Hematopoietiska stamceller i gulesäcken

Uppenbarligen bestäms olika proliferativa och differentierande potentialer hos hematopoetiska stamceller av särdragen i deras ontogenetiska utveckling, eftersom även lokaliseringen av de huvudsakliga områdena för hematopoies förändras hos människor under ontogenesen. Hematopoetiska progenitorceller i fostrets gulesäck är engagerade i bildandet av en uteslutande erytropoetisk cellinje. Efter migrationen av primära HSC:er till levern och mjälten expanderar spektrumet av engagemangslinjer i dessa organs mikromiljö. I synnerhet förvärvar hematopoetiska stamceller förmågan att generera lymfoida celllinjer. Under den prenatala perioden når hematopoetiska progenitorceller zonen för slutlig lokalisering och befolkar benmärgen. Under intrauterin utveckling innehåller fostrets blod ett betydande antal hematopoetiska stamceller. Till exempel, i den 13:e graviditetsveckan når HSC-nivån 18% av det totala antalet mononukleära blodkroppar. Därefter observeras en progressiv minskning av deras innehåll, men även före födseln skiljer sig mängden HSC i navelsträngsblodet lite från deras mängd i benmärgen.

Enligt klassiska koncept sker den naturliga förändringen i hematopoesens lokalisering under däggdjurs embryonala utveckling genom migration och introduktion till en ny mikromiljö av pluripotenta hematopoetiska stamceller - från gulesäcken till levern, mjälten och benmärgen. Eftersom den hematopoetiska vävnaden i de tidiga stadierna av embryonal utveckling innehåller ett stort antal stamceller, vilket minskar när fostret mognar, anses den mest lovande vävnaden från den embryonala levern, isolerad från aborterat material vid 5-8 veckors graviditet, vara den mest lovande källan för att erhålla hematopoetiska stamceller.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Frågor om ursprunget till hematopoetiska stamceller

Det råder ingen tvekan om att embryonal bildning av erytrocyter har sitt ursprung i blodöarna i gulesäcken. Differentieringspotentialen in vitro för hematopoetiska gulesäcksceller är dock mycket begränsad (de differentierar huvudsakligen till erytrocyter). Det bör noteras att transplantation av hematopoetiska stamceller från gulesäcken inte kan återställa hematopoesen under lång tid. Det visade sig att dessa celler inte är föregångare till vuxna HSC:er. Äkta HSC:er uppträder tidigare, under den 3:e-5:e veckan av intrauterin utveckling, i zonen för bildning av magvävnad och endotel i blodkärlen (paraaortisk splanchnopleura, P-SP), såväl som i aorta, gonader och primära njurar - i mesonefros eller den så kallade AGM-regionen. Det har visats att celler i AGM-regionen är en källa inte bara till HSC:er, utan även till endotelceller i blodkärlen, såväl som osteoklaster involverade i benvävnadsbildningsprocesser. Vid den sjätte graviditetsveckan flyttas tidiga hematopoetiska progenitorceller från AGM-regionen till levern, som förblir fostrets huvudsakliga hematopoetiska organ fram till födseln.

Eftersom denna punkt är oerhört viktig ur celltransplantationssynpunkt förtjänar problemet med ursprunget till HSC:er i processen för mänsklig embryogenes en mer detaljerad presentation. De klassiska idéerna att hematopoetiska stamceller från däggdjur och fåglar härstammar från en extraembryonal källa är baserade på studier av Metcalf och Moore, som var de första att använda metoder för att klona HSC:er och deras ättlingar isolerade från gulesäcken. Resultaten av deras arbete tjänade som grund för migrationsteorin, enligt vilken HSC:er, som först uppträtt i gulesäcken, sekventiellt befolkar de övergående och definitiva hematopoetiska organen allt eftersom motsvarande mikromiljö bildas i dem. Så etablerades synpunkten att genereringen av HSC:er, initialt lokaliserade i gulesäcken, fungerar som den cellulära basen för definitiv hematopoes.

Hematopoetiska progenitorceller i gulesäcken tillhör kategorin av de tidigaste hematopoetiska progenitorcellerna. Deras fenotyp beskrivs av formeln AA4.1+CD34+c-kit+. Till skillnad från mogna benmärgs-HSC:er uttrycker de inte Sca-1-antigener och MHC-molekyler. Det verkar som att uppkomsten av markörantigener på ytmembranen hos gulesäcks-HSC:er under odling motsvarar deras differentiering under embryonal utveckling med bildandet av engagerade hematopoetiska linjer: nivån av CD34- och Thy-1-antigenuttryck minskar, CD38- och CD45RA-uttryck ökar och HLA-DR-molekyler uppträder. Med efterföljande specialisering in vitro inducerad av cytokiner och tillväxtfaktorer börjar uttryck av antigener specifika för hematopoetiska progenitorceller från en viss cellinje. Resultaten av studien av embryonal hematopoes hos representanter för tre klasser av ryggradsdjur (amfibier, fåglar och däggdjur) och i synnerhet analysen av ursprunget för HSC:er som ansvarar för definitiv hematopoes i postnatal ontogenes, motsäger dock klassiska koncept. Det har fastställts att hos representanter för alla de klasser som beaktats bildas två oberoende regioner där HSC:er uppstår under embryogenesen. Den extraembryonala "klassiska" regionen representeras av gulesäcken eller dess analoger, medan den nyligen identifierade intraembryonala zonen för HSC-lokalisering inkluderar det paraaorta mesenkymet och AGM-regionen. Idag kan man hävda att hos amfibier och fåglar härrör definitiva HSC:er från intraembryonala källor, medan hos däggdjur och människor kan deltagandet av gulesäcks-HSC:er i definitiv hematopoes ännu inte helt uteslutas.

Embryonal hematopoies i gulesäcken är i själva verket primär erytropoes, som kännetecknas av att cellkärnan bevaras i alla stadier av erytrocytmognad och syntesen av hemoglobin av fetalt typ. Enligt de senaste uppgifterna slutar vågen av primär erytropoes i gulesäcken på den 8:e dagen av embryonal utveckling. Den följs av en period av ackumulering av definitiva erytroida progenitorceller - BFU-E, som bildas uteslutande i gulesäcken och först uppträder på den 9:e dagen av graviditeten. I nästa steg av embryogenesen bildas redan definitiva erytroida progenitorceller - CFU-E, såväl som (!) mastceller och CFU-GM. Detta är grunden för synpunkten att definitiva progenitorceller uppstår i gulesäcken, migrerar med blodomloppet, bosätter sig i levern och snabbt initierar den första fasen av intraembryonal hematopoies. Enligt dessa koncept kan gulesäcken betraktas, å ena sidan, som platsen för primär erytropoes, och å andra sidan som den första källan till definitiva hematopoetiska stamceller i embryonal utveckling.

Det har visats att kolonibildande celler med hög proliferativ potential kan isoleras från gulesäcken så tidigt som på den åttonde dagen av graviditeten, dvs. långt innan embryots och gulesäckens kärlsystem stängs. Dessutom bildar celler med hög proliferativ potential som erhållits från gulesäcken in vitro kolonier vars storlek och cellulära sammansättning inte skiljer sig från motsvarande parametrar för kulturell tillväxt av benmärgsstamceller. Samtidigt, vid återtransplantation av kolonibildande celler från gulesäcken med hög proliferativ potential, bildas betydligt fler dotterkolonibildande celler och multipotenta progenitorceller än vid användning av benmärgsprogenitorceller från hematopoesen.

En slutgiltig slutsats om rollen av hematopoetiska stamceller från gulesäcken i definitiv hematopoes kunde dras av resultaten av arbetet där författarna erhöll en linje av gulesäcksendotelceller (G166), som effektivt stödde proliferationen av dess celler med de fenotypiska och funktionella egenskaperna hos HSC:er (AA4.1+WGA+, låg densitet och svaga vidhäftningsegenskaper). Halten av de senare ökade mer än 100-faldigt när de odlades på ett matarlager av C166-celler i 8 dagar. Makrofager, granulocyter, megakaryocyter, blastceller och monocyter, samt B- och T-lymfocytprekursorceller identifierades i blandade kolonier odlade på ett underlager av C166-celler. Gulesäcksceller som växte på ett underlager av endotelceller hade förmågan att självreproducera sig och motstod upp till tre passager i författarnas experiment. Återställandet av hematopoesen med deras hjälp hos mogna möss med svår kombinerad immunbrist (SCID) åtföljdes av bildandet av alla typer av leukocyter, såväl som T- och B-lymfocyter. Författarna i sina studier använde dock gulesäcksceller från ett 10 dagar gammalt embryo, där de extra- och intraembryonala kärlsystemen redan är stängda, vilket inte tillåter oss att utesluta förekomsten av intraembryonala HSC:er bland gulesäckscellerna.

Samtidigt avslöjade analysen av differentieringspotentialen hos hematopoetiska celler i tidiga utvecklingsstadier, isolerade före förening av gulesäckens och embryots kärlsystem (8-8,5 dagars dräktighet), närvaron av prekursorer till T- och B-celler i gulesäcken, men inte i embryots kropp. I in vitro-systemet, genom metoden med tvåstegsodling på ett monolager av epiteliala och subepiteliala celler i tymus, differentierade mononukleära celler i gulesäcken till pre-T- och mogna T-lymfocyter. Under samma odlingsförhållanden, men på ett monolager av stromala celler i levern och benmärgen, differentierade mononukleära celler i gulesäcken till pre-B-celler och mogna IglVT-B-lymfocyter.

Resultaten av dessa studier indikerar möjligheten för utveckling av immunsystemceller från extraembryonal vävnad i gulesäcken, och bildandet av primära T- och B-cellinjer beror på faktorer i den stromala mikromiljön i embryonala hematopoetiska organ.

Andra författare har också visat att gulesäcken innehåller celler med potential för lymfoiddifferentiering, och de resulterande lymfocyterna skiljer sig inte i antigena egenskaper från de hos sexuellt mogna djur. Det har fastställts att gulesäckscellerna hos ett 8-9 dagar gammalt embryo är kapabla att återställa lymfopoesen i atymocyt-tymusen med uppkomsten av mogna CD3+CD4+- och CD3+CD8+-lymfocyter som har en bildad repertoar av T-cellsreceptorer. Således kan tymusen befolkas av celler av extraembryonalt ursprung, men det är omöjligt att utesluta den sannolika migrationen av tidiga T-lymfocyt-prekursorceller från intraembryonala lymfopoeskällor till tymusen.

Samtidigt resulterar transplantation av hematopoetiska gulesäcksceller till vuxna bestrålade mottagare inte alltid i långsiktig repopulation av utarmade hematopoetiska vävnadslokaliseringszoner, och in vitro-gulesäcksceller bildar betydligt färre mjältkolonier än celler i AGM-regionen. I vissa fall är det fortfarande möjligt att uppnå långsiktig (upp till 6 månader) repopulation av hematopoetisk vävnad i bestrålade mottagare med hjälp av gulesäcksceller från ett 9 dagar gammalt embryo. Författarna anser att gulesäcksceller med CD34+c-kit+-fenotypen inte bara skiljer sig från de från AGM-regionen i sin förmåga att repopulera utarmade hematopoetiska organ, utan också återställa hematopoesen mer effektivt, eftersom gulesäcken innehåller nästan 37 gånger fler av dem.

Det bör noteras att experimenten använde hematopoetiska gulesäcksceller med markörantigener från hematopoetiska stamceller (c-kit+ och/eller CD34+ och CD38+), vilka injicerades direkt i levern eller bukvenen hos avkomman till honmöss som fick en injektion av busulfan på den 18:e dagen av graviditeten. Hos sådana nyfödda djur hämmades deras egen myelopoies kraftigt på grund av eliminering av hematopoetiska stamceller orsakade av busulfan. Efter transplantation av hematopoetiska gulesäcksstamceller detekterades bildade element innehållande donatormarkören - glycerofosfatdehydrogenas - i mottagarnas perifera blod under 11 månader. Det visade sig att gulesäcks-HSC:er återställde innehållet av lymfoida, myeloida och erytroida celler i blodet, tymus, mjälte och benmärg, och nivån av chimerism var högre vid intrahepatisk snarare än intravenös administrering av gulesäcksceller. Författarna tror att gulesäcksceller (HSC) hos embryon i tidigt skede (upp till 10 dagar) kräver preliminär interaktion med leverns hematopoetiska mikromiljö för att framgångsrikt kunna befolka de hematopoetiska organen hos vuxna mottagare. Det är möjligt att det finns ett unikt utvecklingsstadium i embryogenesen, när gulesäcksceller, som initialt migrerar till levern, sedan förvärvar förmågan att befolka stroma i de hematopoetiska organen hos mogna mottagare.

I detta avseende bör det noteras att chimärism hos immunsystemets celler observeras ganska ofta efter transplantation av benmärgsceller till bestrålade mogna mottagare - i blodet hos de senare finns celler av donatorfenotypen i ganska stora mängder bland mottagarens B-, T-lymfocyter och granulocyter, vilket fortsätter i minst 6 månader.

Hematopoetiska celler hos däggdjur detekteras först med morfologiska metoder på den sjunde dagen av embryonal utveckling och representeras av hematopoetiska öar inuti gulesäckens kärl. Emellertid är naturlig hematopoetisk differentiering i gulesäcken begränsad till primära erytrocyter som behåller kärnor och syntetiserar fetalt hemoglobin. Ändå trodde man traditionellt att gulesäcken fungerar som den enda källan för HSC som migrerar till de hematopoetiska organen i det utvecklande embryot och ger definitiv hematopoies hos vuxna djur, eftersom uppkomsten av HSC i embryonets kropp sammanfaller med stängningen av gulesäckens och embryots kärlsystem. Denna synvinkel stöds av data om att gulesäcksceller, när de klonas in vitro, ger upphov till granulocyter och makrofager, och in vivo - till mjältkolonier. Sedan, under transplantationsexperiment, fastställdes det att de hematopoetiska cellerna i gulesäcken, som i själva gulesäcken endast kan differentieras till primära erytrocyter, i leverns mikromiljö hos nyfödda och vuxna SCID-möss, den utarmade tymus- eller stromala mataren förvärvar förmågan att återbefolka hematopoetiska organ med återställande av alla hematopoetiska linjer även hos vuxna mottagardjur. I princip tillåter detta oss att klassificera dem som riktiga HSC - som celler som fungerar under den postnatala perioden. Det antas att gulesäcken, tillsammans med AGM-regionen, fungerar som en källa till HSC för definitiv hematopoies hos däggdjur, men deras bidrag till utvecklingen av det hematopoetiska systemet är fortfarande oklart. Den biologiska betydelsen av existensen av två hematopoetiska organ med liknande funktioner i tidig däggdjursembryogenes är också oklar.

Sökandet efter svar på dessa frågor fortsätter. In vivo kunde man bevisa närvaron i gulesäcken hos 8-8,5 dagar gamla embryon av celler som återställer lymfopoesen hos subletalt bestrålade SCID-möss med en uttalad brist på T- och B-lymfocyter. Hematopoetiska gulesäcksceller injicerades både intraperitonealt och direkt i mjälte- och levervävnaden. Efter 16 veckor detekterades TCR/CD34 CD4+ och CD8+ T-lymfocyter och B-220+IgM+ B-lymfocyter märkta med donator-MHC-antrxgener hos mottagarna. Samtidigt fann författarna inga stamceller som var kapabla till sådan återställning av immunsystemet i kroppen hos 8-8,5 dagar gamla embryon.

Hematopoetiska gulesäcksceller har en hög proliferativ potential och kan utföra långvarig självreproduktion in vitro. Vissa författare identifierar dessa celler som HSC:er baserat på den förlängda (nästan 7 månader) genereringen av erytroida progenitorceller, vilka skiljer sig från benmärgsprogenitorceller av erytroidlinjen genom en längre passageperiod, större kolonistorlekar, ökad känslighet för tillväxtfaktorer och längre proliferation. Dessutom bildas även lymfoida progenitorceller under lämpliga förhållanden för gulesäckscellodling in vitro.

De presenterade uppgifterna tillåter oss generellt att betrakta gulesäcken som en källa till HSC:er, mindre engagerade och därför med en större proliferativ potential än benmärgsstamceller. Trots att gulesäcken innehåller pluripotenta hematopoetiska progenitorceller som upprätthåller olika linjer av hematopoetisk differentiering in vitro under lång tid, är det enda kriteriet för fullständigheten av HSC:er deras förmåga att långsiktigt återbefolka mottagarens hematopoetiska organ, vars hematopoetiska celler är förstörda eller genetiskt defekta. Således är den viktigaste frågan om pluripotenta hematopoetiska celler i gulesäcken kan migrera och befolka hematopoetiska organ och om det är lämpligt att revidera de kända arbeten som visar deras förmåga att återbefolka de hematopoetiska organen hos mogna djur med bildandet av de huvudsakliga hematopoetiska linjerna. Intraembryonala källor till definitiva GSC identifierades i fågelembryon redan på 1970-talet, vilket redan då ifrågasatte de etablerade idéerna om GSC:ernas extraembryonala ursprung, inklusive hos representanter för andra klasser av ryggradsdjur. Under de senaste åren har publikationer publicerats om förekomsten av liknande intraembryonala områden som innehåller GSC:er hos däggdjur och människor.

Det bör återigen noteras att grundläggande kunskaper inom detta område är oerhört viktiga för praktisk celltransplantation, eftersom de inte bara kommer att hjälpa till att bestämma den föredragna källan till HSC, utan också att fastställa egenskaperna hos interaktionen mellan primära hematopoetiska celler och en genetiskt främmande organism. Det är känt att införandet av hematopoetiska stamceller från mänsklig fosterlever i ett fårembryo i organogenesstadiet leder till födelsen av chimärer, i vilka 3 till 5% av de mänskliga hematopoetiska cellerna stabilt bestäms. Samtidigt förändrar inte mänskliga HSC sin karyotyp, vilket bibehåller en hög proliferationshastighet och förmågan att differentiera. Dessutom strider inte transplanterade xenogena HSC med immunsystemet och fagocyterna hos värdorganismen och omvandlas inte till tumörceller, vilket låg till grund för den intensiva utvecklingen av metoder för intrauterin korrigering av ärftlig genetisk patologi med hjälp av HSC eller ESC transfekterade med bristfälliga gener.

Men i vilket skede av embryogenesen är det mer lämpligt att genomföra en sådan korrigering? För första gången uppträder celler som identifierats för hematopoies hos däggdjur omedelbart efter implantation (6:e dagen av dräktigheten), när morfologiska tecken på hematopoetisk differentiering och presumptiva hematopoetiska organ fortfarande saknas. I detta skede kan spridda celler från musembryot återbefolka de hematopoetiska organen hos bestrålade mottagare med bildandet av erytrocyter och lymfocyter som skiljer sig från värdcellerna genom typen av hemoglobin respektive glycerofosfatisomeras, samt en ytterligare kromosommarkör (Tb) hos donatorceller. Hos däggdjur, liksom hos fåglar, samtidigt med gulesäcken, innan den gemensamma kärlbädden stängs, uppträder hematopoetiska celler direkt i embryots kropp i den paraaortiska splanchnopleura. Hematopoetiska celler av AA4.1+ fenotypen isolerades från AGM-regionen och karakteriserades som multipotenta hematopoetiska celler som bildar T- och B-lymfocyter, granulocyter, megakaryocyter och makrofager. Fenotypiskt sett är dessa multipotenta progenitorceller mycket nära HSC:erna i benmärgen hos vuxna djur (CD34+c-kit+). Antalet multipotenta AA4.1+ celler bland alla celler i AGM-regionen är litet - de utgör högst 1/12 av dess andel.

I det mänskliga embryot har man också identifierat en intraembryonal region som innehåller HSC:er homologa med AGM-regionen hos djur. Dessutom finns mer än 80 % av multipotenta celler med hög proliferativ potential i embryots kropp hos människor, även om sådana celler också finns i gulesäcken. En detaljerad analys av deras lokalisering visade att hundratals sådana celler är samlade i kompakta grupper som är belägna i omedelbar närhet av endotelet i den ventrala väggen av den dorsala aorta. Fenotypiskt är de CD34CD45+Lin-celler. Tvärtom är sådana celler enskilda i gulesäcken, såväl som i andra hematopoetiska organ i embryot (lever, benmärg).

Följaktligen innehåller AGM-regionen i det mänskliga embryot kluster av hematopoetiska celler som är nära associerade med det ventrala endotelet i dorsalaorta. Denna kontakt spåras också på immunokemisk nivå - både cellerna i de hematopoetiska klustren och endotelcellerna uttrycker den vaskulära endoteltillväxtfaktorn, Flt-3-liganden, deras receptorer FLK-1 och STK-1, såväl som transkriptionsfaktorn för leukemistamceller. I AGM-regionen representeras mesenkymala derivat av en tät sträng av rundade celler belägna längs hela dorsalaorta och uttrycker tenascin C - ett glykoprotein i grundsubstansen som är aktivt involverat i processerna för intercellulär interaktion och migration.

Multipotenta stamceller från AGM-regionen återställer snabbt hematopoesen hos mogna bestrålade möss efter transplantation och ger effektiv hematopoes under lång tid (upp till 8 månader). Författarna hittade inga celler med sådana egenskaper i gulesäcken. Resultaten av denna studie bekräftas av data från ett annat arbete, som visade att i embryon i tidiga utvecklingsstadier (10,5 dagar) är AGM-regionen den enda källan till celler som motsvarar definitionen av HSC, vilket återställer myeloid och lymfoid hematopoes hos mogna bestrålade mottagare.

AGM-S3-stromallinjen isolerades från AGM-regionen, vars celler stöder genereringen av engagerade progenitorceller CFU-GM, BFU-E, CFU-E och blandade kolonibildande enheter i kultur. Halten av de senare under odling på ett matarunderlager av AGM-S3-linjeceller ökar från 10 till 80 gånger. Således innehåller mikromiljön i AGM-regionen stromala basceller som effektivt stöder hematopoesen, så AGM-regionen i sig kan mycket väl fungera som ett embryonalt hematopoetiskt organ - en källa till definitiva HSC:er, det vill säga HSC:er som bildar den hematopoetiska vävnaden hos ett vuxet djur.

Utökad immunofenotypning av cellkompositionen i AGM-regionen visade att den inte bara innehåller multipotenta hematopoetiska celler, utan även celler som är dedikerade till myeloid och lymfoid (T- och B-lymfocyt) differentiering. Molekylär analys av individuella CD34+c-kit+ celler från AGM-regionen med hjälp av polymeraskedjereaktion visade dock aktivering av endast beta-globin- och myeloperoxidasgener, men inte lymfoida gener som kodar för syntesen av CD34, Thy-1 och 15. Delvis aktivering av härstamningsspecifika gener är karakteristiskt för tidiga ontogenetiska stadier av genereringen av HSC:er och progenitorceller. Med tanke på att antalet dedikerade progenitorceller i AGM-regionen hos ett 10-dagars embryo är 2-3 storleksordningar lägre än i levern, kan man hävda att hematopoesen i AGM-regionen just har börjat på den 10:e dagen av embryogenesen, medan de hematopoetiska linjerna redan har utvecklats i fostrets huvudsakliga hematopoetiska organ under denna period.

Till skillnad från tidigare (9-11 dagar gamla) hematopoetiska stamceller från gulesäcken och AGM-regionen, som återbefolkar den hematopoetiska mikromiljön hos den nyfödda, men inte hos den vuxna organismen, kräver hematopoetiska progenitorceller från den 12-17 dagar gamla embryonala levern inte längre en tidig postnatal mikromiljö och befolkar de hematopoetiska organen hos ett vuxet djur inte sämre än en nyfödd. Efter transplantation av embryonala lever-HSC:er hade hematopoesen hos bestrålade vuxna mottagarmöss en polyklonal karaktär. Dessutom visades det med hjälp av märkta kolonier att funktionen hos de ympade klonerna är helt beroende av den klonala successionen som avslöjas i den vuxna benmärgen. Följaktligen har embryonala lever-HSC:er, märkta under de mest skonsamma förhållandena, utan förstimulering med exogena cytokiner, redan de viktigaste egenskaperna hos vuxna HSC:er: de kräver inte en tidig postembryonal mikromiljö, går in i ett tillstånd av djup vila efter transplantation och mobiliseras sekventiellt till klonal bildning i enlighet med den klonala successionsmodellen.

Det är uppenbart nödvändigt att uppehålla sig vid fenomenet klonal succession mer i detalj. Erytropoes utförs av hematopoetiska stamceller som har en hög proliferativ potential och förmågan att differentiera till alla linjer av engagerade prekursorceller i blodkroppar. Vid normal hematopoiesintensitet är de flesta hematopoetiska stamceller i ett vilande tillstånd och mobiliseras för proliferation och differentiering, och bildar sekventiellt kloner som ersätter varandra. Denna process kallas klonal succession. Experimentella bevis för klonal succession i det hematopoetiska systemet erhölls i studier med HSC:er präglade av retroviral genöverföring. Hos vuxna djur upprätthålls hematopoiesen av många samtidigt fungerande hematopoetiska kloner, derivat av HSC:er. Baserat på fenomenet klonal succession har en repopulationsmetod för identifiering av HSC:er utvecklats. Enligt denna princip skiljer man mellan långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC), som kan återställa det hematopoetiska systemet under hela livet, och kortsiktiga HSC, som utför denna funktion under en begränsad tidsperiod.

Om vi betraktar hematopoetiska stamceller ur ett repopulationsperspektiv, så är det speciella med hematopoetiska celler i den embryonala levern deras förmåga att skapa kolonier som är betydligt större i storlek än de som finns i tillväxten av navelsträngsblod eller benmärgs-HSC, och detta gäller alla typer av kolonier. Bara detta faktum indikerar en högre proliferativ potential hos hematopoetiska celler i den embryonala levern. En unik egenskap hos hematopoetiska progenitorceller i den embryonala levern är en kortare cellcykel jämfört med andra källor, vilket är av stor betydelse med tanke på effektiviteten av hematopoetisk organrepopulation under transplantation. Analys av cellkompositionen i den hematopoetiska suspensionen som erhållits från källor från en mogen organism indikerar att kärnceller i alla stadier av ontogenesen huvudsakligen representeras av slutdifferentierade celler, vars antal och fenotyp beror på den ontogenetiska åldern hos givaren av hematopoetisk vävnad. I synnerhet består suspensioner av mononukleära celler från benmärg och navelsträngsblod av mer än 50 % mogna celler från lymfoidserien, medan den hematopoetiska vävnaden i den embryonala levern innehåller mindre än 10 % lymfocyter. Dessutom representeras cellerna från den myeloida linjen i den embryonala och fosterlevern huvudsakligen av erytroida serien, medan granulocyt-makrofagelement dominerar i navelsträngsblod och benmärg.

Det är också viktigt att den embryonala levern innehåller en komplett uppsättning av de tidigaste hematopoetiska prekursorerna. Bland de senare bör erytroida, granulopoietiska, megakaryopoetiska och multilineage-kolonibildande celler noteras. Deras mer primitiva prekursorer - LTC-IC - kan proliferera och differentiera in vitro i 5 veckor eller mer, och bibehåller även funktionell aktivitet efter inplantning i mottagarens kropp under allogen och till och med xenogen transplantation till immunbristfälliga djur.

Den biologiska fördelen med att erytroida celler dominerar i den embryonala levern (upp till 90 % av det totala antalet hematopoetiska element) beror på behovet av att förse det snabbt ökande blodvolymen hos det utvecklande fostret med erytrocytmassa. I den embryonala levern representeras erytropoesen av nukleära erytroida prekursorer av varierande mognad som innehåller fetalt hemoglobin (a2u7), vilket på grund av sin högre affinitet för syre säkerställer effektiv absorption av det senare från moderns blod. Intensifiering av erytropoesen i den embryonala levern är förknippad med en lokal ökning av syntesen av erytropoietin (EPO). Det är anmärkningsvärt att närvaron av ensamt erytropoietin är tillräcklig för att realisera den hematopoetiska potentialen hos hematopoetiska celler i den embryonala levern, medan en kombination av cytokiner och tillväxtfaktorer bestående av EPO, SCF, GM-CSF och IL-3 krävs för att benmärgs- och navelsträngsblods HSC:er ska kunna engageras i erytropoesen. Samtidigt svarar tidiga hematopoetiska progenitorceller isolerade från den embryonala levern, vilka inte har receptorer för EPO, inte på exogent erytropoietin. För induktion av erytropoes i en suspension av mononukleära celler från den embryonala levern är närvaron av mer avancerade erytropoietinkänsliga celler med CD34+CD38+ fenotypen, som uttrycker EPO-receptorn, nödvändig.

I litteraturen finns det fortfarande ingen konsensus om utvecklingen av hematopoesen under embryonalperioden. Den funktionella betydelsen av förekomsten av extra- och intraembryonala källor till hematopoetiska progenitorceller har inte fastställts. Det råder dock ingen tvekan om att levern är det centrala organet för hematopoesen i mänsklig embryogenes och under 6:e till 12:e graviditetsveckan fungerar den som den huvudsakliga källan till hematopoetiska stamceller som befolkar mjälten, tymus och benmärg. GDR säkerställer utförandet av motsvarande funktioner under pre- och postnatal utvecklingsperioder.

Det bör återigen noteras att den embryonala levern, jämfört med andra källor, kännetecknas av det högsta innehållet av HSC. Cirka 30 % av CD344-cellerna i den embryonala levern har CD38-fenotypen. Samtidigt är antalet lymfoida progenitorceller (CD45+) i de tidiga stadierna av hematopoesen i levern högst 4 %. Det har fastställts att, allt eftersom fostret utvecklas, från 7 till 17 veckors graviditet, ökar antalet B-lymfocyter gradvis med ett månatligt "steg" på 1,1 %, medan nivån av HSC minskar permanent.

Den funktionella aktiviteten hos hematopoetiska stamceller beror också på den embryonala utvecklingsperioden för deras ursprung. Studien av den kolonibildande aktiviteten hos leverceller från mänskliga embryon vid 6-8 och 9-12 graviditetsveckor under odling i ett halvflytande medium i närvaro av SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 och EPO visade att det totala antalet kolonier är 1,5 gånger högre vid sådd av HSC:er från embryonal lever i tidiga utvecklingsstadier. Samtidigt är antalet myelopoiesprogenitorceller, såsom CFU-GEMM, i levern vid 6-8 veckors embryogenes mer än tre gånger högre än deras antal vid 9-12 veckors graviditet. I allmänhet var den kolonibildande aktiviteten hos hematopoetiska leverceller från embryon under den första trimestern av graviditeten signifikant högre än den hos fosterleverceller under den andra trimestern av graviditeten.

Ovanstående data indikerar att den embryonala levern i början av embryogenesen inte bara utmärks av ett ökat innehåll av tidiga hematopoetiska progenitorceller, utan att dess hematopoetiska celler kännetecknas av ett bredare spektrum av differentiering till olika cellinjer. Dessa egenskaper hos den funktionella aktiviteten hos hematopoetiska stamceller i den embryonala levern kan ha en viss klinisk betydelse, eftersom deras kvalitativa egenskaper gör att vi kan förvänta oss en uttalad terapeutisk effekt vid transplantation även vid ett litet antal celler som erhållits i tidiga stadier av graviditeten.

Problemet med mängden hematopoetiska stamceller som krävs för effektiv transplantation är dock fortfarande öppet och relevant. Försök görs att lösa det med hjälp av den höga potentialen för självreproduktion av hematopoetiska celler i den embryonala levern in vitro när de stimuleras av cytokiner och tillväxtfaktorer. Med konstant perfusion av tidiga embryonala lever-HSC:er i en bioreaktor är det efter 2-3 dagar möjligt att erhålla en mängd hematopoetiska stamceller vid produktionen som är 15 gånger högre än deras initiala nivå. Som jämförelse bör det noteras att det krävs minst två veckor för att uppnå en 20-faldig ökning av produktionen av HSC:er från humant navelsträngsblod under samma förhållanden.

Således skiljer sig den embryonala levern från andra källor till hematopoetiska stamceller genom ett högre innehåll av både engagerade och tidiga hematopoetiska progenitorceller. I kultur med tillväxtfaktorer bildar embryonala leverceller med fenotypen CD34+CD45Ra1 CD71l0W 30 gånger fler kolonier än liknande navelsträngsblodceller och 90 gånger fler än benmärgs-HSC:er. De mest uttalade skillnaderna i de specificerade källorna ligger i innehållet av tidiga hematopoetiska progenitorceller som bildar blandade kolonier - mängden CFU-GEMM i den embryonala levern överstiger den i navelsträngsblod och benmärg med 60 respektive 250 gånger.

Det är också viktigt att fram till den 18:e veckan av embryonal utveckling (perioden då hematopoesen börjar i benmärgen) är mer än 60 % av levercellerna involverade i implementeringen av den hematopoetiska funktionen. Eftersom det mänskliga fostret inte har någon tymus och följaktligen tymocyter fram till den 13:e utvecklingsveckan, minskar transplantation av hematopoetiska celler från embryonal lever från 6-12 veckors graviditet avsevärt risken för att utveckla en "graft versus host"-reaktion och kräver inte val av en histokompatibel donator, eftersom det gör det relativt enkelt att uppnå hematopoetisk chimärism.