient.

Vanligtvis manifesteras resistens i form av visuellt observerad tillväxt av kolonier av mykobakterier tuberkulos, men det finns metoder som inducerar tillväxt i de tidiga stadierna av mykobakteriell celldelning i form av färgreaktioner. Dessa metoder minskar testtiden från 3-4 till 2 veckor.

Den absoluta koncentrationsmetoden som rekommenderas av WHO:s kemoterapikommitté har blivit utbredd i Ryssland som en enhetlig metod. Ur metodologisk synvinkel är den den enklaste, men kräver hög standardisering och precision i laboratorieprocedurerna. Läkemedelskänslighetstestet består av en uppsättning provrör med ett näringsmedium modifierat med antituberkulosläkemedel. Satsen består av 2-3 provrör med olika koncentrationer av vart och ett av de använda läkemedlen, ett kontrollprovrör med ett medium utan läkemedlet och ett provrör innehållande 1000 μg/ml natriumsalicylat eller 500 μg/ml paranitrobensoesyra för att detektera tillväxten av icke-tuberkulösa mykobakterier.

För att förbereda en uppsättning medier med preparat, använd ett modifierat Lowenstein-Jensen-medium (utan stärkelse), som hälls i kolvar. En viss volym av motsvarande utspädning av antituberkulosläkemedlet tillsätts till var och en av kolvarna. Kolvarnas innehåll blandas noggrant, hälls i provrör och koaguleras i lutande läge i 40 minuter vid en temperatur av 85 °C. Det rekommenderas att koagulera mediet i en elektrisk koagulator med automatisk temperaturkontroll. Medium med antituberkulosläkemedel

Första raden kan förvaras i kylskåp vid 2-4 °C i 1 månad, med läkemedel från andra raden - högst 2 veckor. Förvaring av medier med läkemedel vid rumstemperatur är oacceptabelt. Vid beredning av lösningar av antituberkulosläkemedel beaktas deras aktivitet, varvid koncentrationen beräknas med justering för molekylvikten hos den ospecifika delen av läkemedlet, renhet etc. För att bestämma läkemedlets känslighet används endast kemiskt rena substanser.

Principen för metoden är att bestämma koncentrationen av ett antituberkulosläkemedel som hämmar tillväxten av en betydande del av mykobakteriepopulationen. När den utförs korrekt har denna metod god tillförlitlighet.

Innan testet utförs är det nödvändigt att säkerställa att den isolerade kulturen av Mycobacterium tuberculosis inte innehåller främmande mikroflora. En homogen suspension innehållande 500 miljoner mikrobiella kroppar i 1 ml (optisk turbiditetsstandard 5 enheter) framställs från mykobakteriekulturen i en 0,9 % natriumkloridlösning. Den resulterande suspensionen späds med 0,9 % natriumkloridlösning (1:10) och 0,2 ml av suspensionen tillsätts till varje provrör i näringsmedieuppsättningen. De inokulerade provrören placeras i en termostat vid 37 °C och hålls horisontellt i 2–3 dagar så att den lutande ytan av näringsmediet inokuleras jämnt med suspensionen av Mycobacterium tuberculosis. Därefter flyttas provrören till ett vertikalt läge och inkuberas i 3–4 veckor. Resultaten registreras efter 3–4 veckor.

Eftersom det tar minst 1–1,5 månader att isolera patogenen från kliniskt material på näringsmedier, kan resultaten av bestämning av läkemedelskänslighet med denna metod erhållas tidigast 2–2,5 månader efter sådd av materialet. Detta är en av metodens största nackdelar.

Resultaten av resistenstestning för mykobakteriellt läkemedel tolkas utifrån vissa kriterier. På fast medium anses en kultur vara känslig för koncentrationen av läkemedlet i mediet om antalet mykobakteriella kolonier som odlats i ett givet provrör med läkemedlet inte överstiger 20 med riklig tillväxt i ett kontrollprovrör utan läkemedel. Endast om det finns fler än 20 kolonier anses kulturen vara resistent mot en given koncentration. I praktiken, när tillväxtresultat i provrör nära 20 CFU erhålls, är det nödvändigt att meddela den kliniska enheten att känsligheten eller resistensen i detta fall är gränsfall, eftersom detta ibland kan förklara den oklara dynamiken i kliniska indikatorer.

För olika preparat fastställs en viss koncentration vid vilken reproduktion av en kritisk andel av mykobakteriepopulationen observeras. Dessa koncentrationer kallas "kritiska". Storleken på tillväxten av mykobakteriepopulationen på ett näringsmedium med preparatet i en kritisk koncentration används som ett kriterium för stabilitet.

I den inhemska ftisiologipraxisen är man inte begränsad till att endast bestämma kritiska koncentrationer vid bestämning av läkemedelsresistens. Detta beror på att en utökad definition av patogenens läkemedelsresistensnivå gör det möjligt för läkaren att mer korrekt formulera kemoterapitaktik, med hjälp av kunskap om den förstärkande effekten av läkemedelskombinationer, för att förutse korsresistens eller använda mer effektiva läkemedel från den använda gruppen av antituberkulosläkemedel.

Den absoluta koncentrationsmetoden är den enklaste, men också den mest känsliga för fel som görs i dess implementering. Mer tillförlitlig, särskilt vid bestämning av känslighet för andrahandsläkemedel, och utbredd utanför Ryssland är proportionsmetoden. Den tar hänsyn till bristerna hos den absoluta koncentrationsmetoden, men den är mer arbetskrävande att implementera.

Metoden är mycket lik den absoluta koncentrationsmetoden. Beredningen av provrör med läkemedel är densamma som vid den absoluta koncentrationsmetoden. Emellertid minskas frödosen av tuberculosis mycobacterium-suspensionen med 10 gånger, vilket eliminerar frekvensen av spontan resistens hos vissa tuberculosis mycobacterium-stammar mot läkemedel som etambutol, protionamid och kapreomycin. Som kontroller används 2 eller 3 rör med en frödos lika med den i provrören, successivt utspädda 10 och 100 gånger. Kriteriet för resistens är andelen visuellt observerad tillväxt av tuberculosis mycobacterium. För första linjens läkemedel är kriteriet för resistens en överskottstillväxt på 1 % av den initiala populationen, för andra linjens läkemedel - en tillväxt på 1 eller mer än 10 % av den initiala, beroende på den valda kritiska koncentrationen.

År 1997 justerade WHO och Internationella unionen mot tuberkulos arbetsgruppen för att upptäcka resistens mot tuberkulosläkemedel dessa kriterier och föreslog att mykobakterier som växer på det täta Lowenstein-Jensen-äggmediet vid följande koncentrationer skulle betraktas som resistenta:

• dihydrostreptomycin - 4 μg/ml;
• isoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

År 2001 föreslogs kritiska koncentrationer för följande andrahandsläkemedel (för en kritisk andel på 1 %):

• kapreomycin - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamycin - 30 μg/ml;
• viomycin - 30 μg/ml;
• cykloserin - 40 mcg/ml;
• aminosalicylsyra - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacin - 2 mcg/ml.

Tillväxtresultaten bedöms efter 4 veckor som preliminära och efter 6 veckors odling som slutgiltiga.

För att bestämma läkemedelskänslighet för pyrazinamid, vilket används flitigt i modern tuberkulose-kemoterapi, är den rekommenderade kritiska koncentrationen 200 μg/ml. Det finns dock fortfarande ingen allmänt accepterad metod för att bestämma läkemedelsresistens mot detta läkemedel på fasta näringsmedier, eftersom dess antibakteriella aktivitet endast manifesteras i en sur miljö (pH <6), vilket är tekniskt svårt att upprätthålla. Dessutom är många kliniska kulturer av Mycobacterium tuberculosis ovilliga att odla på äggmedier med en sur miljö.

För att bedöma kvaliteten på resultaten av bestämning av mykobakteriers läkemedelskänslighet rekommenderas att kontrollera varje ny sats av Lowenstein-Jensen-medium genom parallell bestämning av känsligheten hos standardmuseistammen H37Rv. Dessutom finns det vissa mikrobiologiska kriterier som måste uppfyllas för att metoderna ska ge ett väl reproducerbart och korrekt tolkat resultat. Dessa inkluderar viabiliteten hos tuberkulosmykobakteriekulturen, reglerna för att erhålla en homogen suspension och suspension, reglerna för att välja tuberkulosmykobakteriekulturer och representativiteten hos den valda bakteriemassan. Tillförlitligheten för att bestämma läkemedelsresistens minskar vid extremt dålig bakteriell utsöndring.

Nyligen har metoden för att bestämma läkemedelskänslighet med hjälp av automatiserade system erkänts som lovande. De mest avancerade inom detta område är utvecklingar baserade på VASTEC MGIT-960. I detta fall bestäms läkemedelskänsligheten för tuberkulosmykobakterier baserat på en modifierad proportionsmetod. Under bestämningen jämförs tillväxthastigheten för tuberkulosmykobakterier i kontrollröret och i rör med läkemedel. För att bestämma känsligheten för streptomycin, isoniazid, rifampicin och etambutol används berikande tillsatser och antibiotika som ingår i SIRE-kitet. För att bestämma känsligheten för pyrazinamid används PZA-kitet. Under testet inokuleras provrör med läkemedel med en suspension av tuberkulosmykobakterier, samt kontrollrör med en 100-faldig utspädning av suspensionen för alla läkemedel, med undantag för pyrazinamid, där suspensionsutspädningen är 10 gånger. Kriteriet för stabilitet är mykobakterietillväxtindikatorn på 100 GU när tillväxten i kontrollröret når 400 GU (se "Kulturella metoder för isolering av mykobakterier"). Resultaten registreras och tolkas automatiskt och ställs in av det angivna eller valda programmet.

De slutliga koncentrationerna i provröret med flytande näringsmedium används som kritiska koncentrationer. För närvarande har kritiska koncentrationer utvecklats för både första linjens läkemedel och vissa andra linjens läkemedel. Det bör noteras att bestämningen av tuberkulosmykobakteriers känslighet för cykloserin och aminosalicylsyra endast utförs på äggnäringsmedium.

Ett detaljerat protokoll för att arbeta med det beskrivna systemet möjliggör läkemedelskänslighetstestning både på en isolerad kultur (med ett tätt näringsmedium) och med hjälp av primär tillväxt av mykobakterier i ett MGIT-provrör. Det senare alternativet minskar avsevärt den tid som krävs för att genomföra kulturstudier, vilket möjliggör att fullständiga resultat av kulturen av tuberkulosmykobakterier (inklusive information om läkemedelskänslighet) kan erhållas inom 3 veckor efter materialinsamling, medan den traditionella metoden endast kan ge detta senast den 3:e månaden. Tidiga resultat, när patienten är i den intensiva behandlingsfasen, kan kompensera för den relativt höga kostnaden för studierna.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Differentiering av mykobakterier

Med tanke på att de använda näringsmedierna inte är strikt selektiva anses efterföljande differentiering av de isolerade mykobakterierna vara obligatorisk. Behovet av differentiering av mykobakterier beror på ett antal egenskaper hos patologiska processer orsakade av representanter för släktet: olika förlopp och utfall av tuberkulos och mykobakterios, förekomsten av naturlig läkemedelsresistens mot vissa antituberkulosläkemedel.

Det är erkänt att den primära identifieringen av mykobakterier i M. tuberculosis-komplexet från icke-tuberkulösa mykobakterier utförs enligt följande egenskaper: tillväxthastighet på tätt näringsmedium, pigmentbildning, kolonimorfologi, förekomst av syraresistens och den optimala temperaturen för tillväxt.

Tyvärr finns det ingen enskild laboratoriemetod som tillförlitligt kan skilja mykobakterier av M. tuberculosis-komplexet från andra syrafasta mykobakterier; en kombination av de ovan beskrivna tecknen med resultaten av ett antal biokemiska tester som anges nedan möjliggör dock identifiering av mykobakterier av M. tuberculosis-komplexet med en sannolikhet på upp till 95 %.

För att skilja mykobakterier av M. tuberculosis-komplexet (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii och andra) från långsamt växande icke-tuberkulösa mykobakterier används grundläggande biokemiska tester för att detektera förekomsten av följande tecken:

• förmåga att producera nikotinsyra (niacintest):
• nitratreduktasaktivitet;
• termostabilt katalas;
• tillväxt på ett medium med natriumsalicylat (1 mg/ml).

Som ett ytterligare test kan även tillväxttester på ett medium innehållande 500 μg/ml para-nitrobensoesyra eller 5 % natriumklorid användas.

Många bakteriologiska laboratorier identifierar dessa mikroorganismer endast på komplex nivå, vilket beror på laboratoriernas begränsade kapacitet och specialisternas metodologiska förmåga.

I de flesta fall i praktiken är följande tester tillräckliga för att skilja mellan M. tuberculosis och M. bovis: niacin, nitratreduktas, pyrazinamidas och tillväxtregistrering på ett medium innehållande 2 μg/ml tiofen-2-karboxylsyrahydrazid. Det tas hänsyn till att mykobakterier i M. tuberculosis-komplexet kännetecknas av följande uppsättning egenskaper:

• långsam tillväxt (mer än 3 veckor);
• tillväxttemperatur inom 35-37 ^° C;
• frånvaro av pigmentering (elfenbensfärg);
• uttalad syrafast färgning;
• positivt niacintest;
• positivt nitratreduktastest;
• frånvaro av termostabilt katalas (68 ^° C).
• brist på tillväxt på Löwenstein-Jensen-medium innehållande:
  • 1000 µg/ml natriumsalicylsyra,
  • 500 mcg/ml para-nitrobensoesyra,
  • 5 % natriumklorid:
• tillväxt i närvaro av 1–5 μg/ml tiofen-2-karboxylsyra.

Relevansen av differentiering av isolerade mykobakterier kommer att öka avsevärt i takt med att registreringsfrekvensen av hiv/aids-fall associerade med tuberkulos eller mykobakterios ökar. För närvarande finns det ingen absolut säkerhet om de praktiska regionala laboratoriernas beredskap att korrekt utföra denna arbetsvolym.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Immunologisk diagnostik av tuberkulos

Det finns ett antal universella fenomen, preparat och immunologiska tester som ursprungligen upptäcktes specifikt inom tuberkulos eller i modellen för immunsvar mot mykobakterier. Dessa inkluderar BCG och tuberkulin, ett sådant fenomen som hud-DST (tuberkulintester - Pirquet- och Mantoux-reaktioner), reaktionen på subkutan administrering av tuberkulin till sensibiliserade djur (Koch-fenomenet). Några av de första antikropparna vid infektionssjukdomar upptäcktes också vid tuberkulos. Ju djupare förståelsen av mekanismerna för anti-tuberkulosimmunitet och deras genetiska kontroll är, desto bredare kan naturligtvis användningen av immunologiska metoder och preparat som påverkar immuniteten vara för att lösa praktiska problem inom ftisiologi.

Det viktigaste och mest komplexa praktiska problemet för närvarande anses vara att upptäcka tuberkulos i samband med massscreening av befolkningen. Trots många rapporter om "framgångar" (på begränsat material) finns det dock ingen immunologisk metod (reproducerbar i "alla händer") eller läkemedel som är lämpliga för dessa ändamål.

Immunologiska metoder, särskilt serologiska studier (bestämning av antigener, antikroppar) och tuberkulinprovokationstester, används ofta i klinisk praxis.

Serologiska metoder, som bestämmer antigener och antikroppar i olika miljöer i kroppen, är i första hand bland immunologiska studier som används inom differentialdiagnostik.

Specificiteten för bestämningen av antikroppar mot mykobakterier tuberkulos beror på de antigener som används i immunanalysen. Ett betydande antal antigener har föreslagits, varav det första är tuberkulin PPD:

• PPD och andra komplexa preparat från odlingsvätska;
• ultraljudsupplösningsmedel;
• Tritonextrakt och andra komplexa cellväggspreparat;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• strängfaktor (trehalos-6,6-di-mykolat);
• fenoliska och andra glykolipider;
• lipopolysackarider;
• fibronektinbindande antigen;
• proteiner (oftast rekombinanta); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA, etc.

Som ett resultat av många års forskning av ryska och utländska forskare har de viktigaste mönstren för antikroppsbildning och effektiviteten av serologisk diagnostik av tuberkulos identifierats: ju mer komplext antigenet är, desto högre känslighet och desto lägre specificitet hos testerna. Specificiteten varierar i olika länder beroende på befolkningens infektion med M. tuberculosis och icke-tuberkulösa mykobakterier, på BCG-vaccination etc. Hos barn är informativiteten hos serodiagnostik lägre än hos vuxna. Vid primär tuberkulos (oftare hos barn) är bestämningen av IgM mer informativ; vid sekundär tuberkulos - IgG. Hos HIV-infekterade personer är informativiteten hos serodiagnostik vid bestämning av antikroppar minskad. Effektiviteten av antikroppsbestämning beror på ett antal "kliniska moment": processens aktivitet (närvaro eller frånvaro av "isolering" av mykobakterier, förekomst av karieshålor, graden av infiltration), processens prevalens, dess varaktighet.

Enzymimmunoassaymetodens (EIA) känslighet är cirka 70 %. Studiens otillräckliga effektivitet beror på dess låga specificitet. Tidigare övervägdes möjligheterna att använda serologisk screening i högriskgrupper, särskilt bland personer med posttuberkulosförändringar i lungorna.

För att öka specificiteten hos ELISA söks efter mer specifika antigener, inklusive de som erhållits genom genteknik: ESAT-6, etc. (se ovan). Användningen av strikt specifika antigener (38 kDa, ESAT) ökar specificiteten, men minskar analysens känslighet avsevärt. Tillsammans med ELISA (experimentella laboratorietestsystem, såsom Pathozyme ELISA-kit) erbjuds även immunokromatografiska kit med lateral filtrering (Mycodot), liksom andra liknande tester (membranpunktsanalys) med visuell bedömning av testresultatet. Vid utförande av dessa tester tar analysen 10-30 minuter; de kräver ingen specialutrustning, de kräver visuell bedömning av resultaten, vilket är förknippat med en viss subjektivitet. Dessa metoder har ungefär samma känslighets- och specificitetsegenskaper (70 % respektive 90-93 %) som traditionell ELISA.

Användningen av immunanalysmetoder har ett visst värde som en kompletterande metod som beaktas i det komplex av metoder som används vid differentialdiagnos av tuberkulos, särskilt vid diagnos av dess extrapulmonära former. ELISA-metoden är mest effektiv vid diagnos av tuberkulös meningit vid undersökning av cerebrospinalvätskan. I detta fall är analysens sensitivitet 80–85 % och specificiteten 97–98 %. Det finns information om effektiviteten av att bestämma antikroppar mot Mycobacterium tuberculosis i tårvätska vid diagnos av tuberkulös uveit.

Induktion av gammainterferonsyntes in vitro

Gammainterferon (IFN-γ) är en faktor för specifikt immunförsvar, vilket uppnås genom att aktivera makrofagernas enzymsystem. Induktion av IFN-γ-syntes av sensibiliserade T-lymfocyter orsakas av deras interaktion med mykobakteriella antigener.

Både tuberkulin PPD och specifika antigener som erhållits genom genteknik används som antigener, i synnerhet ESAT-6-antigenet (tidigt utsöndrat antigen med en molekylvikt på 6 kDa) och CFP-10 (kulturfiltratprotein, 10 kDa). Genetiskt modifierade eller rekombinanta antigener saknas i cellerna i BCG-vaccinet och andra mykobakterier. Vid användning av tuberkulin är resultaten av IFN-γ-induktionstestet jämförbara med resultaten av tuberkulinhudtestet (direkt korrelation). Vid användning av genetiskt modifierade antigener är testresultaten mer specifika och beror inte på tidigare BCG-vaccination. Vid undersökning av vaccinerade individer som inte har haft kontakt med tuberkulosinfektion är testets specificitet 99 %. Testets känslighet bland tuberkulospatienter varierar från 81 till 89 %.

Tester och diagnostik har utvecklats baserat på korttidsodling av helblodsceller eller mononukleära celler isolerade från blod med tuberkulosmykobakterieantigener in vitro, följt av bestämning av IFN-γ-koncentrationen eller räkning av antalet T-lymfocyter som syntetiserar IFN-γ. Koncentrationen av interferon som syntetiseras i ett provrör bestäms med ELISA med användning av monoklonala antikroppar som binder IFN-γ. Därefter, med hjälp av kalibrering av standard IFN-γ, bestäms dess koncentration i provrörs- eller plattbrunnarna.

I Elispot-testet räknas antalet T-celler som syntetiserar IFN-γ på ytan av en skål belagd med antikroppar mot IFN-γ.

Utvecklarna av in vitro-testet för IFN-γ-induktion, som är godkänt av den amerikanska läkemedelsmyndigheten Food and Drug Administration, hävdar att testet inte kan skilja latent tuberkulosinfektion från aktiv tuberkulos. Därför har testet inget direkt diagnostiskt värde i regioner med hög infektionsgrad. I vårt land kan det dock användas för att skilja tuberkulosinfektion hos barn från postvaccinationsallergi, samt för att bedöma nivån av specifik immunitet under behandling.

För närvarande studeras ett inhemskt testsystem för att bestämma induktionen av IFN-γ-syntes av specifika tuberkulosantigener in vitro.

Immunstatus och förlopp av tuberkulos, immunkorrigering

Under behandlingen av tuberkulos sker förändringar i antigenemi och immunsystemets tillstånd hos människor.

Uppgifterna om förändringar i exsudat och vävnader är i stort sett motsägelsefulla. Det enda som kan noteras med full fog är att tuberkulösa granulom som regel innehåller ett betydande antal aktiverade T-lymfocyter.

Det är vettigt att uppehålla sig vid ytterligare två punkter som är nödvändiga för att förstå immunologiska mekanismers roll i behandlingen av tuberkulos hos människor:

• AIDS-patienter har en särskilt hög incidens av att utveckla multipel läkemedelsresistens;
• Vid multipel läkemedelsresistens (och i frånvaro av HIV-infektion) är immunstörningar (främst T-cellsimmunitet) särskilt betydelsefulla.

Vid tuberkulos används olika metoder för immunkorrigering i stor utsträckning: för det första är det läkemedel som huvudsakligen verkar på T-cellsimmunitet och det mononukleära fagocytsystemet (tymushormoner, isofon, likopid, polyoxidonium, etc.), såväl som hela (försvagade) mykobakterier och deras komponenter.

Molekylärbiologisk diagnostik av tuberkulos

Molekylärbiologiska metoder inom diagnostik av infektionssjukdomar omfattar huvudsakligen metoder baserade på manipulation av genomiskt material från bakteriella och virala patogener för att identifiera specifikt genetiskt material - DNA-sektioner med en nukleotidsekvens specifik för en given art eller stam av patogen, för att analysera specifika DNA-sekvenser i gener som bestämmer patogenens känslighet för vissa läkemedel, samt för att analysera den funktionella aktiviteten hos vissa gener hos patogenen. Molekylärbiologiska metoder har blivit utbredda inom vetenskaplig forskning och praktisk tillämpning inom diagnostik och övervakning av olika bakteriella och virala infektioner efter upptäckten av polymeraskedjereaktionen 1985 av Carrie Mullis (Nobelpristagare 1989).

Principer och funktioner hos polymeraskedjereaktionsmetoden

PCR möjliggör amplifiering (multiplikation) av en nukleotidsekvens (ett fragment av patogen-DNA) i ett provrör på några timmar miljontals gånger. Att reaktionen utförs i närvaro av enskilda DNA-kedjor avgör analysens exceptionellt höga känslighet.

Nukleotidsekvensen för vissa delar av DNA-kedjan bestämmer mikroorganismens genetiska unikhet, vilket förklarar PCR:s höga specificitet.

Betydelsen av denna metod för att upptäcka och studera egenskaperna hos Mycobacterium tuberculosis beror på mikroorganismens biologiska egenskaper, som har mycket långsam tillväxt: fördubblingstiden för DNA från Mycobacterium tuberculosis under deras odling är 12–24 timmar.

Principen för PCR-metoden är amplifiering - multipel, miljontals gånger multiplikation av sektioner av en specifik DNA-sekvens i ett provrörsmikrovolym med cyklisk upprepning av följande tre reaktionssteg, som vart och ett sker i en annan temperaturregim:

• Steg I - denaturering av dubbelsträngat DNA vid uppvärmning med divergens av dess kedjor;
• Steg II - komplementär bindning (hybridisering) av primers (primande oligonukleotider) med ändsektionerna av kedjorna i ett strikt specifikt DNA-fragment valt för amplifiering;
• Steg III – komplettering av DNA-fragmentkedjan med hjälp av termostabilt DNA-polymeras.

För amplifiering måste provröret innehålla matrix-DNA-molekyler. Fyra typer av deoxynukleosidtrifosfater (nukleotider) innehållande motsvarande kvävebaser: adenin (A), tymin (T), guanin (G), cytosin (C); artificiellt syntetiserade primeroligonukleotider (primers) bestående av 18–20 baspar; ett termostabilt enzym, DNA-polymeras, med ett temperaturoptimum på 68–72 ^° C, och magnesiumjoner.

PCR:s specificitet beror på valet av DNA-fragment. I enlighet med detta syntetiseras flankerande primeroligonukleotider. Specificiteten för hybridisering och komplettering av DNA-kedjan bestäms av principen om komplementaritet mellan följande par av kvävebaser: adenin-tymin, guanin-cytosin.

För att bestämma genomet för tuberkuloskomplexmykobakterier är det mest effektiva amplifieringsmålet i de flesta testsystem IS6110-DNA-fragmentet, vilket i de flesta tuberkulosmykobakteriestammar har ett betydande antal (10-20) upprepningar i genomet, vilket tillsammans med specificitet säkerställer hög känslighet i analysen. Samtidigt har tuberkulosmykobakteriestammar med ett litet antal upprepningar eller frånvaro av IS6110-fragmentet beskrivits.

Extraktion av DNA-molekyler från ett biologiskt prov

För att utföra PCR måste patogenens DNA-molekyler isoleras från det biologiska materialet i en minimal volym, med en minimal mängd ospecifikt DNA och olika hämmare av enzymet - DNA-polymeras.

Provberedning måste utföras under förhållanden som förhindrar korskontaminering av de prover som studeras med isolerade DNA-molekyler. Detta kräver förbehandling av rummet med ultraviolett ljus, golv och arbetsytor på bord och apparater - med klorhaltiga lösningar. Det är också nödvändigt att använda rena handskar, engångsprovrör och spetsar för automatiska pipetter.

För att isolera DNA från Mycobacterium tuberculosis från kliniska prover (cerebrospinalvätska, bronksköljning) som inte innehåller ett stort antal leukocyter, cellrester eller salter, räcker det att centrifugera provet med 3–4 tusen varv per minut, tillsätta 20–30 µl av en 2 % lösning av Triton X-100 till sedimentet och värma vid 90 ^° C i 30 minuter.

Beredning av sputumprover kräver effektiv kondensering, vanligtvis med användning av 4 % natriumhydroxid och N-acetyl-L-cystein (NALC) vid 50–80 mg per prov, beroende på provets viskositet. NALC-lösningen bör beredas ex tempore, eller så kan NALC-pulver tillsättas torrt direkt till provet. Efter kondensering bör proverna centrifugeras i 15 minuter vid 3 500–4 000 rpm (3 000 g) i 50 ml skruvkorkrör, dvs. under samma förhållanden som rekommenderas för sputumberedning före odling.

För att extrahera DNA från sediment används oftast en metod baserad på användning av en 5-6 molar lösning av guanidinisotiocyanat som lyseringsreagens och mikroporösa kiseloxidpartiklar ("kiselgur") som sorberar DNA-molekyler. Ospecifika substanser, inklusive eventuella hämmare, tvättas sedan i en 2,5 molar lösning av guanidinisotiocyanat och en etanollösning, varefter DNA-molekylerna desorberas i vatten, och dessa prover används för att utföra PCR. För att förenkla tekniken för DNA-extraktion ersätts ofta "kiselgur" med magnetiska mikropartiklar belagda med kiseloxid. I detta fall används ett speciellt magnetiskt stativ för mikrorör för att fälla ut partiklarna istället för centrifugering.

En originell metod för immunomagnetisk separation av mykobakterier med efterföljande extraktion av patogen-DNA har utvecklats i Ryssland. För immunomagnetisk separation av tuberkulosmykobakterier används ferropartiklar med en storlek på 3-5 μm, belagda med kiseloxid, till vilka polyklonala (kanin)antikroppar mot tuberkulosmykobakterier är bundna med hjälp av en kemisk bindning. Sputumprover neutraliseras efter alkalisk lys med en sur Tris-HCl-lösning och inkuberas med ett immunomagnetiskt sorbent. Därefter samlas immunferropartiklarna upp med hjälp av en magnetstav med utbytbar spets, överförs till ett mikrorör och fälls ut. 20-30 μl av en 2% Triton X-100-lösning tillsätts och upphettas i 30 minuter vid 90 ^° C. Supernatanten används som DNA-matris för PCR-analys.

Ett svårt problem är extraktion av DNA från tuberkulosmykobakterier från biopsiprover. För biopsilys används enzymet proteinas K i en slutkoncentration på 200–500 mg/l vid en temperatur på 56 ^° C över natten. Därefter extraheras det med en av de kända metoderna. Överskott av ospecifikt DNA vid PCR-analys av biopsiprover orsakar ofta hämning av reaktionen, vilket kräver upprepad DNA-extraktion.

Metoder för resultatdetektering

Efter avslutad reaktion identifieras de amplifierade fragmenten av patogen-DNA med hjälp av olika metoder.

Gelelektroforesmetoden är välkänd. I detta fall identifieras det erhållna DNA-fragmentet med hjälp av en positiv kontroll som innehåller det önskade specifika DNA-fragmentet, eller med hjälp av en tidigare känd storlek (antal nukleotidpar) på fragmentet, vilken bestäms med hjälp av en standardmolekylär markör.

I närvaro av ett specifikt färgämne - etidiumbromid, som ingår i dubbelsträngat DNA, avslöjas det syntetiserade DNA-fragmentet som ett band som lyser under påverkan av ultraviolett ljus.

Storleken på DNA-fragmentet, bestämd genom elektrofores baserat på det tillryggalagda avståndet från början, måste motsvara en känd molekylviktsmarkör eller positiv kontroll.

Andra metoder för att bestämma PCR-resultat baseras på hybridisering av enkelsträngade PCR-produkter med en komplementär oligonukleotid - en DNA-sond märkt med biotin, följt av detektion med hjälp av en enzymatisk reaktion genom att till exempel binda ett streptavidin-alkaliskt fosfataskonjugat till biotin.

Baserat på denna typ av detektion har PCR-analysatorer skapats där detektionen av PCR-resultat utförs automatiskt som ett resultat av att den optiska densiteten i prover avläses efter att den enzymatiska reaktionen har inträffat.

Nackdelarna med dessa metoder inkluderar risken för kontaminering inom laboratoriet med ganska korta fragment av DNA-molekyler. När dessa molekyler kommer in i nyligen testade prover blir de en matris för PCR och leder till falskt positiva resultat.

För att förhindra falskt positiva resultat införs strikta regler för att separera och isolera rum: för DNA-extraktion från biologiska prover; rum för detektion av resultat (elektrofores) från den rena zonen. Dessa rum representerar en zon med sannolik kontaminering. En annan isolerad zon är ett rent rum för att införa de DNA-prover som studeras i provrör med reaktionsblandningen för PCR. Och slutligen antas det att huvudanordningen - DNA-förstärkaren - ska tas ut till ett separat rum, eventuellt kontorsrum.

För att förhindra kontaminering av produkter från tidigare reaktioner - amplikoner, innehåller vissa PCR-testsystem deoxynukleosid uridin istället för deoxynukleosid tymidin, vilket byggs upp i motsvarande position under in vitro-kedjesyntes, dvs. den kvävehaltiga basen tymin som finns i nativt DNA ersätts med uracil. Uracil-DNA-glykosylas som tillsätts till reaktionsblandningen av det analyserade materialet förstör endast kontaminerande fragment med deoxyuridin, men inte det nativa analyserade DNA som innehåller deoxytymidin. Efterföljande uppvärmning vid 94 ^° C inaktiverar detta enzym och stör inte amplifieringen i PCR.

Det finns ett testsystem baserat på isotermisk amplifiering av rRNA, för vilket omvänd transkription och syntes av DNA-molekyler först utförs, vilka i sin tur utgör matrisen för efterföljande syntes av RNA-molekyler. RNA-amplikoner detekteras med hjälp av en akridinfärgad DNA-sond under hybridisering i en reaktionsrörslösning. Denna metod har, förutom hög känslighet, fördelen att analysen utförs i ett enda rör, vilket förhindrar kontaminering. Enligt författarna når känsligheten för denna metod i respiratoriska prover 90 % med en specificitet på 99–100 %.

Nya detektionsmetoder implementeras i realtids-PCR. Dessa metoder skiljer sig främst genom att PCR och detektion av dess resultat utförs samtidigt i ett slutet provrör. Detta förenklar inte bara analysmetoden tekniskt, utan förhindrar också kontaminering av laboratorielokaler och prover med produkter från tidigare PCR.

Vid realtids-PCR detekteras resultaten genom fluorescens som uppstår vid hybridisering av en fluorogen DNA-sond med ett specifikt DNA-fragment som amplifierats under PCR. Strukturen hos fluorogena DNA-sonder är konstruerad på ett sådant sätt att den fluorescerande markören frigörs som ett resultat av en enzymatisk reaktion eller distanserar sig från fluorescenssläckarmolekylen endast vid specifik hybridisering med den önskade DNA-molekylen som amplifierats under PCR. När antalet molekyler som hybridiseras med sonden ökar, är ökningen av fluorescens till en detekterbar nivå proportionell mot antalet molekyler av den amplifierade produkten. Eftersom antalet DNA-fragmentmolekyler fördubblas under varje PCR-cykel, är antalet cykler från vilka fluorescens detekteras och ökar omvänt proportionellt mot antalet DNA-molekyler i det ursprungliga provet. Om flera olika kända koncentrationer av molekyler av motsvarande fragment av tuberculosis mycobacterium DNA introduceras i reaktionen som en kalibrator, kan antalet DNA-genom i materialet som studeras beräknas med hjälp av ett datorprogram.

Varje standardprov dupliceras. Det kvantitativa kriteriet är det minsta antalet PCR-cykler som krävs för att detekterbar fluorescens ska börja och växa. Abskissaxeln är antalet cykler; ordinataaxeln är fluorescensvärdet. DNA-koncentrationerna är omvänt proportionella mot antalet cykler som krävs för att fluorescens ska uppträda. Fönstren i den högra kolumnen (21-32) visar cykelnumren för motsvarande koncentrationer. Skillnaderna mellan 10-faldiga koncentrationer av DNA-fragment 10 ² - 10 ⁶ ml är 3,2-3,4 cykler. För två patienter var koncentrationerna av IS6110-fragment cirka 10 ³ /ml och 10 ⁴ /ml. Med hänsyn till antalet upprepningar (6-20) av de analyserade fragmenten i genomet för Mycobacterium tuberculosis är antalet Mycobacterium tuberculosis i de kliniska proverna cirka 100 respektive 1000 celler.

Tillämpning av PCR vid diagnos av tuberkulos

PCR-metoden används i störst utsträckning för snabbdiagnos av tuberkulos - detektion av Mycobacterium tuberculosis i kliniska prover: sputum, bronksköljningar, pleuraexsudat, urin, cerebrospinalvätska, osteolyspunkteringar, aspirat från kvinnliga könsorgan och olika biopsier. I en studie i Holland med cirka 500 prover av sputum och bronksköljningar från 340 patienter med en bekräftad diagnos av lungtuberkulos studerades den jämförande känsligheten för PCR-, odlings- och smearmikroskopimetoderna. Analysens känslighet var 92,6, 88,9 respektive 52,4%. Specificiteten för alla metoder var cirka 99 %.

En jämförelse gjordes av effektiviteten vid detektion av Mycobacterium tuberculosis med hjälp av smearmikroskopi, sådd på Lowenstein-Jensen-medium, VASTES-testsystemet och PCR-analys. PCR visade en känslighet på 74,4 %, mikroskopi - 33,8 %, sådd på fast medium - 48,9 % och VASTES - 55,8 %. Den genomsnittliga detektionstiden för sådd på Lowenstein-Jensen-medium är 24 dagar, VASTES - 13 dagar, PCR - 1 dag.

Potentialen för att använda PCR som en känslig och snabb metod för att övervaka effektiviteten av tuberkulosbehandling diskuteras också.

Detektion av Mycobacterium tuberculosis-DNA med PCR-metoden med effektiv kemoterapi bestäms över en längre tidsperiod - i genomsnitt 1,7 månader jämfört med bakteriell utsöndring bestämd med fluorescensmikroskopi, och 2,5 månader jämfört med bakteriologisk undersökning.

Diagnos av extrapulmonära former av tuberkulos

PCR:s betydelse som känslig metod är särskilt stor för extrapulmonella former, eftersom det är just i dessa former som kliniska och radiologiska metoder och traditionella bakteriologiska metoder för att bestämma Mycobacterium tuberculosis i diagnostiska material är ineffektiva.

Vid undersökning av urinprover var PCR-analysresultaten positiva hos 16 av 17 patienter med aktiv tuberkulos i urinvägarna och negativa hos 4 patienter med inaktiv njurtuberkulos och 39 patienter med icke-tuberkulösa sjukdomar i urinvägarna.

Effektiviteten av PCR-analys vid studien av benmärgsaspirat hos patienter med feber av okänd genes med misstänkt tuberkulös sjukdomsart har demonstrerats. För diagnos av tuberkulös lymfadenit hos barn studerades 102 punktionsaspirat och biopsiprover från 67 barn med misstänkt tuberkulös lymfadenit. Positiva resultat erhölls: med realtids-PCR - 71,6%, fluorescensmikroskopi - 46,3%, odlingsstudie - 41,8%. I studien av 50 lymfkörtelbiopsier hos patienter med kattklorsjukdom var alla resultat negativa. Således demonstrerades 100% specificitet av PCR-analysen. I samma arbete visades möjligheten att detektera M. avium vid punktionsbiopsi av lymfkörtlar.

Diagnos av kvinnlig genital tuberkulos vid infertilitet är känt för att vara ett av de svåraste diagnostiska problemen. Positiva resultat erhölls i PCR-studier av endometriebiopsier, endometrieaspirat och Douglas-påsevätskeprover hos 14 (56 %) av 25 patienter som undersöktes laparoskopiskt med misstänkt tuberkulos. Smearmikroskopi och odlingsstudier gav 1 respektive 2 positiva resultat. Dessa fall var också PCR-positiva. De flesta PCR-positiva resultaten var i fall med karakteristiska drag för tuberkulos enligt histologisk undersökning; ett mindre antal var i fall med misstänkt tuberkulos enligt laparoskopi. Endast ett positivt PCR-resultat erhölls i avsaknad av laparoskopiska data för tuberkulos.

Vid diagnostisering av extrapulmonella former av tuberkulos har läkare ofta frågor om möjligheten att identifiera patogenen vid undersökning av blodprover med PCR-metoden. Litteraturdata indikerar att detektion av Mycobacterium tuberculosis-DNA från blodprover är möjlig vid avancerade former av HIV-infektion. Mycobacterium tuberculosis-DNA detekterades endast vid generaliserad tuberkulos i olika organ hos patienter med transplanterad njure och immunsuppression.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Artidentifiering av mykobakterier

PCR-metoden kan vara ganska effektiv för snabb identifiering av mykobakterier i tuberkuloskomplexet och vissa typer av icke-tuberkulösa mykobakterier efter att de erhållit sin primära tillväxt. I detta fall kan användningen av PCR spara 7–10 dagar som krävs för efterföljande kulturell identifiering av ett positivt resultat. PCR-studien är tekniskt sett mycket enkel, eftersom den inte kräver komplex provberedning av kliniskt material för att uppnå hög känslighet. Vid undersökning av 80 positiva kulturer i ett sådant testsystem (MB BacT. från Organon) var alla positiva PCR-analysresultat strikt specifika och utfördes inom 1 dag. För att identifiera andra typer av mykobakterier när de erhålls i kultur hybridiseras patogen-DNA med specifika DNA-prober märkta med akridin, och stammarna detekteras genom uppkomsten av kemiluminescens med hjälp av en kemiluminometer eller på nitrocellulosaremsor med visuell bedömning efter hybridisering. Detta kit identifierar ett begränsat antal arter: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii och M. gordonae.

A. Telenti et al. utvecklade också en relativt enkel och billig metod för artidentifiering av kliniskt viktiga mykobakterier baserad på PCR och efterföljande behandling med två restriktionsenzymer (enzymer som har förmågan att skära en DNA-molekyl vid specifika punkter). I detta fall amplifieras ett DNA-fragment som kodar för ett värmechockprotein (65 kDa), varefter DNA-fragmentet som erhållits vid PCR, 439 nukleotidpar stort, behandlas separat med två enzymer - Bste II och Нае III. Sedan, med hjälp av agarosgelelektrofores, analyseras de två erhållna produkterna, varvid deras storlekar (antal nukleotidpar) bestäms med hjälp av en uppsättning standard-DNA-fragment (molekylära DNA-markörer) från 100 till 1000 nukleotidpar i längd. I var och en av de definierade arterna (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) hittas 2 eller 3 DNA-fragment av olika storlekar för varje restriktionsenzym. Kombinationen av de resulterande DNA-fragmenten av olika storlekar gör att dessa arter kan differentieras från varandra.

En teknik för biologiska DNA-mikroarrayer utvecklas som kommer att hjälpa till att identifiera mer än 100 arter av mykobakterier i en enda studie.

Artidentifiering kan också utföras med hjälp av PCR-amplifiering av den variabla regionen av 16S rRNA följt av sekvensering av amplikonerna i jämförelse med motsvarande primärstruktur, vilket möjliggör identifiering av mer än 40 arter av mykobakterier.

PCR kan också användas för att identifiera arter inom tuberculosis mycobacterium-komplexet, inklusive differentiering mellan M. bovis och M. bovis BCG. Detta görs genom att analysera närvaron eller frånvaron av vissa gener i de genomiska regionerna RD1, RD9 och RD10. RD1 saknas i M. bovis BCG, men finns i virulenta arter, inklusive M. bovis.

Bestämning av läkemedelskänslighet för Mycobacterium tuberculosis med hjälp av PCR

Uppgifterna för molekylärgenetiska metoder för att bestämma läkemedelskänslighet eller resistens hos Mycobacterium tuberculosis reduceras till att identifiera mutationer i vissa nukleotidsekvenser av kända gener. De huvudsakliga metoderna baseras antingen på direkt avläsning (sekvensering) av dessa sekvenser efter amplifiering, eller på hybridisering av biotinmärkta DNA-fragment amplifierade under PCR med DNA-prober. Båda alternativen innebär att identifiera substitutioner i nukleotidsekvenser som, vid användning av DNA-prober, leder till frånvaro eller ofullständig hybridisering på ett nitrocellulosamembran med hjälp av ett enzymkonjugat (streptavidin-alkaliskt fosfatas) - LIPA-Rif-TB-metoden.

Metoden för att mäta fluorescens i lokalt fixerade DNA-prober på mikroregioner som komplementärt till kända mutationer i PCR-amplifierade genregioner som ansvarar för läkemedelskänslighet eller resistens kallas microbiochips-metoden. Den grundläggande algoritmen för att genomföra denna studie är följande. Efter att DNA isolerats från ett kliniskt prov eller en mykobakteriell kultur måste PCR utföras för att amplifiera motsvarande fragment av groB-genen som ansvarar för läkemedelskänslighet för rifampicin, eller katG- och inhA-generna som kodar för mykobakteriella proteiner som ansvarar för känslighet för isoniazid. PCR-resultaten utvärderas med hjälp av agarosgelelektrofores, vilket bekräftar mottagandet av motsvarande DNA-fragment av önskad längd. Därefter utförs en andra omgång PCR för att introducera en fluorescerande märkning i DNA:t. PCR-resultaten bekräftas återigen med gelelektrofores. Därefter utförs hybridisering (inkubation över natten) med efterföljande tvättning av det erhållna materialet på ett biochip, vilket är ett stort antal korta DNA-kedjor (prober) fixerade på en liten glasplatta, komplementära till nukleotidsekvenserna för den läkemedelskänsliga typen av tuberkulosmykobakterier vid punkterna för möjliga mutationer, såväl som till mutantsekvenser som är ansvariga för läkemedelsresistens. Placeringen av DNA-proberna på plattan är strikt definierad, och nivån av fluorescens som observeras under hybridisering för att bestämma resultatet med hjälp av en speciell avläsningsanordning fastställs. I detta avseende bestäms analysens resultat med hjälp av ett speciellt datorprogram.

Under senare år har alternativa metoder för att bestämma läkemedelskänsligheten hos Mycobacterium tuberculosis utvecklats baserade på realtids-PCR-teknik, vilket gör det möjligt att utföra dessa studier i ett slutet provrörsläge.

Figur 13-13 visar resultatet av analysen av kliniska kulturer av Mycobacterium tuberculosis för att bestämma läkemedelsresistens mot rifampicin med hjälp av realtids-PCR: 218 - kontrollprov (känsligt för rifampicin); 93 - positiv kontroll för Ser-Trp TCG-TGG-mutationen; 4482 - positiv kontroll för Ser-Leu TCG-TTG-mutationen; 162-322 - experimentella prover. Resultatet av beräkningen av de kinetiska amplifieringskurvorna för 4 kanaler: kanal 1: 393 - positiv kontroll för Ser-Trp TCG-TGG-mutationen; kanal 2: 4482 - positiv kontroll för Ser-Leu TCG-TTG-mutationen; 162, 163, 172, 295 - experimentella prover; kanal 4: kinetiska amplifieringskurvor för alla prover som deltar i experimentet. Positiv kontroll av amplifieringsreaktionen. Slutsatser: Analysen avslöjade följande mutationer som avgör resistens mot rifampicin: i proverna 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Samma princip användes för att bestämma läkemedelsresistens mot isoniazid av katG- och inhA-generna, vilka avgör de vanligaste mutationerna.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Stamintifiering av Mycobacterium tuberculosis

Den mest studerade metoden för stamidentifiering av Mycobacterium tuberculosis är en teknik som kallas restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP) och som är baserad på fragmentering (restriktion) av Mycobacterium tuberculosis-DNA med enzymet Pvu II och efterföljande hybridisering av de erhållna fragmenten med vissa specifika sekvenser på DNA:t från dess repetitionselement IS6110. Intraspecifik variabilitet uppnås på grund av det olika antalet IS6110-repetitioner och deras placering på DNA:t, såväl som variationen i avstånd mellan vissa angreppspunkter för restriktionsenzymet (restriktionsställen) och IS6110-elementet. Denna teknik är mycket komplex och arbetsintensiv. Efter behandling av DNA:t som isolerats från tuberculosis-mycobacterium-kulturen med restriktionsenzym utförs gelelektrofores, sedan överförs DNA-fragment av olika längder till ett nitrocellulosamembran, hybridiseras med fragment av IS6110-elementet, och resultaten detekteras med hjälp av en enzymatisk reaktion. Det resulterande specifika bandmönstret karakteriserar DNA:t från en specifik tuberculosis-mycobacterium-stam. Datoranalys avslöjar stammarnas identitet eller släktskap. Trots att RFLP-metoden är den mest diskriminerande, dvs. den avslöjar det största antalet skillnader i de analyserade stammarna, är den ineffektiv med ett litet antal (mindre än 5) IS6110-upprepningar, observerade i vissa stammar. Figur 13-14 visar resultaten av RFLP-typning av stammarna.

Ett alternativ kan vara spoligotypningsmetoden - analys av polymorfismen hos spacer-DNA-sekvenser - mellan direkta upprepningar av DR-regionen. Vid spoligotypning av stammar utförs PCR med primers som begränsar DR-regionen, varefter fragment av olika längder bildas, vilka hybridiserar med variabla mellanliggande DNA-regioner. Analys av spacer-sekvenser i DR-regionen verkar, enligt forskare, enklare, mer produktiv och lämplig för primär screening av stammar och preliminär epidemiologisk analys, samt för att studera kliniskt material direkt.

En mer effektiv och tekniskt tillgänglig metod är uppenbarligen VNTR (förkortning av engelska ord), eller metoden för att bestämma det variabla antalet exakta tandemupprepningar i DNA:t hos Mycobacterium tuberculosis. Denna metod är enbart baserad på användning av PCR och kräver inga ytterligare manipulationer. Eftersom antalet tandemupprepningar i olika stammar och i olika loci är olika, bestäms fragment av olika storlekar och analyseras på det resulterande elektroforegrammet av PCR-produkter. Enligt forskare uppnås en större grad av stammarskillnad med hjälp av VNTR än med RFLP-metoden.

Mycket uppmärksamhet har under senare år ägnats åt spridningen av stammar av Mycobacterium tuberculosis av W-Beijing-familjen (ibland kallad Peking-stammen), vilka till stor del är läkemedelsresistenta.

Grundläggande krav för kvaliteten på molekylärbiologisk forskning

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Viktiga regleringsdokument för att genomföra PCR

Order från Ryska federationens hälsoministerium: Nr 45 av 7.02.2000; Nr 109 av 21.03.2003; Nr 64 av 21.02.2000. Riktlinjer: 1.3.1888-04 "Organisation av arbete under PCR-forskning av material infekterat med patogena biologiska agens av III-IV patogenitetsgrupper"; 1.3.1794-03 "Organisation av arbete under PCR-forskning av material infekterat med mikroorganismer av I-II patogenitetsgrupper". 2003; 3.5.5.1034-01 "Desinfektion av testmaterial infekterat med bakterier av patogenitetsgrupperna I-IV vid arbete med PCR-metoden", 2001. Bilaga 11 till instruktionerna om enhetliga metoder för mikrobiologisk forskning vid detektion, diagnos och behandling av tuberkulos.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personal

Molekylärbiologiska studier kan utföras av kliniska laboratoriediagnostikläkare, bakteriologer, virologer, kliniskt diagnostiska laboratoriebiologer, samt specialister med gymnasieutbildning som har genomgått specialisering och fortbildning på etablerat sätt.

Arrangemang av laboratorielokaler

Följande laboratoriefaciliteter behövs:

• Provbearbetningsområde - ett laboratorium anpassat för arbete med infektiösa agens i patogenitetsgrupperna III-IV, i enlighet med metodologiska riktlinjer 13.1888-04.
• Området för att bereda PCR-reaktionsblandningar är ett laboratorierum som skyddar mot intern laboratoriekontaminering – ett ”rent” område.
• • Om elektrofores eller hybridisering används för att analysera PCR-produkter måste laboratorierummet där de amplifierade DNA-fragmenten extraheras från amplifieringsröret och därmed kan komma ut i miljön, i enlighet med kraven för PCR-laboratorier (Metodologiska riktlinjer 1.3.1794-03, Metodologiska riktlinjer 1.3.1888-04) vara helt isolerat från de rum som anges i föregående stycken. Förflyttning av personal, utrustning, material och föremål från elektroforesområdet till provbearbetningsområdet och det "rena" området, samt luftöverföring genom ventilationssystemet eller på grund av drag, måste uteslutas. Detta område krävs inte för fluorimetrisk detektion av PCR-produkter.
• Rummet för dokumentation och bearbetning av resultat är utrustat med datorer och nödvändig kontorsutrustning. Detta rum kan innehålla utrustning som säkerställer detektion av PCR-produkter utan att röret öppnas. - fluorescerande PCR-detektorer och termocykler för realtids-PCR.

Sanitära och epidemiologiska krav för primär bearbetning av sputum liknar de mikrobiologiska standardkraven för arbete med Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Komplett uppsättning laboratorieutrustning för PCR-diagnostik

Laboratoriekitet innehåller utrustning för följande rum.

• Provberedningrum, innehåller följande utrustning: laminärflödeskåpa med skyddsklass II "SP-1.2": fastämnestermostat med uppvärmt lock för Eppendorf-provrör; mikrocentrifug vid 13 000 rpm; centrifug ("Vortex"); kylskåp med temperaturområde från -20 ^° C till +10 ^° C; pipetter med variabel volym i "Proline"-serien; pump med fällkolv OM-1; pipettställ; arbetsstationsställ 200x0,5 ml; arbetsstationsställ 50x1,5 ml; ställ för förvaring av provrör 80x1,5 ml;
• Rum för beredning av reaktionsblandning: PCR-låda med skyddskammare ("Laminar-C. 110 cm); centrifug "Vortex"; pipetter med variabel volym i "Proline"-serien; pipettställ; arbetsstationsställ 200x0,2 ml; ställ för förvaring av provrör 80x1,5 ml; kylskåp med ett temperaturområde från -20 ^° C till +10 ^° C;
• Elektroforesrum: horisontell elektroforeskammare; strömkälla; genomlysningsapparat;
• DNA-amplifiator eller nukleinsyraanalysator (realtids-PCR) med dator och programvara; kan placeras i vilket tillgängligt rum som helst. Om realtids-PCR-teknik används behövs inget elektroforesrum.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Extern kvalitetskontroll

För att säkerställa att de får objektivt tillförlitliga resultat måste laboratorierna delta i ett system för extern bedömning av kvaliteten på laboratorieforskningen.

Deltagarna i kvalitetskontrollsystemet får: 12 ampuller med frystorkade suspensioner av bakterieceller, varav två innehåller E. coli, 3 ampuller med tuberkulosmykobakterier (avirulent stam) i en koncentration av 10² ^/ ml; 3 ampuller med celler av en liknande stam i en koncentration av 10³ ^/ ml; 2 ampuller vardera med icke-tuberkulösa mykobakterier M. avium-intracellulare och M. kansasii i en koncentration av 10³ ^/ ml.

Testerna som skickas ut för extern kvalitetsbedömning förtestas i två oberoende laboratorier med lång erfarenhet inom detta område.

[ 85 ], [ 86 ]