Begränsningar, faror och komplikationer vid celltransplantation

Regenerativ plastisk medicin baseras på den kliniska implementeringen av de toti- och pluripotenta egenskaperna hos embryonala och progenitorstamceller, vilket möjliggör skapandet in vitro och in vivo av specificerade cellinjer som återbefolkar skadade vävnader och organ hos en sjuk person.

Den verkliga möjligheten att använda embryonala stamceller och stamceller från definitiva vävnader (så kallade "vuxna" stamceller) från människor för terapeutiska ändamål råder inte längre någon tvekan om. Experter från National and Medical Academies of the USA (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press) och National Institute of Health of the USA (Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA) rekommenderar dock en mer detaljerad studie av stamcellers egenskaper i experiment på adekvata biologiska modeller och en objektiv bedömning av alla konsekvenser av transplantation, och först därefter användning av stamceller i kliniken.

Det har fastställts att stamceller är en del av vävnadsderivaten från alla tre groddlager. Stamceller finns i näthinnan, hornhinnan, hudens epidermis, benmärg och perifert blod, i blodkärl, tandpulpa, njurar, mag-tarm-epitel, bukspottkörtel och lever. Med moderna metoder har det bevisats att neurala stamceller är lokaliserade i hjärnan och ryggmärgen hos en vuxen. Dessa sensationella data väckte särskild uppmärksamhet från forskare och media, eftersom neuroner i hjärnan fungerade som ett klassiskt exempel på en statisk cellpopulation som inte återställs. Både under de tidiga och sena perioderna av ontogenesen bildas neuroner, astrocyter och oligodendrocyter i hjärnan hos djur och människor på grund av neurala stamceller (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Under normala förhållanden visar sig dock inte plasticiteten hos stamceller från definitiva vävnader. För att realisera den plastiska potentialen hos stamceller från definitiva vävnader måste de isoleras och sedan odlas i medier med cytokiner (LIF, EGF, FGF). Dessutom transplanteras stamcellsderivat framgångsrikt endast när de transplanteras in i kroppen hos ett djur med nedsatt immunförsvar (γ-bestrålning, cytostatika, busulfan, etc.). Hittills har inga övertygande bevis erhållits för implementeringen av stamcellsplasticitet hos djur som inte har exponerats för strålning eller andra effekter som orsakar djup immunsuppression.

Under sådana förhållanden manifesterar sig den farliga potentialen hos ESC först och främst under deras transplantation till ektopiska områden - under subkutan injektion av ESC i immunbristfälliga möss bildas teratokarcinom vid injektionsstället. Dessutom är frekvensen av kromosomavvikelser högre under utvecklingen av det mänskliga embryot än vid embryogenes hos djur. I blastocyststadiet består endast 20-25 % av mänskliga embryon av celler med normal karyotyp, och den överväldigande majoriteten av tidiga mänskliga embryon som erhållits efter in vitro-fertilisering uppvisar kaotisk kromosommosaik och stöter ofta på numeriska och strukturella avvikelser.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Stamcellernas gynnsamma effekter

Preliminära resultat från kliniska prövningar bekräftar stamcellernas gynnsamma effekt på patienten, men det finns fortfarande ingen information om de långsiktiga effekterna av celltransplantation. Litteraturen dominerades inledningsvis av rapporter om positiva resultat av transplantation av embryonala hjärnfragment vid Parkinsons sjukdom, men sedan började data dyka upp som förnekade den effektiva terapeutiska effekten av embryonal eller fosternervvävnad transplanterad i patienters hjärna.

I mitten av 1900-talet upptäcktes återställandet av hematopoesen hos dödligt bestrålade djur efter intravenös transfusion av benmärgsceller, och 1969 utförde den amerikanske forskaren D. Thomas den första benmärgstransplantationen på människor. Bristen på kunskap om mekanismerna för immunologisk inkompatibilitet mellan donator- och mottagarbenmärgsceller vid den tiden ledde till hög dödlighet på grund av frekvent transplantationsmisslyckande och utveckling av graft-versus-host-reaktion. Upptäckten av det huvudsakliga histokompatibilitetskomplexet, som inkluderar humana leukocytantigener (HbA), och förbättringen av deras typningsmetoder gjorde det möjligt att avsevärt öka överlevnaden efter benmärgstransplantation, vilket ledde till en utbredd användning av denna behandlingsmetod inom onkohematologi. Ett decennium senare utfördes de första transplantationerna av hematopoetiska stamceller (HSC) erhållna från perifert blod med hjälp av leukaferes. År 1988 användes navelsträngsblod för första gången som källa till HSC i Frankrike för att behandla ett barn med Fanconis anemi, och sedan slutet av 2000 har rapporter publicerats i pressen om HSC:s förmåga att differentiera till celler av olika vävnadstyper, vilket potentiellt utvidgar deras kliniska tillämpning. Det visade sig dock att transplantationsmaterialet, tillsammans med HSC:er, innehåller ett betydande antal icke-hematopoetiska cellföroreningar av olika slag och egenskaper. I detta avseende utvecklas metoder för att rena transplantatet och kriterier för att bedöma dess cellrenhet. I synnerhet används positiv immunselektion av CD34+ celler, vilket möjliggör isolering av HSC:er med hjälp av monoklonala antikroppar.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Komplikationer av stamcellsbehandling

Komplikationer vid benmärgstransplantation är oftast hematologiska och förknippade med en lång period av iatrogen pancytopeni. Infektionskomplikationer, anemi och blödningar utvecklas oftast. I detta avseende är det oerhört viktigt att välja det optimala sättet för benmärgsinsamling, bearbetning och lagring för maximal bevarande av stamceller, vilket säkerställer snabb och stabil återställning av hematopoesen. Vid karakterisering av en transplantation bedöms följande parametrar för närvarande vanligtvis: antalet mononukleära och/eller kärnförsedda celler, kolonibildande enheter och innehållet av CD34-positiva celler. Tyvärr ger dessa indikatorer endast en indirekt bedömning av den verkliga hematopoetiska kapaciteten hos transplantatets stamcellspopulation. Idag finns det inga absolut exakta parametrar för att bestämma ett transplantats tillräcklighet för långsiktig återställning av hematopoesen hos patienter, även med autolog benmärgstransplantation. Utvecklingen av allmänna kriterier är extremt svår på grund av bristen på strikta standarder för bearbetning, kryokonservering och testning av transplantatet. Dessutom är det nödvändigt att ta hänsyn till alla de faktorer som påverkar parametrarna för framgångsrik återställning av hematopoesen hos varje enskild patient. Vid autolog benmärgstransplantation är de viktigaste antalet tidigare kemoterapikurer, konditioneringsregimens egenskaper, sjukdomsperioden under vilken benmärgen samlades in och systemen för att använda kolonistimulerande faktorer efter transplantationen. Dessutom bör man inte glömma att kemoterapi som föregår transplantationsinsamlingen kan ha en negativ effekt på benmärgsstamceller.

Förekomsten av allvarliga toxiska komplikationer ökar avsevärt vid allogen benmärgstransplantation. I detta avseende är statistiska data om allogen benmärgstransplantation vid talassemi av intresse. Rapporterna från European Bone Marrow Transplantation Group har registrerat cirka 800 benmärgstransplantationer till patienter med thalassemi major. Allogen transplantation vid talassemi utförs i de allra flesta fall från HLA-identiska syskon, vilket är förknippat med allvarliga komplikationer och hög dödlighet vid transplantation av stamcellsmaterial från delvis kompatibla besläktade eller kompatibla icke-besläktade donatorer. För att minimera risken för dödliga infektiösa komplikationer placeras patienterna i isolerade aseptiska lådor med laminärt luftflöde och får en låg- eller abakteriell kost. För bakteriell dekontaminering av tarmen förskrivs icke-resorberbara former av antibiotika och svampdödande läkemedel per os. För profylax administreras amfotericin B intravenöst. Förebyggande av systemiska infektioner förstärks med amikacin och ceftazidim, som förskrivs dagen före transplantation, och behandlingen fortsätter tills patienten skrivs ut. Alla blodprodukter bestrålas med en dos på 30 Gy före transfusion. Parenteral nutrition under transplantation är ett nödvändigt villkor och börjar omedelbart efter begränsning av matintaget på ett naturligt sätt.

Ett antal komplikationer är förknippade med den höga toxiciteten hos immunsuppressiva läkemedel, vilka ofta orsakar illamående, kräkningar och mukosit, njurskador och interstitiell lunginflammation. En av de allvarligaste komplikationerna vid kemoterapi är veno-ocklusiv leversjukdom, vilket leder till döden tidigt efter transplantationen. Riskfaktorer för trombos i leverns portala vener inkluderar patienternas ålder, förekomst av hepatit och leverfibros, samt immunsuppressiv behandling efter benmärgstransplantation. Veno-ocklusiv sjukdom är särskilt farlig vid talassemi, som åtföljs av leverhemosideros, hepatit och fibros - ofta förekommande följeslagare till transfusionsbehandling. Trombos i leverns portala vener utvecklas 1-2 veckor efter transplantation och kännetecknas av en snabb ökning av halten av bilirubin och transaminasaktivitet i blodet, progression av hepatomegali, ascites, encefalopati och smärta i övre buken. Histologiskt visar obduktionsmaterialet endotelskador, subendotelblödningar, skador på centrilobulära hepatocyter, trombotisk obstruktion av venoler och centrala vener i levern. Fall av dödlig hjärtstillestånd i samband med cytostatikas toxiska effekter har beskrivits hos patienter med talassemi.

Under perioden före transplantation orsakar cyklofosfamid och busulfan ofta toxisk-hemorragisk cystit med patologiska förändringar i uroepitelceller. Användningen av ciklosporin A vid benmärgstransplantation åtföljs ofta av nefro- och neurotoxicitet, hypertonisyndrom, vätskeretention i kroppen och hepatocytcytolys. Sexuell och reproduktiv dysfunktion observeras oftare hos kvinnor. Hos små barn påverkas pubertetsutvecklingen vanligtvis inte efter transplantation, men hos äldre barn kan patologin i utvecklingen av den sexuella sfären vara mycket allvarlig - upp till sterilitet. Komplikationer som är direkt relaterade till själva transplantationen inkluderar avstötning av allogena benmärgsceller, ABO-inkompatibilitet, akuta och kroniska former av graft-versus-host-sjukdom.

Hos patienter med ABO-inkompatibel benmärgstransplantation produceras värd-versus-ABO-donatorisoagglutininer under 330–605 dagar efter transplantationen, vilket kan leda till förlängd hemolys och dramatiskt öka behovet av blodtransfusioner. Denna komplikation förebyggs genom att endast typ 0-röda blodkroppar transfunderas. Efter transplantation upplever vissa patienter autoimmun neutropeni, trombocytopeni eller pancytopeni, vilket kräver splenektomi för att korrigera.

Hos 35–40 % av mottagarna utvecklas akut graft-versus-host-sjukdom inom 100 dagar efter allogen HLA-identisk benmärgstransplantation. Graden av hud-, lever- och tarmpåverkan varierar från utslag, diarré och måttlig hyperbilirubinemi till hudavskalning, tarmobstruktion och akut leversvikt. Hos patienter med talassemi är incidensen av akut graft-versus-host-sjukdom grad I efter benmärgstransplantation 75 %, och grad II och högre är 11–53 %. Kronisk graft-versus-host-sjukdom som ett systemiskt multiorgansyndrom utvecklas vanligtvis inom 100–500 dagar efter allogen benmärgstransplantation hos 30–50 % av patienterna. Hud, munhåla, lever, ögon, matstrupe och övre luftvägar påverkas. Man skiljer mellan en begränsad form av kronisk graft-versus-host-sjukdom, när huden och/eller levern påverkas, och en utbredd form, när generaliserade hudlesioner kombineras med kronisk aggressiv hepatit, lesioner i ögon, spottkörtlar eller något annat organ. Dödsfall orsakas ofta av infektiösa komplikationer till följd av allvarlig immunbrist. Vid talassemi förekommer en mild form av kronisk graft-versus-host-sjukdom hos 12 %, en måttlig form hos 3 % och en allvarlig form hos 0,9 % av mottagarna av allogen HLA-kompatibel benmärg. En allvarlig komplikation vid benmärgstransplantation är transplantatavstötning, som utvecklas 50–130 dagar efter operationen. Frekvensen av avstötning beror på konditioneringsregimen. Särskilt hos patienter med talassemi som endast fick metotrexat under förberedelseperioden observerades avstötning av benmärgstransplantatet i 26 % av fallen, med en kombination av metotrexat och ciklosporin A i 9 % av fallen och med administrering av endast ciklosporin A i 8 % av fallen (Gaziev et al., 1995).

Infektiösa komplikationer efter benmärgstransplantation orsakas av virus, bakterier och svampar. Deras utveckling är förknippad med djup neutropeni inducerad av kemoterapiläkemedel under konditioneringsperioden, skador på slemhinnorna orsakade av cytostatika och graft-versus-host-reaktion. Beroende på utvecklingstidpunkten urskiljs tre faser av infektiösa komplikationer. I den första fasen (utvecklas under den första månaden efter transplantation) dominerar skador på slemhinnorna och neutropeni, ofta åtföljda av virusinfektioner (herpes, Epstein-Barr-virus, cytomegalovirus, Varicella zoster), samt infektioner orsakade av grampositiva och gramnegativa bakterier, Candida-svampar, aspergilli. I den tidiga perioden efter transplantation (den andra och tredje månaden efter transplantation) är den allvarligaste infektionen cytomegalovirus, vilket ofta leder till patienternas död i den andra fasen av infektiösa komplikationer. Vid talassemi utvecklas cytomegalovirusinfektion efter benmärgstransplantation hos 1,7–4,4 % av mottagarna. Den tredje fasen observeras i slutet av perioden efter transplantationen (tre månader efter operationen) och kännetecknas av allvarlig kombinerad immunbrist. Infektioner orsakade av Varicella zoster, streptokocker, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae och hepatotropa virus är vanliga under denna period. Vid talassemi är dödligheten hos patienter efter benmärgstransplantation förknippad med bakteriell och svampdödande sepsis, idiopatisk interstitiell och cytomegaloviruspneumoni, akut andnödssyndrom, akut hjärtsvikt, hjärttamponad, hjärnblödning, veno-ocklusiv leversjukdom och akut graft-versus-host-sjukdom.

För närvarande har vissa framgångar uppnåtts i utvecklingen av metoder för att isolera rena populationer av hematopoetiska stamceller från benmärg. Tekniken för att utvinna fosterblod från navelsträngen har förbättrats, och metoder för att isolera hematopoetiska celler från navelsträngsblod har skapats. Det finns rapporter i vetenskaplig press om att hematopoetiska stamceller kan föröka sig när de odlas i medier med cytokiner. Vid användning av specialdesignade bioreaktorer för expansion av hematopoetiska stamceller ökar biomassan av hematopoetiska stamceller isolerade från benmärg, perifert eller navelsträngsblod avsevärt. Möjligheten att expandera hematopoetiska stamceller är ett viktigt steg mot den kliniska utvecklingen av celltransplantation.

Innan hematopoetiska stamceller kan odlas in vitro är det dock nödvändigt att isolera en homogen population av hematopoetiska stamceller. Detta uppnås vanligtvis med hjälp av markörer som möjliggör selektiv märkning av hematopoetiska stamceller med monoklonala antikroppar kovalent bundna till en fluorescerande eller magnetisk märkning och deras isolering med hjälp av en lämplig cellsorterare. Samtidigt har frågan om fenotypiska egenskaper hos hematopoetiska stamceller inte slutgiltigt lösts. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) betraktar celler med CD34-, AC133- och Tyl-antigener på sin yta och inga CD38-, HLA-DR- eller andra differentieringsmarkörer (celler med CD34+Liir-fenotypen) som kandidater för hematopoetiska stamceller. Linjemarkörer (Lin) inkluderar glykoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Celler med fenotypen CD34+CD45RalüW CD71low, såväl som fenotypen CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, anses lovande för transplantation.

Frågan om antalet hematopoetiska stamceller som är tillräckligt för effektiv transplantation är fortfarande problematisk. För närvarande är källorna till hematopoetiska stamceller benmärg, perifert blod och navelsträngsblod samt embryonal lever. Expansion av hematopoetiska stamceller uppnås genom att odla dem i närvaro av endotelceller och hematopoetiska tillväxtfaktorer. I olika protokoll används myeloproteiner, SCF, erytropoietin, insulinliknande tillväxtfaktorer, kortikosteroider och östrogener för att inducera HSC-proliferation. Vid användning av kombinationer av cytokiner in vitro är det möjligt att uppnå en signifikant ökning av HSC-poolen med en topp i deras produktion i slutet av den andra veckan av odling.

Traditionellt används hematopoetisk stamcellstransplantation från navelsträngsblod huvudsakligen för hemoblastoser. Den lägsta dosen hematopoetiska celler som krävs för framgångsrik transplantation av navelsträngsblod är dock 3,7 x 107 ^{kärnförsedda} celler per 1 kg mottagarens kroppsvikt. Användning av ett mindre antal hematopoetiska stamceller från navelsträngsblod ökar risken för transplantatmisslyckande och återfall av sjukdomen avsevärt. Därför används hematopoetisk stamcellstransplantation från navelsträngsblod huvudsakligen för att behandla hemoblastoser hos barn.

Tyvärr finns det fortfarande inga standarder för anskaffning eller standardiserade protokoll för klinisk användning av hematopoetiska celler från navelsträngsblod. Följaktligen är stamceller från navelsträngsblod i sig inte en juridiskt erkänd källa till hematopoetiska celler för transplantation. Dessutom finns det inga etiska eller juridiska normer som styr verksamheten och organisationen av navelsträngsblodsbanker, vilka finns utomlands. Samtidigt måste alla navelsträngsblodprover övervakas noggrant för säker transplantation. Innan blod tas från en gravid kvinna måste hennes samtycke inhämtas. Varje gravid kvinna måste undersökas för HBsAg-bäreri, förekomst av antikroppar mot hepatit C, HIV och syfilisvirus. Varje navelsträngsblodprov måste testas som standard för antalet kärnförsedda celler, CD34+ och kolonibildande kapacitet. Dessutom utförs HbA1c-typning, bestämning av blodgruppen med ABO och dess tillhörighet med Rh-faktorn. De nödvändiga testprocedurerna är bakteriologisk odling för sterilitet, serologisk testning för HIV-1- och HIV-2-infektioner, HBsAg, viral hepatit C, cytomegalovirusinfektion, HTLY-1 och HTLY-II, syfilis och toxoplasmos. Dessutom utförs polymeraskedjereaktion för att detektera cytomegalovirus- och HIV-infektioner. Det verkar lämpligt att komplettera testprotokollen med en analys av navelsträngsblod GSC för att detektera sådana genetiska sjukdomar som α-thalassemia, sicklecellanemi, adenosindeaminasbrist, Brutons agammaglobulinemi, Hurlers och Ponters sjukdomar.

Nästa steg i förberedelserna för transplantation är frågan om att bevara de hematopoetiska stamcellerna. De farligaste procedurerna för cellernas livskraft under deras framställning är frysning och upptining. Vid frysning av hematopoetiska celler kan en betydande del av dem förstöras på grund av kristallbildning. Speciella ämnen - kryoprotektorer - används för att minska andelen celldöd. Oftast används DMSO som kryoprotektor i en slutkoncentration på 10%. DMSO i en sådan koncentration kännetecknas dock av en direkt cytotoxisk effekt, som manifesterar sig även under förhållanden med minimal exponering. En minskning av den cytotoxiska effekten uppnås genom strikt upprätthållande av nolltemperatur i exponeringsläget, samt genom att följa föreskrifterna för bearbetning av materialet under och efter upptining (hastighet på alla manipulationer, användning av flera tvättprocedurer). DMSO-koncentrationer på mindre än 5% bör inte användas, eftersom detta orsakar massiv död av hematopoetiska celler under frysperioden.

Närvaron av erytrocytföroreningar i suspensionsblandningen av hematopoetiska stamceller skapar en risk för att utveckla en inkompatibilitetsreaktion för erytrocytantigener. Samtidigt, när erytrocyter avlägsnas, ökar förlusten av hematopoetiska celler avsevärt. I detta avseende har en metod för ofraktionerad isolering av hematopoetiska stamceller föreslagits. I detta fall används en 10% DMSO-lösning och konstant kylningshastighet (GS/min) till -80°C för att skydda kärnförsedda celler från de skadliga effekterna av låga temperaturer, varefter cellsuspensionen fryses i flytande kväve. Man tror att denna kryokonserveringsmetod resulterar i partiell lys av erytrocyter, så blodprover behöver inte fraktioneras. Före transplantation tinas cellsuspensionen, tvättas från fritt hemoglobin och DMSO i en lösning av humant albumin eller i blodserum. Konserveringen av hematopoetiska prekursorer med denna metod är visserligen högre än efter fraktionering av navelsträngsblod, men risken för transfusionskomplikationer på grund av transfusion av ABO-inkompatibla erytrocyter kvarstår.

Inrättandet av ett banksystem för lagring av HLA-testade och typade HSC-prover skulle kunna lösa ovanstående problem. Detta kräver dock utveckling av etiska och juridiska normer, vilka för närvarande bara diskuteras. Innan ett banknätverk skapas är det nödvändigt att anta ett antal regler och dokument om standardisering av procedurer för insamling, fraktionering, testning och typning, samt kryokonservering av HSC. Ett obligatoriskt villkor för effektiv drift av HSC-banker är organisationen av en datorbas för interaktion med registren för World Marrow Donor Association (WMDA) och National Marrow Donor Program of the United States (NMDP).

Dessutom är det nödvändigt att optimera och standardisera metoderna för in vitro-expansion av HSC, främst hematopoetiska celler från navelsträngsblod. Expansion av HSC från navelsträngsblod är nödvändig för att öka antalet potentiella mottagare som är kompatibla med HLA-systemet. På grund av de små volymerna navelsträngsblod är antalet HSC:er i det vanligtvis inte tillräckligt för att säkerställa benmärgsrepopulation hos vuxna patienter. Samtidigt är det nödvändigt att ha tillgång till ett tillräckligt antal typade HSC-prover (från 10 000 till 1 500 000 per mottagare) för att utföra orelaterade transplantationer.

Transplantation av hematopoetiska stamceller eliminerar inte de komplikationer som följer med benmärgstransplantation. Analys visar att vid transplantation av navelsträngsblodstamceller utvecklas allvarliga former av akut graft-versus-host-sjukdom hos 23 % av mottagarna och kroniska former hos 25 % av mottagarna. Hos onkohematologiska patienter observeras återfall av akut leukemi under det första året efter transplantation av navelsträngsblodstamceller i 26 % av fallen.

Under senare år har metoder för transplantation av perifera hematopoetiska stamceller utvecklats intensivt. Halten av HSC i perifert blod är så liten (1 HSC per 100 000 blodkroppar) att det inte är meningsfullt att isolera dem utan särskild förberedelse. Därför ges givaren först en läkemedelsstimulerande behandling för att frisätta hematopoetiska celler från benmärgen till blodet. För detta ändamål används så långt ifrån ofarliga läkemedel som cyklofosfamid och granulocytkolonistimulerande faktor. Men även efter proceduren för mobilisering av HSC till perifert blod överstiger inte halten av CD34+ celler i den 1,6 %.

För mobilisering av hematopoetiska stamceller i kliniken används oftast S-SEC, vilket kännetecknas av relativt god tolerans, med undantag för den nästan naturliga förekomsten av bensmärta. Det bör noteras att användningen av moderna blodseparatorer möjliggör effektiv isolering av hematopoetiska stamceller. Under normala hematopoiesförhållanden måste dock minst 6 procedurer utföras för att erhålla ett tillräckligt antal hematopoetiska stamceller som är jämförbara i repopulationskapacitet med benmärgssuspension. Varje sådan procedur kräver att 10-12 liter blod bearbetas på separatorn, vilket kan orsaka trombocytopeni och leukopeni. Separationsproceduren innebär att ett antikoagulant (natriumcitrat) administreras till givaren, vilket dock inte utesluter kontaktaktivering av trombocyter under extrakorporeal centrifugering. Dessa faktorer skapar förutsättningar för utveckling av infektiösa och hemorragiska komplikationer. En annan nackdel med metoden är den betydande variationen i mobiliseringsresponsen, vilket kräver övervakning av innehållet av HSC:er i donatorernas perifera blod, vilket är nödvändigt för att bestämma deras maximala nivå.

Autogen transplantation av hematopoetiska stamceller, till skillnad från allogen transplantation, eliminerar helt utvecklingen av avstötningsreaktioner. En betydande nackdel med autotransplantation av hematopoetiska stamceller, som begränsar indikationerna för dess implementering, är dock den höga sannolikheten för återinfusion av leukemiska klonceller med transplantatet. Dessutom ökar avsaknaden av den immunmedierade "graft versus tumör"-effekten avsevärt frekvensen av återfall av malign blodsjukdom. Därför förblir den enda radikala metoden för att eliminera neoplastisk klonal hematopoes och återställa normal polyklonal hematopoes vid myelodysplastiska syndrom intensiv polykemoterapi med transplantation av allogen hematopoes.

Men även i detta fall syftar behandlingen för de flesta hemoblastoser endast till att öka patienternas överlevnadstid och förbättra deras livskvalitet. Enligt flera stora studier uppnås långsiktig återfallsfri överlevnad efter allotransplantation av HSC hos 40 % av onkohematologiska patienter. Vid användning av stamceller från ett HLA-kompatibelt syskon observeras de bästa resultaten hos unga patienter med kort sjukdomshistoria, ett blastcellsantal på upp till 10 % och gynnsam cytogenetik. Tyvärr är dödligheten i samband med allotransplantation av HSC hos patienter med myelodysplastiska sjukdomar fortfarande hög (i de flesta rapporter - cirka 40 %). Resultaten av 10-årigt arbete inom National Bone Marrow Donor Program i USA (510 patienter, medianålder - 38 år) indikerar att den återfallsfria överlevnaden under två år är 29 % med en relativt låg sannolikhet för återfall (14 %). Dödligheten i samband med allotransplantation av HSC:er från en icke-besläktad donator är dock extremt hög och når 54 % under en tvåårsperiod. Liknande resultat erhölls i en europeisk studie (118 patienter, medianålder - 24 år, tvåårig återfallsfri överlevnad - 28 %, återfall - 35 %, dödlighet - 58 %).

Under intensiva kemoterapikurer med efterföljande återställande av hematopoesen med allogena hematopoetiska celler uppstår ofta immunohematologiska och transfusionskomplikationer. De beror till stor del på att mänskliga blodgrupper ärvs oberoende av MHC-molekyler. Därför, även om donator och mottagare är kompatibla med de huvudsakliga HLA-antigenerna, kan deras erytrocyter ha olika fenotyper. Man skiljer mellan "större" inkompatibilitet, när mottagaren har redan existerande antikroppar mot donatorns erytrocytantigener, och "mindre" inkompatibilitet, när donatorn har antikroppar mot mottagarens erytrocytantigener. Fall av en kombination av "större" och "mindre" inkompatibilitet är möjliga.

Resultaten av en jämförande analys av den kliniska effektiviteten av allotransplantation av hematopoetiska stamceller från benmärg och navelsträngsblod vid hemoblastoser indikerar att hos barn efter allotransplantation av hematopoetiska stamceller från navelsträngsblod minskar risken för att utveckla en graft-versus-host-reaktion signifikant, men en längre återhämtningsperiod för antalet neutrofiler och trombocyter observeras med en högre incidens av mortalitet 100 dagar efter transplantation.

Studien av orsakerna till tidig dödlighet gjorde det möjligt att klargöra kontraindikationerna för allogen HSC-transplantation, bland vilka de viktigaste är:

• förekomst av positiva tester för cytomegalovirusinfektion hos mottagaren eller donatorn (utan förebyggande behandling);
• akut strålsjuka;
• förekomst eller till och med misstanke om förekomst av en svampinfektion hos en patient (utan att utföra systemisk tidig profylax med svampdödande läkemedel);
• hemoblastoser, där patienterna fick långtidsbehandling med cytostatika (på grund av den höga sannolikheten för plötsligt hjärtstillestånd och multiorgansvikt);
• transplantation från HLA-icke-identiska donatorer (utan profylax av akut graft-versus-host-reaktion med ciklosporin A);
• kronisk viral hepatit C (på grund av den höga risken att utveckla veno-ocklusiv leversjukdom).

Transplantation av leverceller med leversvikt kan således orsaka allvarliga komplikationer, som ofta leder till döden. I den tidiga perioden (upp till 100 dagar efter transplantation) inkluderar dessa infektiösa komplikationer, akut graft-versus-host-sjukdom, transplantatavstötning (misslyckande med donerade HSC:er), veno-ocklusiv leversjukdom, samt vävnadsskador orsakade av toxiciteten hos konditioneringsregimen, vilken kännetecknas av en hög ombyggnadshastighet (hud, vaskulärt endotel, tarmepitel). Komplikationer i den sena perioden efter transplantation inkluderar kronisk graft-versus-host-sjukdom, återfall av den underliggande sjukdomen, tillväxthämning hos barn, dysfunktion i reproduktionssystemet och sköldkörteln samt ögonskador.

Nyligen, i samband med publikationer om benmärgscellers plasticitet, har idén att använda HSC:er för att behandla hjärtinfarkter och andra sjukdomar uppstått. Även om vissa djurförsök stöder denna möjlighet, behöver slutsatserna om benmärgscellers plasticitet bekräftas. Denna omständighet bör beaktas av de forskare som tror att transplanterade mänskliga benmärgsceller lätt omvandlas till skelettmuskulatur, hjärtmuskelceller eller CNS-celler. Hypotesen att HSC:er är en naturlig cellulär källa för regenerering av dessa organ kräver seriösa bevis.

I synnerhet har de första resultaten publicerats från en öppen randomiserad studie av V. Belenkov (2003). Syftet var att studera effekten av C-SvK (dvs. mobilisering av autologa HSC:er i blodet) på den kliniska, hemodynamiska och neurohumorala statusen hos patienter med måttlig till svår kronisk hjärtsvikt, samt att utvärdera dess säkerhet mot bakgrund av standardbehandling (ACE-hämmare, betablockerare, diuretika, hjärtglykosider). I den första publiceringen av studieresultaten noterar programmets författare att det enda argumentet till förmån för O-SvK är resultaten av behandling av en patient, som visade en obestridlig förbättring av alla kliniska och hemodynamiska parametrar mot bakgrund av behandling med detta läkemedel. Teorin om HSC-mobilisering i blodomloppet med efterföljande myokardiell regenerering i postinfarktzonen bekräftades dock inte - även hos en patient med positiv klinisk dynamik avslöjade stressekokardiografi med dobutamin inte uppkomsten av zoner med livskraftigt myokardium i ärrområdet.

Det bör noteras att det för närvarande finns uppenbarligen otillräckliga data för att rekommendera ersättningscellterapi för utbredd implementering i den dagliga kliniska praxisen. Väl utformade och högkvalitativa kliniska studier behövs för att fastställa effektiviteten hos olika alternativ för regenerativ cellterapi, utveckla indikationer och kontraindikationer för den, samt riktlinjer för kombinerad användning av regenerativ-plastisk terapi och traditionell kirurgisk eller konservativ behandling. Det finns fortfarande inget svar på frågan om vilken specifik population av benmärgsceller (stam-hematopoetiska eller stromala) som kan ge upphov till neuroner och kardiomyocyter, och det är också oklart vilka förhållanden som bidrar till detta in vivo.

Arbete inom dessa områden bedrivs i många länder. I sammanfattningen av symposiet om akut leversvikt vid National Institutes of Health i USA nämns bland de lovande behandlingsmetoderna, tillsammans med levertransplantation, transplantation av xeno- eller allogena hepatocyter och extrakorporeal koppling av bioreaktorer till leverceller. Det finns direkta bevis för att endast främmande funktionellt aktiva hepatocyter kan ge effektivt stöd till mottagarens lever. För klinisk användning av isolerade hepatocyter är det nödvändigt att skapa en cellbank, vilket avsevärt minskar tiden mellan isolering av celler och deras användning. Den mest acceptabla metoden för att skapa en bank av isolerade hepatocyter är kryokonservering av leverceller i flytande kväve. Vid användning av sådana celler i kliniken hos patienter med akut och kronisk leversvikt har en ganska hög terapeutisk effekt visats.

Trots de optimistiska och uppmuntrande resultaten av levercellstransplantation i experiment och klinisk praxis finns det fortfarande många problem som är långt ifrån lösta. Dessa inkluderar ett begränsat antal organ som är lämpliga för att erhålla isolerade hepatocyter, otillräckligt effektiva metoder för deras isolering, avsaknaden av standardiserade metoder för att bevara leverceller, oklara idéer om mekanismerna för tillväxt- och proliferationsreglering av transplanterade celler, avsaknaden av adekvata metoder för att bedöma inympning eller avstötning av allogena hepatocyter. Detta inkluderar även förekomsten av transplantationsimmunitet vid användning av allogena och xenogena celler, om än mindre än vid ortotopisk levertransplantation, men som kräver användning av immunsuppressiva medel, inkapsling av isolerade hepatocyter eller deras speciella behandling med enzymer. Hepatocyttransplantation leder ofta till en immunkonflikt mellan mottagaren och givaren i form av en avstötningsreaktion, vilket kräver användning av cytostatika. En lösning på detta problem kan vara användningen av polymera mikroporösa bärare för att isolera leverceller, vilket kommer att förbättra deras överlevnad, eftersom kapselmembranet effektivt skyddar hepatocyter trots immunisering av värden.

Vid akut leversvikt är dock sådan hepatocyttransplantation ineffektiv på grund av den relativt långa tid som krävs för leverceller att inplanteras i en ny miljö och nå optimal funktion. En potentiell begränsning är utsöndringen av galla under ektopisk transplantation av isolerade hepatocyter, och vid användning av bioreaktorer är en betydande fysiologisk barriär artmissmatchningen mellan humana proteiner och de proteiner som produceras av xenogena hepatocyter.

Det finns rapporter i litteraturen att lokal transplantation av stromala stamceller från benmärg underlättar effektiv korrigering av bendefekter, och att benvävnadsåterställningen i detta fall sker mer intensivt än vid spontan reparativ regenerering. Flera prekliniska studier på experimentella modeller visar övertygande möjligheten att använda stromala celltransplantationer från benmärg inom ortopedi, även om ytterligare arbete behövs för att optimera dessa metoder, även i de enklaste fallen. I synnerhet har optimala förhållanden för expansion av osteogena stromala celler ex vivo ännu inte hittats, och strukturen och sammansättningen av deras ideala bärare (matrix) förblir outvecklad. Det minsta antalet celler som krävs för volumetrisk benregenerering har inte fastställts.

Det har bevisats att mesenkymala stamceller uppvisar transgermal plasticitet, dvs. förmågan att differentiera till celltyper som fenotypiskt är orelaterade till cellerna i den ursprungliga linjen. Under optimala odlingsförhållanden kan polyklonala stromala stamcellslinjer från benmärg motstå mer än 50 delningar in vitro, vilket gör det möjligt att erhålla miljarder stromala celler från 1 ml benmärgsaspirat. Populationen av mesenkymala stamceller är dock heterogen, vilket manifesteras av både variation i kolonistorlekar, olika bildningshastigheter och morfologisk mångfald av celltyper, från fibroblastliknande spindelformade till stora platta celler. Fenotypisk heterogenitet observeras efter bara 3 veckors stromal stamcellsodling: vissa kolonier bildar noduler av benvävnad, andra bildar kluster av adipocyter och andra, mer sällsynta, bildar öar av broskvävnad.

Transplantation av embryonal nervvävnad användes initialt för att behandla degenerativa sjukdomar i centrala nervsystemet. På senare år har cellulära element från neurosfärer erhållna från neurala stamceller transplanterats istället för embryonal hjärnvävnad (Poltavtseva, 2001). Neurosfärer innehåller dedikerade prekursorer till neuroner och neuroglia, vilket ger hopp om återställande av förlorade hjärnfunktioner efter deras transplantation. Efter transplantation av dispergerade neurosfärceller till striatumregionen i råtthjärnan noterades deras proliferation och differentiering till dopaminerga neuroner, vilket eliminerade motorisk asymmetri hos råttor med experimentell hemiparkinsonism. I vissa fall utvecklades dock tumörer från neurosfärceller, vilket ledde till djurens död (Björklund, 2002).

I kliniken gav noggranna studier av två patientgrupper, där varken patienterna eller de läkare som observerade dem visste (dubbelblind studie), att en grupp patienter transplanterades med embryonal vävnad med neuroner som producerar dopamin, och den andra patientgruppen genomgick en skenoperation, oväntade resultat. Patienter som transplanterades med embryonal nervvävnad mådde inte bättre än patienterna i kontrollgruppen. Dessutom utvecklade 5 av 33 patienter ihållande dyskinesi 2 år efter transplantation av embryonal nervvävnad, vilket inte fanns hos patienterna i kontrollgruppen (Stamceller: vetenskapliga framsteg och framtida forskningsriktningar. Nat. Inst, of Health. USA). Ett av de olösta problemen med klinisk forskning om neurala stamceller i hjärnan är fortfarande analysen av de verkliga utsikterna och begränsningarna för transplantation av deras derivat för korrigering av CNS-störningar. Det är möjligt att neuronogenes i hippocampus inducerad av långvarig anfallsaktivitet, vilket leder till dess strukturella och funktionella omorganisation, kan vara en faktor i den progressiva utvecklingen av epilepsi. Denna slutsats förtjänar särskild uppmärksamhet, eftersom den pekar på möjliga negativa konsekvenser av genereringen av nya neuroner i den mogna hjärnan och bildandet av avvikande synaptiska kopplingar av dem.

Man bör inte glömma att odling i medier med cytokiner (mitogener) gör att stamcellernas egenskaper närmare tumörcellernas, eftersom liknande förändringar i regleringen av cellcykler sker i dem, vilket avgör förmågan till obegränsad delning. Det är vårdslöst att transplantera tidiga derivat av embryonala stamceller till en person, eftersom risken för att utveckla maligna neoplasmer i detta fall är mycket hög. Det är mycket säkrare att använda deras mer engagerade avkomma, det vill säga prekursorceller från differentierade linjer. För närvarande har dock ingen tillförlitlig teknik för att erhålla stabila linjer av mänskliga celler som differentierar i önskad riktning ännu utvecklats.

Användningen av molekylärbiologiska tekniker för att korrigera ärftlig patologi och mänskliga sjukdomar genom att modifiera stamceller är av stort intresse för praktisk medicin. Stamcellsgenomets egenskaper gör det möjligt att utveckla unika transplantationsscheman för att korrigera genetiska sjukdomar. Det finns dock ett antal begränsningar inom detta område som måste övervinnas innan den praktiska tillämpningen av stamcellsgenteknik kan tillämpas. Först och främst är det nödvändigt att optimera processen för ex vivo-modifiering av stamcellers genom. Det är känt att långvarig (3-4 veckor) proliferation av stamceller minskar deras transfektion, så flera transfektionscykler är nödvändiga för att uppnå en hög nivå av deras genetiska modifiering. Det största problemet är dock förknippat med varaktigheten av terapeutiskt genuttryck. Hittills har ingen studie överskridit perioden för effektivt uttryck efter transplantation av modifierade celler i någon studie överstigit fyra månader. I 100 % av fallen minskar uttrycket av transfekterade gener över tid på grund av inaktivering av promotorer och/eller död hos celler med ett modifierat genom.

En viktig fråga är kostnaden för att använda cellteknik inom medicin. Till exempel är det uppskattade årliga behovet av att endast finansiera de medicinska kostnaderna för en benmärgstransplantationsenhet som är utformad för att utföra 50 transplantationer per år cirka 900 000 USD.

Utvecklingen av cellteknologier inom klinisk medicin är en komplex och flerstegsprocess som involverar konstruktivt samarbete mellan tvärvetenskapliga vetenskapliga och kliniska centra och det internationella samfundet. Samtidigt kräver frågor om vetenskaplig organisation av forskning inom cellterapiområdet särskild uppmärksamhet. De viktigaste av dessa är utvecklingen av kliniska forskningsprotokoll, kontroll över tillförlitligheten hos kliniska data, bildandet av ett nationellt studieregister, integration i internationella program för multicenter kliniska studier och implementering av resultat i klinisk praxis.

Avslutningsvis i inledningen till celltransplantationsproblemen vill jag uttrycka förhoppningen att enandet av ledande ukrainska specialisters insatser från olika vetenskapsområden kommer att säkerställa betydande framsteg inom experimentell och klinisk forskning och göra det möjligt att under de kommande åren hitta effektiva sätt att ge stöd till allvarligt sjuka personer i behov av organ-, vävnads- och celltransplantation.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]