Analys av restriktionsfragmentlängdspolymorfism

Den vida användningen av olika restriktionsendonukleaser för analysen av kromosomalt DNA avslöjade en stor variabilitet i det humana genomet. Även små förändringar i de kodande och reglerande regionerna av strukturgener kan leda till upphörande av syntesen av ett visst protein eller till förlusten av dess funktion i människokroppen, vilket vanligtvis påverkar patientens fenotyp. Omkring 90% av det humana genomet består emellertid av icke-kodande sekvenser som är mer variabla och innehåller många så kallade neutrala mutationer eller polymorfismer och har inte ett fenotypiskt uttryck. Sådana polymorfa ställen (loci) används vid diagnos av ärftliga sjukdomar som genetiska markörer. Polymorfa loci finns närvarande i alla kromosomer och är kopplade till en specifik region i genen. Efter att ha bestämt lokaliseringen av det polymorfa locuset, är det möjligt att bestämma med vilket genom en mutation är associerad som orsakade sjukdomen i patienten.

För att isolera polymorfa regioner av DNA används bakteriella enzymer - restriktionsenzymer, vars produkt är restriktionsställen. Spontana mutationer som uppträder på polymorfa ställen gör dem resistenta eller omvänt känsliga för verkan av ett specifikt restriktionsenzym.

Mutationsvariabilitet i restriktionsställen kan detekteras genom att ändra längden av de bundna DNA-fragmenten, genom att separera dem med användning av elektrofores och efterföljande hybridisering med specifika DNA-prober. I frånvaro av restriktion på en polymorf plats kommer ett stort fragment att detekteras på elektroforegrammerna och, om närvarande, kommer ett mindre fragment att vara närvarande. Närvaron eller frånvaron av en restriktionsplats i identiska loci av homologa kromosomer gör det möjligt att på ett tillförlitligt sätt märka mutant- och normalgenen och spåra dess överföring till avkomman. I studien av DNA hos patienter, i både kromosomer, av vilka en restriktionsplats är närvarande i den polymorfa regionen, kommer korta fragment av DNA att avslöjas på elektroforegrammet. Hos patienter som är homozygota för en mutation som modifierar ett polymorf restriktionsställ, kommer fragment med större längd att detekteras, och i heterozygote fragment kommer korta och långa fragment att identifieras.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]