Icke-viral genterapi ger hopp vid kronisk ländryggssmärta

I en nyligen publicerad studie i tidskriften Biomaterials utvecklade forskare en ny icke-viral genterapi för att behandla diskogen ryggsmärta (DBP) genom att leverera transkriptionsfaktorn Forkhead Box F1 (FOXF1) med hjälp av modifierade extracellulära vesiklar (eEV) till degenerativa intervertebraldiskar (IVD) in vivo.

Kronisk ländryggssmärta är ett växande globalt problem på grund av en åldrande befolkning och förvärrade opioidproblem. Nuvarande behandlingar inkluderar kortvarig lindring eller dyra operationer, vilket belyser behovet av icke-beroendeframkallande och mindre invasiva behandlingar.

Nuvarande biologiska metoder, inklusive administrering av tillväxtfaktorer, cellterapi och viral genterapi, kan minska degeneration i djur- och mänskliga modeller. Emellertid kan problem som kortsiktiga effekter, dålig långsiktig effekt och onödig immunogenicitet och onkogenicitet hindra den direkta tillämpningen av dessa metoder.

I denna studie etablerade forskarna en icke-viral genterapi för intervertebral diskdegeneration (IVD) med hjälp av FOXF1-eEV.

Forskarna transfekterade primära musembryonala fibroblaster (PMEF) med plasmider innehållande FOXF1 eller pCMV6 som kontroll och karakteriserade eEV-prover med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA).

De utvärderade effektiv lastning av molekylär last i eEV:er med hjälp av kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR) och konventionell PCR. Western blot-analys identifierade FOXF1 och EV-specifika proteiner i eEV-formationer. Teamet använde plasmider som förstärker de övre och nedre polylinkerregionerna för att bestämma närvaron av FOXF1-plasmid-DNA i donatorceller och genererade eEV:er.

De undersökte fullängds-mRNA producerat från plasmid-DNA i eEV:er och donatorceller.

Forskare skapade extracellulära vesiklar med transkriptionsfaktorer för att återställa vävnadsfunktionen och förändra smärtresponser i en djurmodell av DBP.

De identifierade EV:er för transport och distribution av FOXF1 till skadade intervertebraldiskar i en musmodell av diskogen ryggsmärta för att bestämma FOXF1 eEV-hämning av intervertebraldiskdegeneration.

Teamet kombinerade biomekanisk testning av musens intervertebraldiskar med avbildning, förändringar i extracellulär matrix (ECM) och smärtresponser som utvärderades efter 12 veckor för att bekräfta förändringar i struktur och funktion, såväl som smärta, orsakade av den terapeutiska interventionen.

Preoperativa och postoperativa smärtbedömningar inkluderade mikrodatortomografi (mikro-CT), magnetisk resonanstomografi (MRI), mekanisk testning, Alcianblått (AB) och picrosiriusrött (PSR) färgning, dimetylmetylenblått test och immunhistokemi (IHC).

Studien omfattade en kirurgisk teknik där forskare administrerade buprenorfin ER subkutant till möss för att kontrollera postoperativ smärta.

Teamet genomförde beteendebedömningar före operationen och varannan vecka från fyra till tolv veckor efter operationen, med hjälp av en mängd olika metoder, inklusive öppet fälttest, kall platta, svansupphängning och trådupphängning.

I det öppna fälttestet bedömdes mössens spontana aktivitet; kalla plattester mätte termisk hyperalgesi; svansupphängningstester mätte axiell smärta; och trådupphängningstester mätte styrka.

Tolv veckor efter operationen dissekerade teamet djurens ländrygg med hjälp av lårbensnerv- och artärspårning för att identifiera intervertebraldiskar mellan L4 och L5, L5 och L6, samt L6 och S1 IVD. De använde L5/L6 IVD för att bedöma histologi och bestämma glykosaminoglykan (GAG)-innehållet.

FOXF1 eEV minskade smärtresponserna signifikant samtidigt som de återställde IVD-strukturen och -funktionen, inklusive förbättrad diskhöjd, vävnadshydrering, proteoglykaninnehåll och mekaniska egenskaper.

Studien fokuserade på frisättningen av FOXF1-laddade eEV:er från primära fibroblaster transfekterade med transkriptionsfaktorn FOXF1. Kvantitativ RT-PCR visade en signifikant ökning av FOXF1 mRNA-transkriptnivåer och fulllängdstranskriberade FOXF1 mRNA-nivåer jämfört med pCMV6-transfekterade celler.

FOXF1 eEV-terapi kan minska smärtresponser i en lumbal diskpunktionsmodell hos möss i upp till 12 veckor. Honmöss uppvisade längre anfallstider i den FOXF1-behandlade gruppen än i den skadade gruppen, vilka varade i minst 12 veckor efter behandlingen.

FOXF1 eEV-terapi förbättrade IVD-vävnadshydrering och höjd hos skadade och degenerativa djur in vivo, samtidigt som hydreringsnivåerna och T2-viktad bildintensitet för IVD-disken bibehölls.

Teamet observerade dock en minskning av diskhöjden hos skadade djur och djur behandlade med pCMV6 eEV. Möss behandlade med FOXF1 eEV hade ingen minskning av diskhöjden 12 veckor efter behandling. Kön påverkade inte funktionella resultat.

FOXF1 eEV:er återställde den mekaniska funktionen hos skadade och degenererade IVD:er in vivo. Under axiell stress uppvisade FOXF1 eEV:er-behandlade IVD:er högre normaliserad NZ-styvhet jämfört med skadade IVD:er.

Under krypförhållanden uppvisade skadade IVD:er ökade normaliserade krypförskjutningar, vilket indikerar en minskning av normaliserad krypelastisk styvhet.

Resultaten visar att en minskning av GAG-innehållet i skadade IVD:er ökar den mekaniska flexibiliteten, men eEV-behandling förhindrar förlust av glykosaminoglykaner och efterföljande förändringar i mekanisk funktion.

FOXF1 eEV inducerade strukturella och funktionella förändringar i IVD genom att öka proteoglykan- och GAG-nivåerna.

Resultaten av studien visade att eEV:er laddade med utvecklingstranskriptionsfaktorer kan behandla smärtsamma ledsjukdomar som diastoliskt blodtryck (DBP) genom att leverera dessa transkriptionsfaktorer till degenerativa och smärtsamma leder via intravenös terapi (IVD).

Denna strategi kan bidra till att minska de strukturella och funktionella avvikelser som orsakas av sjukdomen och reglera smärtresponser på ett könsspecifikt sätt.

Forskarna rekommenderade också att man använder utvecklingstranskriptionsfaktorer som FOXF1 för att försätta degenerativa NP-celler i ett proanabolt tillstånd in vivo. Ytterligare studier behövs för att fastställa dess terapeutiska effekt.