Hematopoietiska stamceller

Hematopoetiska stamceller (HSCs) som mesenkymala progenitorceller kännetecknas av multipotens och ge upphov till cellinjer, finita element, som bildar blodkroppar och vissa specialiserade vävnadsceller i immunsystemet.

Hypotesen om att det finns en gemensam förfader av alla blodkroppar, liksom begreppet "stamceller", som ägs av A. Maximov (1909) Den potentiella bildningen av cellmassa från GSK enorm -. Benmärgsstamceller producerar den 10 celler som bygger upp blodkroppar i det perifera själv. Förekomsten av hematopoietiska stamceller bildades 1961 i försök på återvinning av blodbildningen hos möss som erhöll en letal dos av strålningsexponering som förstör benmärg stamceller. Pos dvs transplantation av syngena benmärgsceller så letalt bestrålade djur diskreta foci av hematopoies detekterades i mjälten hos mottagare vars källa - enkel klonogena progenitorceller.

Därefter demonstrerades förmågan hos hematopoetiska stamceller till självbärande, vilket ger funktionen av hematopoiesen under ontogenes. I processen med embryonal utveckling kännetecknas HSCs av hög migrationsaktivitet, vilket är nödvändig för deras migrering till de hematopoetiska organens ställen. Denna egenskap hos HSCs behålls också i ontogenes - på grund av deras konstanta migration sker en permanent förnyelse av poolen av immunkompetenta celler. Förmågan hos GSK migration, penetrering genom blod-vävnadsbarriärer, implantering i vävnadstillväxt och klonogen till grund för benmärgstransplanterade celler i ett antal sjukdomar associerade med rubbningar i det hematopoetiska systemet.

Liksom alla stamceller resurser, hematopoetiska stamceller finns i din nisch (benmärgen) i mycket små mängder, vilket leder till vissa svårigheter i sin tilldelning. Immunophenotypic humana HSC: er kännetecknas som CD34 + NK-celler med förmåga att migrera in i blodomloppet och kolonisera organ i immunsystemet eller för att återbefolka benmärgen stroma. Det är nödvändigt att tydligt förstå att GSK inte är den mest omogna benmärgsceller, och härrör från föregångare, som omfattar dormantnye fibroblast SB34 negativa celler. Det visade sig att cellerna med fenotypen av CD34 kan komma in i blodomloppet, där ändra sin fenotyp i CD34 +, men återflyttning i benmärgen under påverkan av mikro åter blivit CD34-negativ stamcellselement. I vila svarar inte CD34-celler på parakrina regulatoriska stromal signaler (tillväxtfaktorer, cytokiner). Emellertid, i situationer som kräver amplifiering intensitets hematopoetiska stamceller med fenotypen CD34 svara på differentieringssignaler bilda både hematopoetiska och mesenkymala progenitorceller. Hematopoies utförs genom direkt kontakt med GSK cellulära element i benmärgsstroma presenteras ett komplext nätverk av makrofager, retikulära endotelceller, osteoblaster, stromala fibroblaster och extracellulär matris. Benmärgs stromal ram - inte bara en matris eller "skelett" för hematopoietisk vävnad, bär den fina reglering av hematopoies grund av parakrina signaler som reglerar tillväxtfaktorer, cytokiner och kemokiner, och ger också adhesiva interaktioner är nödvändiga för bildandet av blodkroppar.

Således är grunden för det ständigt uppdaterade hemopoiesisystemet den hemopoietiska stamcellen, som kan förlängas självunderhåll, är polypotent (ur hemopoiesissynpunkt). Under förloppsprocessen genomgår HSCs primär differentiering och bildar kloner av celler som skiljer sig åt i deras cytomorfologiska och immunofenotypiska egenskaper. Den konsekutiva bildningen av primitiva och engagerade progenitorceller kompletteras genom bildandet av morfologiskt identifierbara förfäderceller av olika hematopoetiska linjer. Resultatet av den efterföljande stegen komplex flerstegsprocess är mognaden av hematopoietiska celler och utbyte mogna till perifert blod bildade element - erytrocyter, leukocyter, lymfocyter och blodplättar.

[1], [2], [3],

Källor av hematopoetiska stamceller

Hematopoetiska stamceller anses vara den mest studerade stamkällan, vilket till stor del beror på deras användning i kliniken för benmärgstransplantation. Vid första anblicken är mycket känt om dessa celler. I viss mån detta är sant, eftersom de mellanliggande och mogna ättlingar GSK - de mest prisvärda cellulära element, som vart och ett (erytrocyter, leukocyter, lymfocyter, monocyter / makrofager och blodplättar) är grundligt studerade på alla nivåer - från ljus till elektronmikroskop, från biokemiska och immunofenotypa egenskaper före identifiering genom PCR-analys. Men övervakning som utförs av morfologiska, ultra, biokemiska, immunophenotypic och biofysiska parametrar för genomisk GSK har inte gett svar på många problematiska frågor, är nödvändigt för utvecklingen av celltransplantation vars lösning. Det är fortfarande inte fastställt stabiliseringsmekanismer GSK i vilande tillstånd, de är aktiverade, in på scenen av den symmetriska eller asymmetriska division, och viktigast av allt - engagemang för utbildning som funktionellt olika blodceller, erytrocyter, leukocyter, lymfocyter och blodplättar.

Närvaron i benmärgscellerna med fenotypen av CD34, som är förfäder till både mesenkymala och hematopoietiska stamceller har väckt frågan om förekomsten av den tidigaste nära till CD34-negativa celler i progenitorcell differentiering och hematopoietisk stromal linje. Med hjälp av långsiktiga kulturen erhölls en så kallad långsiktig kulturinitiativcell (LTC-IC). Livstiden för sådana progenitorceller i kolonibildande aktivitet hos benmärgen stromal baserat på en kombination av tillväxtfaktorer är mer än 5 veckor, medan livsdugligheten hos engagerade kolonibildande enheter (CFU) i odlingen av endast 3 veckor. Det är för närvarande tror att LTC-IC - funktionell analog GCW som repopulyatsionnom på en hög potential på ca 20% LTC-IC kännetecknas av en fenotyp CD34 + CD38- och uppvisar en hög kapacitet för självförnyelse. Sådana celler som finns i human benmärg med frekvensen av 1:50 000. Det bör emellertid erkännas limfoidoinitsiiruyuschie-myeloid-celler närmast HSC vilka erhålles under betingelser med långvarig (15 veckor) av odling. Sådana celler betecknas som LTC, bland humana benmärgsceller återfinns i 10 gånger mindre än den LTC-IC, och är utformad som en myeloida cellinjer och lymfoid hemopoietisk stam.

Även om hematopoetiska stamceller märkning med monoklonala antikroppar, följt av identifiering av immunophenotypic är den huvudsakliga metoden för att identifiera och selektiv sortering av hematopoetiska stamceller med den potentiella kliniska användningen av dedicerad GSK således begränsad. Blockerande CD34-receptorantikroppar eller andra markörantigener under sortering immunopositiva oundvikligen förändrar egenskaperna hos celler som isolerats med den. Mer föredraget är den immun-negativa utsöndringen av HSC på magnetiska kolonner. I det här fallet används emellertid i regel monoklonala antikroppar fixerade på en metallbärare för sortering. Dessutom är det viktigt att båda metoderna för isolering av HSC baseras på fenotypiska och inte på funktionella egenskaper. Därför är många forskare föredrar att använda analysen av klonogena parametrar GSK, som tillåter storleken och sammansättningen av kolonierna för att bestämma graden av mognad och riktning av differentiering av progenitorceller. Det är känt att i processen att begå antalet celler och antalet deras typer i kolonin minskar. Hematopoietiska stamceller och dess dottercell tidigt, som kallas "granulocyt-erytrocyt monocyt-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya enhet" (SFU-GEMM), skapa en odlingsmultilinjär stora kolonier innehållande, respektive, granulocyter, erytrocyter, monocyter och megakaryocyter. Belägen under linjen granulocyt-härstamning engagemang monotsitokolonieobrazuyuschaya enhet (SFU-GM) genererar kolonier av granulocyter och makrofager och granulocytiska kolonibildande enheter (SFU-G) - endast små kolonier av mogna granulocyter. Tidig erytrocyt föregångare - burstoobrazuyuschaya enhet av röda blodkroppar (SFU-E) - är en källa till stora och mer mogen röd blodcellkolonibildande enhet (SFU-E) - små röda blodcellkolonier. I den allmänna befolkningen, med tillväxten av celler i halvfasta medier kan identifiera celler som bildar sex typer av myeloida kolonier: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E och E-SFU).

Förutom hematopoietiska derivat innehåller emellertid något källmaterial för isoleringen av HSC ett signifikant antal samtidiga celler. I detta sammanhang är en preliminär rening av transplantationen, först av allt, av de aktiva cellerna i donets immunsystem nödvändig. Vanligtvis används immunosektion baserat på lymfocytuttryck av specifika antigener för detta, vilket gör det möjligt att isolera och avlägsna dem med monoklonala antikroppar. Dessutom en teknik immunorozetochnaya T-lymfocyt utarmade benmärgstransplantation, som är baserad på bildningen av komplex av CD4 + lymfocyter och specifika monoklonala antikroppar avlägsnas effektivt med aferes. Denna teknik tillhandahåller ett renat cellmaterial med 40-60% hematopoetiska stamceller.

En ökning av antalet ursprungsceller på grund av avlägsnandet av mogna blodceller från en leukaferes produkt erhålls genom motströmscentrifugering följt av filtrering (i närvaro av kelatorn - trinatriumcitrat) genom en kolonn innehållande nylonfibrer belagda med humant immunglobulin. Sekventiell användning av dessa två tekniker ger den fullständiga rengöring av transplantatet från blodplättar genom 89% - av erytrocyterna och genom 91% - från leukocyter. På grund av en signifikant minskning av HSC-förluster kan nivån av CD34 + -celler i den totala cellmassan ökas till 50%.

För funktionella egenskaper hos isolerade hematopoetiska stamceller används deras förmåga att skapa kolonier av mogna blodelement i odling. Analys av de bildade kolonierna gör det möjligt att identifiera och kvantifiera typerna av stamceller, graden av deras konformation och också för att bestämma riktningen för deras differentiering. Klonogen aktivitet bestäms i halvfast medium på metylcellulosa, agar, plasma eller fibringel, vilket minskar cellernas migreringsaktivitet, vilket förhindrar deras fastsättning på ytan av glas eller plast. Under optimala odlingsbetingelser utvecklas kloner från en enda cell inom 7-18 dagar. Om det finns mindre än 50 celler i klonen identifieras det som ett enda kluster, om antalet celler överstiger 50 - som en koloni. Antalet celler som kan bilda en koloni (kolonidannande enheter - CFU eller kolonbildande celler - COC) beaktas. Det bör noteras att parametrarna och CFU COC inte motsvara antalet HSC i cellsuspensionen, även om det korrelerar med det igen betonar behovet av att identifiera den funktionella (kolonibildande) aktiviteten av HSCs in vitro.

Bland benmärgscellerna har hematopoetiska stamceller den högsta proliferativa potentialen, på grund av vilken de största kolonierna bildas i odling. Med antalet sådana kolonier föreslås det att indirekt bestämma antalet stamceller. Efter bildandet av kolonier in vitro överstigande 0,5 mm i diameter och med antalet celler 1000, har författarna testade stabiliteten hos dessa celler att subletala doser av 5-fluorouracil och undersöktes deras förmåga att återbefolka benmärgen letalt bestrålade djur. Enligt dessa parametrar skilde de isolerade cellerna inte mycket från HSC och fick förkortningssymbolen HPP-CFC - kolonidannande celler med en hög proliferativ potential.

Sökandet efter möjligheten till ett mer kvalitativt urval av hematopoetiska stamceller fortsätter. Emellertid, de hematopoietiska stamcellerna liknar morfologiskt lymfocyter och är relativt enhetlig samling celler med nästan runda kärnor, kromatin och partikelformigt slabobazofilnoy liten mängd cytoplasma. Det exakta numret är också svårt att bestämma. Det antas att GSK i benmärgen hos en person uppträder med en frekvens av 1 per 106 kärnor innehållande celler.

Identifiering av hematopoetiska stamceller

Att förbättra identifieringen av hematopoietiska stamceller genomförs sekventiellt eller samtidigt (på en flerkanalig sorbitan tere) forskning membrannosvyazannyh spektrum av antigener, i vilket GSK fenotyp CD34 + CD38 bör kombineras med avsaknaden av differentieringsmarkörer linjär, i synnerhet antigener av immunkompetenta celler såsom CD4, och ytimmunglobuliner glykoforin.

Nästan alla system av fenotypning av hematopoietiska stamceller innefattar bestämning av CD34-antigen. Detta glykoprotein med en molekylmassa av ca 110 kDa, som bär flera glykosyleringsställen som uttrycks på plasmacellmembranet efter aktivering av genen lokaliserad på kromosom 1. Funktionen hos CD34-molekylen är associerad med den L-selektin-medierade interaktionen av tidiga hematopoetiska prekursorceller med benmärgsstromalbasen. Emellertid bör man komma ihåg att närvaron av CD34-antigenet på cellytan tillåter endast göra en preliminär bedömning av innehållet i GSK i cellsuspensionen, som det uttrycks, och andra hematopoietiska progenitorceller och stromala benmärgsceller och endotelceller.

Under differentieringen av hematopoetiska progenitorceller reduceras CD34-uttrycket permanent. Erytrocyt-, granulocyt- och monocytbegränsade progenitorceller uttrycker antingen svagt uttryckt CD34-antigen, eller det är frånvarande på deras yta alls (fenotyp CD34). På ytmembranet av differentierade celler i benmärgen och mogna blodceller detekteras inte CD34-antigen.

Det bör noteras att det inte bara i dynamiken i differentieringen av hematopoetiska progenitorceller minskar expressionsnivån av CD34, men parallellt progressivt ökat uttryck av CD38-antigenet - integrerande membranglykoprotein med molekylvikt på 46 kDa som har NAD-glikogidrolaznoy och ADP-ribosyl cyklasaktivitet, vilket antyder dess inblandning vid transport och syntes av ADP-ribos. Sålunda är det möjligt att fördubbla-kontroll av graden av engagemang av hematopoetiska progenitorceller. Population av celler med fenotypen CD34 + CD38 +, från 90 till 99% CD34-positiva benmärgsceller innefattar progenitorceller med begränsad proliferativ potential och differentiering, medan med fenotypen CD34 * CD38-celler kan göra anspråk rollen GSK.

Indeed, populationen av benmärgsceller, som beskrivs av formeln CD34 + CD38-, innehåller ett relativt stort antal primitiva stamceller med förmåga att differentiera till myeloida och lymfoida linjer. I samband med långtidsodling med fenotypen av CD34 + CD38- celler lyckas få alla de mogna blodkropparna: neutrofiler, eosinofiler, basofiler, monocyter, megakaryocyter, erytrocyter och lymfocyter.

Relativt nyligen det sig att CD34-positiva cellerna uttrycker två mer markör - AC133 och CD90 (Thy-1), som också används för att identifiera hematopoietiska stamceller. Thy-1-antigenet uttrycks med CD117-receptorn (c-kit) på CD34 + -celler av benmärg, navelsträng och perifert blod. Detta är ett ytfosfatidylinositolbindande glykoprotein med en molekylvikt av 25-35 kDa, som deltar i celladhesionsprocesser. Vissa författare tror att Thy-1-antigenet är markören för de mest omogna CD34-positiva cellerna. Självproducerande celler med fenotypen CD34 + Thy-1 + ger upphov till långkultiverade linjer med bildandet av dotterceller. Det föreslås att Thy-1-antigenet blockerar de regulatoriska signalerna som orsakar celldelning att stoppa. Trots det faktum att CD34 ^ TU1 + celler kan undergå självförnyelse och skapandet av långvarigt odlade linjer, kan deras fenotyp inte avse enbart till HSC, som Thy-1 + innehåll i den totala vikten av de CD34-positiva cellelement är ca 50%, långt över antalet hematopoietiska celler.

Mer lovande för identifieringen av hematopoetiska stamceller är AC133, en antigenmarkör för hematopoietiska stamceller, vars uttryck först detekterades på embryonala leverceller. AC133 är ett transmembran glykoprotein som uppträder på ytan av cellmembranet i de tidigaste stadierna av GSK-mognad - det är möjligt att även tidigare än antigenet CD34. I studierna av A. Petrenko och V. Grishchenko (2003) visade sig att AC133 uttrycker upp till 30% av CD34-positiva celler i embryonal lever.

Sålunda, den idealiska fenotypiska profilen av hematopoetiska stamceller med dagens begrepp, summan av cell kontur, i kretsarna som måste vara närvarande CD34 antigener konfiguration, AC133 och Thy-1 men det finns ingen plats för molekyl utsprång CD38, HLA-DR och markörer linjär differentiering GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

GSK fenotypisk variation porträtt kan vara en kombination av CD34 + CD45RalowCD71low, eftersom egenskaperna hos de celler som beskrivs av denna formel inte skiljer från de funktionella parametrar för celler med fenotypen CD34 + CD38. Dessutom kan human HSC identifieras genom fenotypiska tecken CD34 ^ Thy-l + CD38Iow / 'c-kit / låg - endast 30 av dessa celler helt återställa hematopoes i letalt bestrålade möss.

Från analys av de allmänna fenotypiska egenskaperna hos benmärgsceller började faktiskt 40 år av intensiv forskning GSK samtidigt kan både självförnyelse och differentiering till andra cellulära element, gör det möjligt att motivera användningen av benmärgstransplantation för att behandla olika sjukdomar i hematopoetiska systemet. Öppna senast nya typer av stamceller fortfarande används i stor utsträckning i klinisk praxis är inte emot. Emellertid stamceller från navelsträng (sladd) blod och fetal lever kan avsevärt utöka celltransplantation, inte bara i hematologi, men också i andra medicinska områden, som skiljer sig från HSC benmärg som en kvantitativa resultat och kvalitetsegenskaper.

Volymen av stamhematopoietisk cellmassa som erfordras för transplantation erhålls vanligtvis från benmärg, perifert och trådblod och även från embryonal lever. Dessutom kan hematopoietiska prekursorceller erhållas genom in vitro propagering av ESC och deras efterföljande differentiering till hematopoietiska målinriktade cellulära element. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) med rätta påpekar signifikanta skillnader immunologiska egenskaper och förmågan att återställa blodbildningen GSK olika ursprung, på grund av olika förhållande som finns i deras källor av pluripotenta tidigt och senare engagerade stamfäder. Dessutom har hematopoetiska stamceller som härrör från olika stamkällor helt olika sammanslutningar av icke-hemopoietiska celler kvantitativt och kvalitativt.

En traditionell källa till hematopoetiska stamceller är benmärgen. En suspension av benmärgsceller erhålls från bukbenet eller sternum genom utlakning under lokalbedövning. Den sålunda erhållna suspensionen är heterogen och innehåller en blandning av HSC, stromalcellselement, begåvade stamceller från myeloid- och lymfoidlinjerna, liksom mogna blodelement. Antalet celler med fenotyperna CD34 + och CD34 + CD38 bland benmärgsmononukleära celler är 0,5 till 3,6 respektive 0 till 0,5%. Perifert blod efter G-CSF-inducerad mobilisering av HSC innehåller 0,4-1,6% av CD34 + och 0-0,4% av CD34 + CD38.

En högre andel av celler med CD34 + CD38 immunofenotyp och CD34 + navelsträngsblod - och 0-0,6 OD-2,6%, och deras maximala antal detekteras bland hematopoietiska fetala leverceller - och 2,3 0,2-12,5 -35,8%.

Emellertid kvaliteten på graftmaterialet beror inte bara på mängden som finns däri av CD34 + -celler, utan även på deras funktionella aktivitet, vilket kan uppskattas genom nivån av kolonibildning in vivo (märg återpopulation i letalt bestrålade djur) och in vitro - av tillväxt av kolonier på halvfasta medier . Man fann att den kolonibildande och proliferativ aktivitet av hemopoietiska ursprungsceller med fenotypen CD34 + CD38 HLA-DR, isolerad från fetal lever, fetal benmärg och ryggmärgsblod, och kraftigt överskrider den proliferativa kapaciteten hos hematopoietiska kolonibildande celler i benmärgen och perifert blod från en vuxen. Kvantitativ och kvalitativ analys av GSK olika ursprung visade signifikanta skillnader i deras relativa halten i cellsuspensionen och funktionalitet. Det maximala antalet CD34 + celler (24,6%) observerades i transplantatmaterial härledda från fetal benmärg. Benmärgen hos en vuxen människa innehåller 2,1% av CD34-positiva cellelement. Bland de mononukleära celler av humant vuxen perifert blod endast 0,5% en fenotyp CD34 '^, medan navelsträngsblod deras mängd når 2%. Sålunda kolonibildande förmågan hos CD34 + celler från fetal benmärg genom 2,7 gånger överskrider kapaciteten för klonal tillväxt av hematopoietiska benmärgen hos vuxna humana celler och navelsträngsblod celler bildar avsevärt större kolonier än hematopoietiska isolerade beståndsdelar från perifert blod från vuxna: 65,5 till 40 och , 8 kolonier / 105 celler.

Skillnader i proliferativ aktivitet och kolonibildande förmåga hematopoetiska stamceller associeras inte bara med varierande grad av mognad, utan även med deras naturliga mikromiljö. Det är känt att intensiteten av proliferation och differentiering av stamceller hastighet som bestäms av den integrerade reglerande inverkan av flerkomponentsystem av tillväxtfaktorer och cytokiner som är producerade av både stamceller och cellulära element av matris-stromal mikromiljö. Med användning av de renade cellpopulationer och serumfritt medium i syfte att cellkulturen ger karakteriserade tillväxtfaktorer som har en stimulerande och hämmande effekter på stamceller av olika nivåer, ursprungsceller och celler av engagerade i en särskild linjär riktning. Resultaten av de genomförda studierna bevisar övertygande att GSK, erhållen från källor med olika nivåer av ontogenetisk utveckling, skiljer sig både fenotypiskt och funktionellt. För GSK, som bor i tidigare stadium av ontogeni, kännetecknad av en hög potential för självreproduktion och hög proliferativ aktivitet. Sådana celler utses av en längre telomer-längd och utsätts för att förbinda sig med bildandet av alla hematopoietiska cellinjer. Reaktionen av immunsystemet till HSC-embryoniskt ursprung är fördröjd, eftersom sådana celler mildt uttrycker HLA-molekyler. Det finns en tydlig gradering av den relativa halten av HSCs och deras förmåga att själv förnya och antalet linjer bildar de typer av engagemang: CD34 + celler i fetal lever> CD34 + celler navelsträngsblod> CD34 + celler i benmärgen. Det är viktigt att dessa skillnader är inte unika för handeln och neo postanatalnomu tidiga perioden av människans utveckling, men också hela ontogenin - proliferativa och kolonibildande aktiviteten hos HSCs härrör från benmärg eller perifert blod av en vuxen, omvänt proportionell mot ålder givaren.