Artificiella hjärtklaffar

Moderna biologiska artificiella hjärtklaffar som är tillgängliga för klinisk användning, med undantag för pulmonellt autograft, är icke-viabla strukturer som saknar potential för tillväxt och vävnadsreparation. Detta medför betydande begränsningar för deras användning, särskilt hos barn, för korrigering av klaffpatologi. Vävnadsteknik har utvecklats under de senaste 15 åren. Målet med denna vetenskapliga inriktning är att under artificiella förhållanden skapa strukturer som artificiella hjärtklaffar med en trombosresistent yta och viabelt interstitium.

[ 1 ], [ 2 ]

Hur utvecklas artificiella hjärtklaffar?

Det vetenskapliga konceptet vävnadsteknik bygger på idén att befolka och odla levande celler (fibroblaster, stamceller etc.) i en syntetisk eller naturlig absorberbar struktur (matrix), som är en tredimensionell klaffstruktur, samt användningen av signaler som reglerar genuttryck, organisation och produktivitet hos transplanterade celler under perioden då den extracellulära matrixen bildas.

Sådana artificiella hjärtklaffar integreras med patientens vävnad för slutgiltig återställning och vidare upprätthållande av deras struktur och funktion. I detta fall bildas ett nytt kollagen-elastin-ramverk eller, mer exakt, en extracellulär matrix på den ursprungliga matrisen som ett resultat av cellernas funktion (fibroblaster, myofibroblaster, etc.). Som ett resultat bör optimala artificiella hjärtklaffar som skapats genom vävnadsteknik ligga nära de ursprungliga vad gäller anatomisk struktur och funktion, och även ha biomekanisk anpassningsförmåga, förmåga till reparation och tillväxt.

Vävnadsteknik utvecklar konstgjorda hjärtklaffar med hjälp av olika källor för cellinsamling. Således kan xenogena eller allogena celler användas, även om de förra är förknippade med risken för överföring av zoonoser till människor. Det är möjligt att minska antigeniciteten och förhindra kroppens avstötningsreaktioner genom genetisk modifiering av allogena celler. Vävnadsteknik kräver en pålitlig cellkälla. En sådan källa är autogena celler som tas direkt från patienten och som inte producerar immunreaktioner under reimplantation. Effektiva konstgjorda hjärtklaffar produceras på basis av autologa celler erhållna från blodkärl (artärer och vener). En metod baserad på användning av fluorescensaktiverad cellsortering - FACS har utvecklats för att erhålla rena cellkulturer. En blandad cellpopulation erhållen från ett blodkärl märks med en acetylerad, lågdensitetslipoproteinmarkör, som selektivt absorberas på ytan av endotelocyter. Endotelcellerna kan sedan lätt separeras från huvuddelen av cellerna som erhålls från kärlen, som kommer att vara en blandning av glatta muskelceller, myofibroblaster och fibroblaster. Cellernas ursprung, oavsett om det är artär eller ven, kommer att påverka egenskaperna hos den slutliga konstruktionen. Således är konstgjorda hjärtklaffar med en matrix insådd med venösa celler överlägsna i kollagenbildning och mekanisk stabilitet jämfört med konstruktioner insådda med arteriella celler. Valet av perifera vener verkar vara en mer bekväm källa för cellinsamling.

Myofibroblaster kan också utvinnas från halspulsådern. Kärlceller har dock signifikant olika egenskaper än naturliga interstitiella celler. Autologa navelsträngsceller kan användas som en alternativ cellkälla.

Konstgjorda hjärtklaffar baserade på stamceller

Under senare år har framsteg inom vävnadsteknik underlättats av stamcellsforskning. Användningen av röda benmärgsstamceller har sina fördelar. I synnerhet gör enkelheten i biomaterialinsamling och in vitro-odling med efterföljande differentiering till olika typer av mesenkymala celler att man undviker användningen av intakta kärl. Stamceller är pluripotenta källor till celllinjer och har unika immunologiska egenskaper som bidrar till deras stabilitet under allogena förhållanden.

Mänskliga röda benmärgsstamceller erhålls genom sternumpunktion eller höftkammspunktion. De isoleras från 10-15 ml sternumaspirat, separeras från andra celler och odlas. När det erforderliga antalet celler uppnåtts (vanligtvis inom 21-28 dagar) sås (koloniseras) de på matriser och odlas i ett näringsmedium i statisk position (i 7 dagar i en fuktad inkubator vid 37 °C i närvaro av 5 % CO2). Därefter stimuleras celltillväxten genom det kuturala mediet (biologiska stimuli) eller genom att skapa fysiologiska förhållanden för vävnadstillväxt under dess isometriska deformation i en reproduktionsapparat med ett pulserande flöde - en bioreaktor (mekaniska stimuli). Fibroblaster är känsliga för mekaniska stimuli som främjar deras tillväxt och funktionella aktivitet. Det pulserande flödet orsakar en ökning av både radiella och cirkumferentiella deformationer, vilket leder till orientering (förlängning) av de befolkade cellerna i riktning mot sådana påfrestningar. Detta leder i sin tur till bildandet av orienterade fibrösa strukturer i klaffarna. Ett konstant flöde orsakar endast tangentiella påfrestningar på väggarna. Det pulserande flödet har en gynnsam effekt på cellmorfologi, proliferation och den extracellulära matrisens sammansättning. Näringsflödets natur, fysikalisk-kemiska förhållanden (pH, pO2 och pCO2) i bioreaktorn påverkar också kollagenproduktionen avsevärt. Således ökar laminärt flöde och cykliska virvelströmmar kollagenproduktionen, vilket leder till förbättrade mekaniska egenskaper.

Ett annat tillvägagångssätt för att odla vävnadsstrukturer är att skapa embryonala förhållanden i en bioreaktor istället för att simulera fysiologiska förhållanden i människokroppen. Vävnadsbioklaffar som odlats på basis av stamceller har mobila och flexibla klaffar, funktionellt kapabla under påverkan av högt tryck och flöde som överstiger den fysiologiska nivån. Histologiska och histokemiska studier av klaffar i dessa strukturer visade närvaron av aktiva processer för matrixbiodestruktion och dess ersättning med livskraftig vävnad. Vävnaden är organiserad enligt den skiktade typen med egenskaper hos extracellulära matrixproteiner som liknar dem hos nativ vävnad, närvaron av kollagen typ I och III och glykosaminoglykaner. Emellertid erhölls inte den typiska treskiktsstrukturen hos klaffar - ventrikulära, svampiga och fibrösa lager -. ASMA-positiva celler som uttrycker vimentin som hittades i alla fragment hade egenskaper som liknar dem hos myofibroblaster. Elektronmikroskopi avslöjade cellulära element med egenskaper som är karakteristiska för livskraftiga, sekretoriska aktiva myofibroblaster (aktin/myosinfilament, kollagentrådar, elastin) och endotelceller på vävnadsytan.

Kollagen av typ I, III, ASMA och vimentin detekterades på klaffarna. De mekaniska egenskaperna hos vävnadens och de naturliga strukturernas klaffar var jämförbara. Konstgjorda hjärtklaffar i vävnad visade utmärkt prestanda under 20 veckor och liknade naturliga anatomiska strukturer i sin mikrostruktur, biokemiska profil och proteinmatrixbildning.

Alla artificiella hjärtklaffar som erhållits genom vävnadsteknik implanterades i djur i pulmonell position, eftersom deras mekaniska egenskaper inte motsvarar belastningarna i aortapositionen. Vävnadsklaffarna som explanterats från djur har en struktur som liknar nativa klaffar, vilket indikerar deras vidare utveckling och omstrukturering in vivo. Huruvida processen för vävnadsomstrukturering och mognad kommer att fortsätta under fysiologiska förhållanden efter att de artificiella hjärtklaffarna har implanterats, vilket observerades i djurförsök, kommer att visa sig genom ytterligare studier.

Ideala konstgjorda hjärtklaffar bör ha en porositet på minst 90 %, eftersom detta är avgörande för celltillväxt, näringstillförsel och borttagning av cellulära metaboliska produkter. Förutom biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet bör konstgjorda hjärtklaffar ha en kemiskt gynnsam yta för cellsådd och matcha de mekaniska egenskaperna hos naturlig vävnad. Nivån av biologisk nedbrytning av matrixen bör vara kontrollerbar och proportionell mot nivån av ny vävnadsbildning för att säkerställa mekanisk stabilitet över tid.

För närvarande utvecklas syntetiska och biologiska matriser. De vanligaste biologiska materialen för att skapa matriser är donatoranatomiska strukturer, kollagen och fibrin. Polymerkonstgjorda hjärtklaffar utformas för att biologiskt brytas ner efter implantation, när de implanterade cellerna börjar producera och organisera sitt eget extracellulära matrixnätverk. Bildandet av ny matrixvävnad kan regleras eller stimuleras av tillväxtfaktorer, cytokiner eller hormoner.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Konstgjorda hjärtklaffar från donatorer

Konstgjorda hjärtklaffar från donatorer, erhållna från människor eller djur och uttömda på cellulära antigener genom decellularisering för att minska deras immunogenicitet, kan användas som matriser. De konserverade proteinerna i den extracellulära matrisen utgör basen för efterföljande vidhäftning av ympade celler. Följande metoder för att avlägsna cellulära element (acellularisering) finns: frysning, behandling med trypsin/EDTA, detergenter - natriumdodecylsulfat, natriumdeoxikolat, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, samt enzymatiska behandlingsmetoder i flera steg. I detta fall avlägsnas cellmembran, nukleinsyror, lipider, cytoplasmatiska strukturer och lösliga matrismolekyler samtidigt som kollagen och elastin bevaras. Emellertid har en ideal metod ännu inte hittats. Endast natriumdodecylsulfat (0,03-1 %) eller natriumdeoxikolat (0,5-2 %) resulterade i fullständigt cellborttagning efter 24 timmars behandling.

Histologisk undersökning av borttagna decellulariserade bioklaffar (allograft och xenograft) i ett djurförsök (hund och gris) visade partiell endotelisering och inväxt av mottagarmyofibroblaster i basen, utan tecken på förkalkning. Måttlig inflammatorisk infiltration noterades. Emellertid utvecklades tidigt klaffsvikt under kliniska prövningar av den decellulariserade SynerGraftTM-klaffen. En uttalad inflammatorisk reaktion detekterades i bioprotesmatrisen, vilken initialt var ospecifik och åtföljdes av en lymfocytisk reaktion. Dysfunktion och degeneration av bioprotesen utvecklades under loppet av ett år. Ingen cellkolonisering av matrisen noterades, men förkalkning av klaffarna och preimplantationscellrester detekterades.

Cellfria matriser sådda med endotelceller och odlade in vitro och in vivo bildade ett koherent lager på klaffarnas yta, och sådda interstitiella celler med nativ struktur visade sin förmåga att differentiera. Det var dock inte möjligt att uppnå den erforderliga fysiologiska nivån av cellkolonisering på matrisen under dynamiska förhållanden i bioreaktorn, och de implanterade artificiella hjärtklaffarna åtföljdes av en ganska snabb (tre månader) förtjockning på grund av accelererad cellproliferation och bildning av en extracellulär matris. Således har användningen av donatorcellfria matriser för deras kolonisering med celler i detta skede ett antal olösta problem, inklusive immunologiska och infektiösa; arbetet med decellulariserade bioproteser fortsätter.

Det bör noteras att kollagen också är ett av de potentiella biologiska materialen för produktion av matriser som kan brytas ner biologiskt. Det kan användas i form av skum, gel eller plattor, svampar och som ett fiberbaserat ämne. Användningen av kollagen är dock förknippad med ett antal tekniska svårigheter. I synnerhet är det svårt att få ut det från en patient. Därför är de flesta kollagenmatriser för närvarande av animaliskt ursprung. Långsam biologisk nedbrytning av animaliskt kollagen kan medföra en ökad risk för infektion med zoonoser och orsaka immunologiska och inflammatoriska reaktioner.

Fibrin är ett annat biologiskt material med kontrollerad biologisk nedbrytning. Eftersom fibringeler kan framställas från patientens blod för efterföljande produktion av en autolog matrix, kommer implantation av en sådan struktur inte att orsaka dess toxiska nedbrytning och inflammatoriska reaktion. Fibrin har dock nackdelar som diffusion och urlakning till miljön samt låga mekaniska egenskaper.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Konstgjorda hjärtklaffar av syntetiska material

Konstgjorda hjärtklaffar tillverkas också av syntetiska material. Flera försök att tillverka klaffmatriser baserades på användningen av polyglaktin, polyglykolsyra (PGA), polymjölksyra (PLA), PGA- och PLA-sampolymer (PLGA) och polyhydroxialkanoater (PHA). Mycket poröst syntetiskt material kan erhållas från flätad eller icke-flätad fiber och med hjälp av saltlakningsteknik. Ett lovande kompositmaterial (PGA/P4HB) för tillverkning av matriser erhålls från icke-flätade öglor av polyglykolsyra (PGA) belagda med poly-4-hydroxibutyrat (P4HB). Konstgjorda hjärtklaffar tillverkade av detta material steriliseras med etylenoxid. Emellertid kräver den betydande initiala styvheten och tjockleken hos öglorna i dessa polymerer, deras snabba och okontrollerade nedbrytning, åtföljd av frisättning av sura cytotoxiska produkter, ytterligare forskning och en sökning efter andra material.

Användningen av autologa myofibroblastvävnadsodlingsplattor odlade på en scaffold för att bilda stödmatriser genom att stimulera produktionen av dessa celler har gjort det möjligt att erhålla klaffprover med aktiva livskraftiga celler omgivna av en extracellulär matrix. Emellertid är de mekaniska egenskaperna hos vävnaderna i dessa klaffar fortfarande otillräckliga för deras implantation.

Den erforderliga nivån av proliferation och vävnadsregenerering av den klaff som skapas kan eventuellt inte uppnås genom att enbart kombinera celler och matrix. Cellgenuttryck och vävnadsbildning kan regleras eller stimuleras genom att tillsätta tillväxtfaktorer, cytokiner eller hormoner, mitogena faktorer eller adhesionsfaktorer till matriser och scaffolds. Möjligheten att introducera dessa regulatorer i matrisbiomaterial studeras. Sammantaget saknas det en betydande forskning om reglering av vävnadsklaffbildning genom biokemiska stimuli.

Den acellulära xenogena lungbioprotesen från svin, Matrix P, består av decellulariserad vävnad som bearbetats med en speciell patenterad procedur från AutoTissue GmbH, inklusive behandling med antibiotika, natriumdeoxikolat och alkohol. Denna bearbetningsmetod, godkänd av International Organization for Standardization, eliminerar alla levande celler och postcellulära strukturer (fibroblaster, endotelceller, bakterier, virus, svampar, mykoplasma), bevarar arkitekturen hos den extracellulära matrisen, reducerar nivån av DNA och RNA i vävnaderna till ett minimum, vilket minskar sannolikheten för överföring av det porcina endogena retroviruset (PERV) till människor till noll. Matrix P-bioprotesen består uteslutande av kollagen och elastin med bevarad strukturell integration.

I fårförsök registrerades minimal reaktion från omgivande vävnader 11 månader efter implantation av Matrix P-bioprotesen med god överlevnad, vilket var särskilt tydligt i den blanka insidan av dess endokardium. Inflammatoriska reaktioner, förtjockning och förkortning av klaffbladen var praktiskt taget obefintliga. Låga kalciumnivåer i vävnaden i Matrix P-bioprotesen registrerades också, skillnaden var statistiskt signifikant jämfört med de som behandlades med glutaraldehyd.

Matrix P-konstgjorda hjärtklaffen anpassar sig till den individuella patientens tillstånd inom några månader efter implantationen. Undersökningen i slutet av kontrollperioden avslöjade en intakt extracellulär matrix och konfluent endotel. Matrix R-xenograftet som implanterades hos 50 patienter med medfödda defekter under Ross-proceduren mellan 2002 och 2004 visade överlägsen prestanda och lägre transvalvulära tryckgradienter jämfört med kryokonserverade och decellulariserade SynerGraftMT-allografter och glutaraldehydbehandlade scaffoldlösa bioproteser. Konstgjorda hjärtklaffar Matrix P är avsedda för pulmonell klaffbyte under rekonstruktion av höger kammares utflödeskanal vid kirurgi för medfödda och förvärvade defekter och under pulmonell klaffbyte under Ross-proceduren. De finns i fyra storlekar (efter inre diameter): för nyfödda (15–17 mm), för barn (18–21 mm), intermediär (22–24 mm) och vuxen (25–28 mm).

Framstegen i utvecklingen av vävnadsmodifierade klaffar kommer att bero på framsteg inom klaffcellbiologi (inklusive frågor om genuttryck och reglering), studier av embryogen och åldersrelaterad klaffutveckling (inklusive angiogena och neurogena faktorer), exakt kunskap om biomekaniken hos varje klaff, identifiering av lämpliga celler för sådd och utveckling av optimala matriser. Vidareutveckling av mer avancerade vävnadsklaffar kommer att kräva en grundlig förståelse av förhållandet mellan de mekaniska och strukturella egenskaperna hos nativa klaffar och de stimuli (biologiska och mekaniska) som krävs för att återskapa dessa egenskaper in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]