Hematopoietiska stamceller

Hematopoetiska stamceller (HSC), liksom mesenkymala progenitorceller, kännetecknas av multipotens och ger upphov till cellinjer, vars slutliga element bildar blodets bildade element, såväl som ett antal specialiserade vävnadsceller i immunsystemet.

Hypotesen om existensen av en gemensam föregångare för alla blodkroppar, liksom själva termen "stamcell", tillhör A. Maksimov (1909). Potentialen för bildandet av cellmassa i HSC är enorm - benmärgsstamceller producerar dagligen 10 celler som utgör de bildade elementen i perifert blod. Själva faktumet att hematopoetiska stamceller existerar fastställdes 1961 i experiment på återställande av hematopoies hos möss som fick en dödlig dos av radioaktiv bestrålning som förstör benmärgsstamceller. Efter transplantation av syngena benmärgsceller till sådana dödligt bestrålade djur hittades diskreta fokus för hematopoies i mjälten hos mottagarna, vars källa var enskilda klonogena prekursorceller.

Sedan bevisades hematopoetiska stamcellers förmåga till självförsörjning, vilket tillhandahåller hematopoetiska funktioner i ontogenesprocessen. I den embryonala utvecklingsprocessen utmärks hematopoetiska stamceller av hög migrationsaktivitet, vilket är nödvändigt för deras förflyttning till de zoner där hematopoetiska organ bildas. Denna egenskap hos hematopoetiska stamceller bevaras också i ontogenesen - på grund av deras konstanta migration sker en permanent förnyelse av poolen av immunkompetenta celler. HSC:ernas förmåga att migrera, penetrera histohematiska barriärer, implanteras i vävnader och klonogen tillväxt tjänade som grund för transplantation av benmärgsceller vid ett antal sjukdomar associerade med patologi i det hematopoetiska systemet.

Liksom alla stamcellsresurser finns hematopoetiska stamceller i sin nisch (benmärg) i mycket små mängder, vilket orsakar vissa svårigheter vid isolering. Immunofenotypiskt karakteriseras humana HSC:er som CD34+NK-celler som kan migrera in i blodomloppet och befolka immunsystemets organ eller återbefolka benmärgsstroma. Det bör tydligt förstås att HSC:er inte är de mest omogna cellerna i benmärgen, utan härrör från prekursorer, vilka inkluderar vilande fibroblastliknande CD34-negativa celler. Det har fastställts att celler med CD34-fenotypen kan komma in i den allmänna blodomloppet, där de ändrar sin fenotyp till CD34+, men vid omvänd migration in i benmärgen, under påverkan av mikromiljön, blir de återigen CD34-negativa stamcellselement. I vilotillståndet svarar CD34~-celler inte på parakrina regleringssignaler från stroma (tillväxtfaktorer, cytokiner). I situationer som kräver ökad intensitet av hematopoiesen svarar dock stamceller med CD34-fenotypen på differentieringssignaler genom att bilda både hematopoetiska och mesenkymala progenitorceller. Hematopoiesen sker genom direkt kontakt mellan HSC:er och cellulära element i benmärgsstromat, representerade av ett komplext nätverk av makrofager, retikulära endotelceller, osteoblaster, stromala fibroblaster och extracellulär matrix. Benmärgens stromala bas är inte bara en matris eller ett "skelett" för hematopoetisk vävnad; den utför finreglering av hematopoiesen på grund av parakrina regleringssignaler från tillväxtfaktorer, cytokiner och kemokiner, och tillhandahåller också adhesiva interaktioner som är nödvändiga för bildandet av blodkroppar.

Således är det ständigt förnyande systemet för hematopoies baserat på en polypotent (ur hematopoetisk synvinkel) hematopoetisk stamcell som är kapabel till långsiktigt självförsörjande. I bindingsprocessen genomgår HSC:er primär differentiering och bildar kloner av celler som skiljer sig åt i cytomorfologiska och immunofenotypiska egenskaper. Den sekventiella bildningen av primitiva och bindingsbaserade progenitorceller slutar med bildandet av morfologiskt identifierbara progenitorceller från olika hematopoetiska linjer. Resultatet av efterföljande steg i den komplexa flerstegsprocessen för hematopoies är mognad av celler och frisättning av mogna bildade element i det perifera blodet - erytrocyter, leukocyter, lymfocyter och trombocyter.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Källor till hematopoetiska stamceller

Hematopoetiska stamceller anses vara den mest studerade stamcellskällan, vilket till stor del beror på deras kliniska användning vid benmärgstransplantation. Vid första anblicken är en hel del känt om dessa celler. Till viss del är detta sant, eftersom mellanliggande och mogna avkommor till HSC:er är de mest tillgängliga cellulära elementen, vilka var och en (erytrocyter, leukocyter, lymfocyter, monocyter/makrofager och trombocyter) har studerats noggrant på alla nivåer - från ljus- till elektronmikroskopi, från biokemiska och immunofenotypiska egenskaper till identifiering med PCR-analysmetoder. Övervakningen av morfologiska, ultrastrukturella, biokemiska, immunofenotypiska, biofysiska och genomiska parametrar hos HSC:er har dock inte gett svar på många problematiska frågor, vars lösning är nödvändig för utvecklingen av celltransplantation. Mekanismerna för stabilisering av hematopoetiska stamceller i ett vilande tillstånd, deras aktivering, inträde i stadiet av symmetrisk eller asymmetrisk delning, och viktigast av allt, engagemang för bildandet av sådana funktionellt olika bildade element i blodet som erytrocyter, leukocyter, lymfocyter och blodplättar har ännu inte fastställts.

Närvaron i benmärgen av celler med CD34-fenotypen, vilka är föregångare till både mesenkymala och hematopoetiska stamceller, väckte frågan om existensen av de tidigaste prekursorerna till celldifferentiering till stromala och hematopoetiska linjer, nära CD34-negativa celler. Den så kallade långsiktiga kulturinitierande cellen (LTC-IC) erhölls med hjälp av långsiktig odlingsmetod. Livslängden för sådana prekursorceller med kolonibildande aktivitet på stromal basis av benmärg med en viss kombination av tillväxtfaktorer överstiger 5 veckor, medan viabiliteten för dedikerade kolonibildande enheter (CFU) i kultur endast är 3 veckor. För närvarande anses LTC-IC vara en funktionell analog till HSC:er, eftersom med en hög repopulationspotential kännetecknas cirka 20 % av LTC-IC av CD34+CD38-fenotypen och uppvisar en hög kapacitet för självförnyelse. Sådana celler finns i mänsklig benmärg med en frekvens av 1:50 000. Emellertid bör myeloid-lymfoidinitierande celler, som erhålls under långvariga (15 veckor) odlingsförhållanden, betraktas som de celler som ligger närmast HSC:er. Sådana celler, betecknade LTC, är bland cellerna i benmärgen i den mänskliga hjärnan och finns 10 gånger mindre frekvent än LTC-IC och bildar cellinjer av både myeloida och lymfoida hematopoetiska linjer.

Även om märkning av hematopoetiska stamceller med monoklonala antikroppar följt av immunofenotypisk identifiering är den huvudsakliga metoden för igenkänning och selektiv sortering av hematopoetiska celler med stampotential, är den kliniska tillämpningen av de sålunda isolerade HSC:erna begränsad. Blockering av CD34-receptorn eller andra markörantigener med antikroppar under immunopositiv sortering förändrar oundvikligen egenskaperna hos den cell som isoleras med dess hjälp. Immunnegativ isolering av HSC:er på magnetiska kolonner anses vara mer föredragen. I detta fall används dock vanligtvis monoklonala antikroppar fixerade på en metallbärare för sortering. Dessutom, vilket är viktigt, är båda metoderna för HSC-isolering baserade på fenotypiska snarare än funktionella egenskaper. Därför föredrar många forskare att använda analys av klonogena parametrar för HSC:er, vilket gör att mognadsgraden och differentieringsriktningen för progenitorceller kan bestämmas av koloniernas storlek och sammansättning. Det är känt att antalet celler och deras typer i kolonin minskar under infästningsprocessen. Den hematopoetiska stamcellen och dess tidiga dottercell, kallad "granulocyt-erytrocyt-monocyt-megakaryocyt-kolonibildande enhet" (CFU-GEMM), skapar stora flerlinjekolonier i kultur innehållande granulocyter, erytrocyter, monocyter respektive megakaryocyter. Granulocyt-monocyt-kolonibildande enheten (CFU-GM), som är belägen nedströms längs bindningslinjen, bildar kolonier av granulocyter och makrofager, och granulocyt-kolonibildande enheten (CFU-G) bildar endast en liten koloni av mogna granulocyter. Den tidiga erytrocytprekursorn, den burstbildande enheten av erytrocyter (CFU-E), är källan till stora erytrocytkolonier, och den mer mogna kolonibildande enheten av erytrocyter (CFU-E) är källan till små erytrocytkolonier. I allmänhet, när celler växer på halvfasta medier, kan celler identifieras som bildar sex typer av myeloidkolonier: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E och CFU-E).

Utöver hematopoetiska derivat innehåller dock allt källmaterial för isolering av HSC ett betydande antal medföljande celler. I detta avseende är preliminär rening av transplantatet nödvändig, först och främst från aktiva celler i donatorns immunsystem. Vanligtvis används immunselektion för detta ändamål, baserat på uttryck av specifika antigener av lymfocyter, vilket gör det möjligt att isolera och avlägsna dem med hjälp av monoklonala antikroppar. Dessutom har en immunorosettmetod för T-lymfocytutarmning av benmärgstransplantat utvecklats, vilken är baserad på bildandet av komplex av CD4+ lymfocyter och specifika monoklonala antikroppar, effektivt avlägsnade med hjälp av aferes. Denna metod säkerställer produktion av renat cellmaterial med 40-60% innehåll av hematopoetiska stamceller.

En ökning av antalet progenitorceller på grund av avlägsnande av mogna bildade delar av blodet från leukaferesprodukten uppnås genom motströmscentrifugering följt av filtrering (i närvaro av en kelator - trinatriumcitrat) genom kolonner innehållande nylonfibrer belagda med humant immunglobulin. Den sekventiella användningen av dessa två metoder säkerställer fullständig rening av transplantatet från trombocyter, 89 % från erytrocyter och 91 % från leukocyter. På grund av en signifikant minskning av förlusten av HSC:er kan nivån av CD34+ celler i den totala cellmassan ökas till 50 %.

Förmågan hos de isolerade hematopoetiska stamcellerna att bilda kolonier av mogna blodkroppar i kultur används för funktionell karakterisering av cellerna. Analys av de bildade kolonierna möjliggör identifiering och kvantifiering av typerna av progenitorceller, graden av deras engagemang och fastställande av deras differentieringsriktning. Klonogen aktivitet bestäms i halvfasta medier på metylcellulosa, agar, plasma eller fibringel, vilket minskar cellernas migrationsaktivitet och förhindrar deras vidhäftning till ytan av glas eller plast. Under optimala odlingsförhållanden utvecklas kloner från en enda cell på 7–18 dagar. Om en klon innehåller färre än 50 celler identifieras den som ett enda kluster; om antalet celler överstiger 50 identifieras den som en koloni. Antalet celler som kan bilda en koloni tas med i beräkningen (kolonibildande enheter - CFU eller kolonibildande celler - COC). Det bör noteras att parametrarna för CFU och COC inte motsvarar antalet HSC:er i cellsuspensionen, även om de korrelerar med det, vilket återigen betonar behovet av att bestämma den funktionella (kolonibildande) aktiviteten hos HSC:er in vitro.

Bland benmärgsceller har hematopoetiska stamceller den högsta proliferativa potentialen, vilket gör att de bildar de största kolonierna i kultur. Antalet sådana kolonier föreslås indirekt bestämma antalet stamceller. Efter bildandet av kolonier in vitro som överstiger 0,5 mm i diameter och med ett cellantal på mer än 1000, testade författarna sådana celler för resistens mot subletala doser av 5-fluorouracil och studerade deras förmåga att återpopulera benmärgen hos dödligt bestrålade djur. Enligt de angivna parametrarna var de isolerade cellerna nästan omöjliga att skilja från HSC:er och fick förkortningen HPP-CFC - kolonibildande celler med hög proliferativ potential.

Sökandet efter bättre isolering av hematopoetiska stamceller fortsätter. Hematopoetiska stamceller är dock morfologiskt lika lymfocyter och representerar en relativt homogen uppsättning celler med nästan runda kärnor, fint dispergerat kromatin och en liten mängd svagt basofil cytoplasma. Deras exakta antal är också svårt att fastställa. Det antas att HSC:er i mänsklig benmärg förekommer med en frekvens av 1 per 106 kärnförsedda celler.

Identifiering av hematopoetiska stamceller

För att förbättra kvaliteten på identifieringen av hematopoetiska stamceller utförs en sekventiell eller samtidig (på en flerkanalssorterare) studie av spektrumet av membranbundna antigener, och i HSC:er bör CD34+CD38-fenotypen kombineras med avsaknaden av linjära differentieringsmarkörer, särskilt antigener från immunkompetenta celler, såsom CD4, ytimmunoglobuliner och glykoforin.

Nästan alla fenotypningsscheman för hematopoetiska stamceller inkluderar bestämning av CD34-antigenet. Detta glykoprotein med en molekylvikt på cirka 110 kDa, som bär flera glykosyleringsställen, uttrycks på plasmacellmembranet efter aktivering av motsvarande gen lokaliserad på kromosom 1. CD34-molekylens funktion är associerad med L-selektinmedierad interaktion mellan tidiga hematopoetiska progenitorceller och benmärgens stromala bas. Man bör dock komma ihåg att närvaron av CD34-antigenet på cellytan endast möjliggör en preliminär bedömning av HSC-innehållet i cellsuspensionen, eftersom det också uttrycks av andra hematopoetiska progenitorceller, såväl som benmärgsstromala celler och endotelceller.

Under differentieringen av hematopoetiska progenitorceller minskar CD34-uttrycket permanent. Erytrocyt-, granulocyt- och monocytiska progenitorceller uttrycker antingen CD34-antigen svagt eller uttrycker det inte alls på sin yta (CD34-fenotyp). CD34-antigen detekteras inte på ytmembranet hos differentierade benmärgsceller och mogna blodkroppar.

Det bör noteras att i differentieringsdynamiken hos hematopoetiska progenitorceller minskar inte bara nivån av CD34-uttryck, utan även uttrycket av CD38-antigenet, ett integrerat membranglykoprotein med en molekylvikt på 46 kDa, vilket har NAD-glykohydrolas- och ADP-ribosylcyklasaktivitet, ökar progressivt, vilket tyder på dess deltagande i transport och syntes av ADP-ribos. Således uppstår möjligheten till dubbel kontroll av graden av engagemang hos hematopoetiska progenitorceller. Populationen av celler med CD34+CD38+-fenotypen, som utgör 90 till 99 % av CD34-positiva benmärgsceller, innehåller progenitorceller med begränsad proliferativ och differentierande potential, medan celler med CD34+CD38-fenotypen kan göra anspråk på rollen som HSC.

Benmärgscellpopulationen som beskrivs med formeln CD34+CD38- innehåller faktiskt ett relativt stort antal primitiva stamceller som kan differentiera i myeloid och lymfoid riktning. Under långvarig odling av celler med CD34+CD38--fenotypen är det möjligt att erhålla alla mogna bildade element i blodet: neutrofiler, eosinofiler, basofiler, monocyter, megakaryocyter, erytrocyter och lymfocyter.

Det har relativt nyligen fastställts att CD34-positiva celler uttrycker ytterligare två markörer, AC133 och CD90 (Thy-1), vilka också används för att identifiera hematopoetiska stamceller. Thy-1-antigenet samuttrycks med CD117-receptorn (c-kit) på CD34+ celler i benmärg, navelsträng och perifert blod. Det är ett ytligt fosfatidylinositolbindande glykoprotein med en molekylvikt på 25-35 kDa, vilket deltar i celladhesionsprocesser. Vissa författare tror att Thy-1-antigenet är en markör för de mest omogna CD34-positiva cellerna. Självreproducerande celler med CD34+Thy-1+ fenotypen ger upphov till långsiktiga odlade linjer med bildandet av dotterceller. Det antas att Thy-1-antigenet blockerar regleringssignaler som orsakar celldelningsstopp. Trots att CD34+Thy1+ celler kan självreproducera sig och skapa långsiktiga odlade linjer, kan deras fenotyp inte uteslutande tillskrivas HSC, eftersom innehållet av Thy-1+ i den totala massan av CD34-positiva cellulära element är cirka 50%, vilket avsevärt överstiger antalet hematopoetiska celler.

Mer lovande för identifiering av hematopoetiska stamceller bör erkännas som AC133 - en antigenmarkör för hematopoetiska progenitorceller, vars uttryck först detekterades på embryonala leverceller. AC133 är ett transmembranglykoprotein som uppträder på ytan av cellmembranet i de tidigaste stadierna av HSC-mognad - det är möjligt att det ännu tidigare än CD34-antigenet. I studier av A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) fastställdes att AC133 uttrycks av upp till 30% av CD34-positiva embryonala leverceller.

Således består den ideala fenotypiska profilen för hematopoetiska stamceller, enligt nuvarande koncept, av en cellulär kontur, vars konturer bör inkludera konfigurationer av CD34-, AC133- och Thy-1-antigenerna, men det finns inget utrymme för de molekylära projektionerna av CD38, HLA-DR och de linjära differentieringsmarkörerna GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

En variant av det fenotypiska porträttet av HSC:er kan vara kombinationen CD34+CD45RalowCD71low, eftersom egenskaperna hos de celler som beskrivs av denna formel inte skiljer sig från de funktionella parametrarna hos celler med CD34+CD38-fenotypen. Dessutom kan humana HSC:er identifieras genom de fenotypiska egenskaperna CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit /low - endast 30 sådana celler återställer hematopoesen fullständigt hos dödligt bestrålade möss.

Den 40 år långa intensiva forskningen kring HSC:er, som kan både självreproducera sig och differentiera sig till andra cellulära element, började med analysen av de allmänna fenotypiska egenskaperna hos benmärgsceller, vilket gjorde det möjligt att motivera användningen av benmärgstransplantation för behandling av olika patologier i det hematopoetiska systemet. Nya typer av stamceller som upptäckts senare har ännu inte använts i stor utsträckning i klinisk praxis. Samtidigt kan stamceller från navelsträngsblod och embryonal lever avsevärt utöka omfattningen av celltransplantation, inte bara inom hematologi utan även inom andra medicinska områden, eftersom de skiljer sig från benmärgs-HSC:er både i kvantitativa och kvalitativa egenskaper.

Den volym hematopoetiska stamcellsmassa som krävs för transplantation erhålls vanligtvis från benmärg, perifert blod och navelsträngsblod samt embryonal lever. Dessutom kan hematopoetiska progenitorceller erhållas in vitro genom att multiplicera ESC med deras efterföljande riktade differentiering till hematopoetiska cellulära element. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) noterar med rätta signifikanta skillnader i de immunologiska egenskaperna och förmågan att återställa hematopoesen hos HSC:er av olika ursprung, vilket beror på det ojämna förhållandet mellan tidiga pluripotenta och sent engagerade progenitorceller som finns i deras källor. Dessutom kännetecknas hematopoetiska stamceller erhållna från olika stamkällor av kvantitativt och kvalitativt helt olika associationer av icke-hematopoetiska celler.

Benmärg har redan blivit en traditionell källa till hematopoetiska stamceller. Benmärgscellsuspensioner erhålls från ilium eller sternum genom tvättning under lokalbedövning. Suspensionen som erhålls på detta sätt är heterogen och innehåller en blandning av HSC:er, stromala cellelement, dedikerade progenitorceller från myeloid- och lymfoidlinjer, samt mogna bildade element från blodet. Antalet celler med fenotyperna CD34+ och CD34+CD38 bland benmärgsmononukleära celler är 0,5–3,6 respektive 0–0,5 %. Perifert blod efter G-CSF-inducerad mobilisering av HSC:er innehåller 0,4–1,6 % CD34+ och 0–0,4 % CD34+CD38.

Andelen celler med immunofenotyperna CD34+CD38 och CD34+ är högre i navelsträngsblod - 0–0,6 respektive 1–2,6 %, och deras maximala antal detekteras bland de hematopoetiska cellerna i den embryonala levern - 0,2–12,5 respektive 2,3–35,8 %.

Kvaliteten på det transplanterade materialet beror dock inte bara på antalet CD34+ celler det innehåller, utan också på deras funktionella aktivitet, vilken kan bedömas genom nivån av kolonibildning in vivo (benmärgsrepopulation hos dödligt bestrålade djur) och in vitro - genom kolonitillväxt på halvflytande medier. Det visade sig att den kolonibildande och proliferativa aktiviteten hos hematopoetiska progenitorceller med CD34+CD38 HLA-DR-fenotypen isolerad från embryonal lever, fosterbenmärg och navelsträngsblod signifikant överstiger den proliferativa och kolonibildande potentialen hos hematopoetiska celler i benmärgen och perifert blod hos en vuxen. Kvantitativ och kvalitativ analys av HSC:er av olika ursprung avslöjade signifikanta skillnader i både deras relativa innehåll i cellsuspensionen och funktionella förmågor. Det maximala antalet CD34+ celler (24,6 %) hittades i det transplanterade materialet som erhölls från fosterbenmärg. Benmärgen hos en vuxen innehåller 2,1 % CD34-positiva cellulära element. Bland de mononukleära cellerna i vuxens perifera blod har endast 0,5 % CD34+-fenotypen, medan antalet i navelsträngsblod når 2 %. Samtidigt är den kolonibildande kapaciteten hos CD34+-celler i fosterbenmärg 2,7 gånger högre än den klonala tillväxtkapaciteten hos hematopoetiska celler i benmärg hos en vuxen, och navelsträngsblodceller bildar betydligt fler kolonier än hematopoetiska element isolerade från vuxens perifera blod: 65,5 respektive 40,8 kolonier/10^^ celler.

Skillnader i proliferativ aktivitet och kolonibildande kapacitet hos hematopoetiska stamceller är inte bara förknippade med olika grader av deras mognad, utan också med deras naturliga mikromiljö. Det är känt att proliferationsintensiteten och differentieringshastigheten för stamceller bestäms av den integrerade reglerande effekten av ett multikomponentsystem av tillväxtfaktorer och cytokiner som produceras både av stamcellerna själva och av de cellulära elementen i deras matrix-stromala mikromiljö. Användningen av renade cellpopulationer och serumfria medier för cellodling gjorde det möjligt att karakterisera tillväxtfaktorer som har en stimulerande och hämmande effekt på stamceller på olika nivåer, progenitorceller och celler som är inriktade på en eller annan linjär riktning. Resultaten av studierna indikerar övertygande att HSC:er erhållna från källor med olika nivåer av ontogenetisk utveckling skiljer sig både fenotypiskt och funktionellt. HSC:er i tidigare stadier av ontogenes kännetecknas av hög självreproduktionspotential och hög proliferativ aktivitet. Sådana celler kännetecknas av längre telomerer och genomgår inriktning för att bilda alla hematopoetiska cellinjer. Immunsystemets svar på HSC:er av embryonalt ursprung är fördröjt, eftersom sådana celler uttrycker HLA-molekyler svagt. Det finns en tydlig gradering av det relativa innehållet av HSC:er, deras självförnyelseförmåga och antalet typer av bindningslinjer de bildar: CD34+ celler i embryonal lever > CD34+ celler i navelsträngsblod > CD34+ celler i benmärg. Det är viktigt att sådana skillnader är inneboende inte bara i de intra-, neo- och tidiga postnatala perioderna av mänsklig utveckling, utan också i hela ontogenesen - den proliferativa och kolonibildande aktiviteten hos HSC:er som erhålls från benmärg eller perifert blod hos en vuxen är omvänt proportionell mot givarens ålder.