Ickeviral genterapi ger hopp om kronisk ländryggssmärta

I en nyligen publicerad studie publicerad i tidskriften Biomaterials utvecklade forskare en ny icke-viral genterapi för att behandla diskogen ryggsmärta (DBP) genom att leverera transkriptionsfaktorn Forkhead Box F1 (FOXF1) med hjälp av konstruerade extracellulära vesiklar (eEV) till degenerativa intervertebrala skivor (IVD) in vivo.

Kronisk ländryggssmärta (LBP) är ett växande globalt problem på grund av en åldrande befolkning och förvärrade opioidproblem. Nuvarande behandlingar inkluderar kortvarig lindring eller dyra operationer, vilket framhäver behovet av icke-beroendeframkallande och mindre invasiva terapier.

Nuvarande biologiska terapier, inklusive administrering av tillväxtfaktorer, cellterapi och virala genterapier, kan minska degeneration i djur- och mänskliga modeller. Bekymmer som korttidseffekter, dålig långsiktig effekt och onödig immunogenicitet och tumörframkallande egenskaper kan dock förhindra direkt tillämpning av dessa metoder.

I denna studie etablerade forskare en icke-viral genterapi för intervertebral diskdegeneration (IVD) med hjälp av FOXF1-eEV.

Forskarna transfekterade primära musembryonala fibroblaster (PMEF) med en plasmid som innehöll FOXF1 eller pCMV6 som kontroll och karakteriserade eEV-prover med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA).

De bedömde den effektiva lastningen av molekylär last i eEVs med hjälp av kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR) och konventionell PCR. Western blot-analys identifierade FOXF1 och specifika EV-proteiner i eEV-formationer. Teamet använde plasmider som förbättrar uppströms och nedströms polylinker-regioner för att bestämma närvaron av FOXF1-plasmid-DNA i donatorceller och genererade eEVs.

De undersökte fullängds-mRNA producerat från plasmid-DNA i eEVs och donatorceller.

Forskare skapade extracellulära vesiklar med transkriptionsfaktorer för att återställa vävnadsfunktion och modifiera smärtsvar i en djurmodell av DBP.

De identifierade elbilar för att transportera och distribuera FOXF1 till skadade intervertebrala skivor i en musmodell av diskogen ryggsmärta för att fastställa FOXF1 eEV-hämning av intervertebral diskdegeneration.

Teamet kombinerade biomekanisk testning av mellankotskivor från mus med bildbehandling, extracellulära matrix-förändringar (ECM) och smärtresponser utvärderade efter 12 veckor för att bekräfta förändringar i struktur och funktion, såväl som smärta inducerad av den terapeutiska interventionen.

Preoperativa och efterbehandlingsmässiga smärtbedömningar inkluderade mikrodatortomografi (mikro-CT), magnetisk resonanstomografi (MRT), mekaniska tester, Alcian blue (AB) och picrosirius red (PSR) färgning, dimetylmetylenblått test och immunhistokemi (IHC) ) ).

Studien involverade en kirurgisk teknik där forskare injicerade Buprenorphine ER subkutant i möss för att kontrollera postoperativ smärta.

Teamet genomförde beteendebedömningar före operationen och varannan vecka från fyra till tolv veckor efter operationen, med hjälp av en mängd olika tekniker som t.ex. Öppet fälttest, kallplatta, svansupphängning och vajerupphängning.

Det öppna fälttestet bedömde den spontana aktiviteten hos möss; kallplatta tester mätte termisk hyperalgesi; Svansupphängningstest mätte axiell smärta; och trådupphängningstest uppmätt styrka.

Tolv veckor efter operationen dissekerade teamet djurens ländryggar, med hjälp av lårbensnerver och artärspårning för att identifiera intervertebrala diskar mellan L4 och L5, L5 och L6, och L6 och S1 IVD. De använde L5/L6 IVD för att utvärdera histologi och bestämma innehållet av glykosaminoglykan (GAG).

FOXF1 eEVs reducerade avsevärt smärtreaktioner samtidigt som de återställde IVD:s struktur och funktion, inklusive förbättringar av diskhöjd, vävnadshydrering, proteoglykaninnehåll och mekaniska egenskaper.

Studien fokuserade på frisättningen av FOXF1-laddade eEV från primära fibroblaster transfekterade med FOXF1-transkriptionsfaktorn. Kvantitativ RT PCR visade en signifikant ökning av FOXF1-mRNA-transkriptnivåer och fullängdstranskriberade FOXF1-mRNA-nivåer jämfört med celler transfekterade med pCMV6.

FOXF1 eEV-terapi kan minska smärtreaktioner i en musmodell med punktering av lumbal disk i upp till 12 veckor. Möss av honkön visade längre upptagningstider i den FOXF1-behandlade gruppen än i den skadade gruppen, vilket varade i minst 12 veckor efter behandlingen.

FOXF1 eEV-terapi förbättrade hydrering och IVD-vävnadshöjd hos skadade och degenerativa djur in vivo samtidigt som hydreringsnivåer och T2-vägd IVD-bildintensitet bibehölls.

Teamet observerade dock en minskning av diskhöjden hos sårade djur och djur som behandlats med pCMV6 eEV. Möss behandlade med FOXF1 eEV hade ingen minskning av diskhöjden 12 veckor efter behandling. Kön påverkade inte funktionella resultat.

FOXF1 eEVs återställde den mekaniska funktionen hos skadade och degenererade IVDs in vivo. Under axiell spänning visade FOXF1 eEV-behandlade IVD: er högre normaliserad NZ-styvhet jämfört med skadade IVD:er.

Under krypförhållanden uppvisade skadade IVD: er ökade normaliserade krypförskjutningar, vilket tyder på en minskning av normaliserad krypelastisk styvhet.

Resultaten visar att en minskning av GAG-innehållet i skadade IVD ökar den mekaniska flexibiliteten, men eEV-terapi förhindrar förlust av glykosaminoglykan och efterföljande förändringar i mekanisk funktion.

FOXF1 eEVs orsakade strukturella och funktionella förändringar i IVD genom att öka nivåerna av proteoglykaner och GAG.

Studieresultaten visade att eEV laddade med utvecklingstranskriptionsfaktorer kan behandla smärtsamma ledsjukdomar som DBP genom att leverera dessa transkriptionsfaktorer till degenerativa och smärtsamma IVD-leder.

Denna strategi kan hjälpa till att minska strukturella och funktionella abnormiteter som orsakas av sjukdomen, samt reglera könsspecifika smärtreaktioner.

Forskare har också rekommenderat att man använder utvecklingstranskriptionsfaktorer som FOXF1 för att omvandla degenerativa NP-celler till ett pro-anabolt tillstånd in vivo. Ytterligare forskning behövs för att fastställa dess terapeutiska effektivitet.