Experimentellt arbete med transplantation av allogena keratinocyter på artificiellt skapade ärr hos vita råttor

Önskan att utnyttja den cellulära potentialen och behovet av att hitta nya effektiva metoder för att förbättra ärrens estetiska utseende ledde till idén att försöka studera möjligheten att transplantera keratinocyter på ärrytor.

För att bevisa sannolikheten för att använda keratinocytkultur för att förbättra ärrens utseende, genomfördes en experimentell studie på vita laboratorieråttor, på vilka ärrytor skapades. Råttärrmodellen erhölls som ett resultat av läkning av artificiellt tillfogade sår på ryggen, längs ryggraden. Råttorna skar ut identiska hudbitar, 2x3 cm stora. 2,5 månader efter "ärrmodellerings"-operationen genomgick råttorna dermabrasion (borttagning av de övre lagren av ärret med hjälp av termokaustik) och allogena keratinocyter transplanterades, isolerade från huden hos råttungar 2-4 dagar efter födseln.

Isolering och odling av råttepidermala celler utfördes i cellteknologilaboratoriet vid Institutet för cytologi vid Ryska vetenskapsakademin med hjälp av följande teknik.

Huden tvättades i Hanks saltlösning innehållande 200 U/ml gentamicin och skars i små bitar, 0,2-0,5 cm2 i yta ^. Hudbitarna inkuberades i 0,5 % dispaslösning i balanserad saltfosfatbuffrad lösning vid 37 °C i 1 timme. Bitarna överfördes sedan till Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning och epidermis separerades från dermis. Epidermis inkuberades i 0,125 % trypsinlösning i 10-15 minuter under omrörning vid 50 rpm, varefter enzymverkan stoppades genom att tillsätta 5 % fetalt bovint serum. En tredjedel av den resulterande cellsuspensionen användes i ren form för ett av alternativen för transplantation på ärr, den andra tredjedelen odlades på biokompatibla hushållsfilmbeläggningar "Polypor", och den tredje - på petriskålar utan substrat. Operationen med dermabrasion av de resulterande ärren hos råttor med efterföljande transplantation av råttepidermalceller på dem utfördes under eterbedövning med hjälp av termisk kauterisering.

I den första gruppen råttor, efter dermabrasion, placerades sterila bitar av kambric på den polerade ärrets yta, tvättades med fysiologisk lösning och torkades, på vilken en skakad suspension av allogena råttepidermocyter applicerades i en koncentration av 1,5 miljoner celler per 1 ml (enligt Institutet för cytologi). Kambricbitarna placerades på det polerade ärret så att cellerna låg på ärrytan. Ett bandage av flera lager gasbinda placerades ovanpå, vilket syddes fast vid ärrets kanter.

En del av den erhållna cellsuspensionen såddes i petriskålar på sterila Polypore-filmer skurna till skålarnas form, den andra delen - på petriskålar utan film. Odlingen utfördes i FAD-medium, bestående av en blandning av DMEM och F12-medium i förhållandet 3:1, med tillsats av 10 % fetalt bovint serum, 5 μg/ml insulin (Sigma), 0,5 μg/ml hydrokortisonhemisuccinat (Sigma), 10 μg/ml epidermal tillväxtfaktor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Den andra och tredje gruppen råttor, 7 individer vardera, opererades 6 dagar efter den första. Vid denna tidpunkt bildades flerskiktade lager från suspensionen av sådda keratinocyter i petriskålarna, vilka transplanterades till råttorna. Den andra gruppen transplanterades med epidermocyter på en film, den tredje - med ett flerskiktade lager utan substrat. Efter 7 dagar transplanterades de erhållna flerskiktade lagren av allogena keratinocyter (MPALK), sådda på "Polypore"-filmerna, som en kultur direkt på sårytan. Ovanpå fixerades filmen, för att undvika att den rivs av, med ett flerskiktat gasbinda och syddes fast på råttornas hud.

Innan keratinocyter transplanterades till den tredje gruppen råttor som odlats utan substrat, separerades PAC från botten av petriskålen genom att behandla den med dispas, vilket har förmågan att selektivt störa dermal-epidermala bindningar. När dispas verkar på ett flerskiktat lager stör det basalskiktets cellers förbindelse med botten av petriskålen och har en mycket mindre effekt på de intercellulära förbindelserna, vilket gör det möjligt att "ta bort" lagret helt. Avskiljning av det flerskiktade cellskiktet med dispas utfördes enligt följande. Transportmediet tömdes från petriskålarna, cellskikten tvättades tre gånger med ett näringsmedium innehållande antibiotika, i synnerhet gentamicin (0,2 mg/ml). De flerskiktade skikten fylldes med 0,125 % dispaslösning ("Sigma") och placerades i en termostat, där de inkuberades vid t=37°C i 20–30 minuter. Uppkomsten av en vit kant som skalar av längs lagrets periferi är en indikator på början av processen för dess separation från kanterna och botten av petriskålen. Några minuter efter att separationsprocessen påbörjats tömdes dispaslösningen, epitelskikten tvättades 2-3 gånger med mediet. En bit sterilt sårförband "Lita-color", skuret till koppens storlek, applicerades på ytan av det epidermala lagret, på vilket lagret som separerats med dispas, dessutom skalat av från botten av koppen med en spatel, fästes. Med hjälp av en ögonpincett revs lagret tillsammans med beläggningen av servetten "Lita-color" (Ryssland) av från botten av petriskålen och överfördes försiktigt till den förberedda ärrytan. Servetterna "Lita-color" innehåller gentamicin och exolin (kollagenextrakt), som, när de fuktades med resterna av tillväxtmediet och sedan med en fysiologisk lösning, svällde och blev ett modernt sårförband, vilket ger gott skydd mot extern infektion och snabb läkning tack vare den fuktabsorberande strukturen.

Flerskiktade gasbindor applicerades på Polypore-filmerna och Lita-color-servetterna och syddes fast på råttornas hud för starkare fixering. Varje råtta placerades i en separat bur för att skapa optimala förhållanden för dess underhåll och inplantning av de transplanterade keratinocyterna. Bandagen från råttorna, till vilka suspensionen och flerskiktsskiktet av epidermocyter som avlägsnats genom dispas transplanterades, fuktades med steril saltlösning flera gånger om dagen för att skapa de mest gynnsamma förhållandena för inplantning av cellerna. Med tanke på att Polypore-filmen var ogenomtränglig för vatten, fuktades inte bandagen från råttorna i den andra gruppen, vilket var en av fördelarna jämfört med transplantationer utan filmer. Bandagen togs bort efter 10 dagar. Den kliniska bilden av ärr efter celltransplantation skilde sig lite från ärr utan transplantation, förutom deras rosa färg (på grund av dermabrasion) och större flagning. Detta faktum tyder på att omedelbart efter att sårförbanden föll av med MPC, inträffade inga förändringar i ärret.

Ta biopsimaterial från råttor.

1, 2, 5 och 9 månader efter transplantation av allogena keratinocyter från råtta på polerade ärr från vita råttor togs material för histologisk, cytomorfologisk och elektronmikroskopisk undersökning. Prover av normal råtthud och ärr utan celltransplantation togs som kontroll. Anestesi av råttor utfördes med eteranestesi.

Efter anestesi togs bitar av ärrvävnad från de markerade områdena till vilka keratinocyter transplanterats med hjälp av en biopsipunsch med 2 mm diameter och placerades i en 2,5 % glutaraldehydlösning för att förbereda materialet för elektronmikroskopisk undersökning. Vävnadsbitar som tagits för histologisk undersökning placerades i en 10 % neutral formalinlösning, följt av att de passerade genom alkoholer och bäddades in i paraffin, följt av att ultratunna snitt skars ut och undersöktes i ett ljusoptiskt mikroskop.

Kontroll I. Normal råtthud.

För att se skillnaden mellan den mikroskopiska bilden av normal ärrförändrad råtthud och ärr vid vissa tidpunkter efter transplantation av MPC, visas fotografier och beskrivningar av dem i alla skeden av denna studie.

Epidermis i normal hud består av 7-9 celllager. Stratum corneum är av måttlig tjocklek. På vissa ställen består den av 6-8 lager hornhinnefjäll. Basalskiktet representeras av cylindriska celler med stora, ljusa, regelbundet formade kärnor och flera nukleoler. Desmosomala kopplingar mellan cellerna och med basalmembranet är tydligt uttryckta. Under det väldefinierade basalmembranet, som har små utväxter i det subepidermala skiktet, ligger parallellt med det fina buntar av kollagen- och elastinfibrer, bland vilka finns långsträckta fibroblaster, små kärl. I djupare lager ligger buntar av kollagen- och elastinfibrer i olika riktningar. Bland dem finns många kärl med tunna väggar av samma kaliber, cellulära element (fibroblaster, mastceller, leukocyter). Ett stort antal hårsäckar, talgkörtlar.

Kontroll 2. Råttarr, 2 månader gammalt.

Klinisk bild. Ärren är ljusrosa, med fjällning, skorpor kvarstår på vissa ställen. Deras yta har minskat på grund av sammandragning av kollagenfibrer och har blivit cirka 3,0-3,5 cm ^. Hudbihang saknas.

Mikroskopisk bild. Epidermis består av 3-5 lager av celler, vikta, representerade av rundade basalceller, en rad subulat, 1-2 rader granulära med keratohyalinkorn i det övre lagret, det finns områden med intracellulärt ödem. Stratum corneum är ojämnt förändrat från mycket tunt till förtjockat. Ärrveckning noteras på grund av (kontraktion) av ärrvävnad. Vikarna penetrerar papillärskiktet och skapar intrycket av papiller. Gränsen mellan epidermis och dermis är en rak linje. Basalmembranet spåras inte överallt. I den nedre delen av subepidermala och djupare lager finns kärl med en tjock, luckrad vägg, många är övergivna, med stasis. Runt kärlen finns en ansamling av makrofager, fibroblaster. Makrofager omger erytrocyterna som frigörs från kapillärerna och fagocyterar dem. I de mer ytliga lagren finns små kapillärer. Under epidermis är kollagenfibrer löst placerade. I det djupare lagret av ärret finns grova buntar av kollagenfibrer, bland vilka det finns många fibroblaster.

Råttärr en månad efter transplantation av råttkeratinocyter.

Klinisk bild. Ärren är rosa, deras area har minskat, särskilt i diameter, och är i genomsnitt 2,5-3 cm² ^. Hår och talgkörtlar saknas.

Data från mikroskopisk undersökning av material erhållet från råttor med transplantation av MPaLK på film och MPaLK utan substrat är praktiskt taget identiska. Rent tekniskt är det dock mycket mer komplicerat och mödosamt att arbeta med MPaLK utan substrat än vid odling av MPaLK på substrat, därför använde vi, vid vidare studier av frågan om transplantation av keratinocyter till ärr, flerskikts-cambric som bas för odling ("substrat").

Mikroskopisk bild. Förtjockning av epidermis till 15-20 lager observeras, nästan till mitten av vilken keratinocyterna har en smal, långsträckt, vertikal form och kompakt arrangemang. Basalcellerna är belägna i en ojämn linje. Deras kärnor är ljusa, stora, rundade med en eller två nukleoler, vilket indikerar deras höga syntetiska och proliferativa aktivitet. Gränsen mellan epidermis och dermis är en rak linje. Det taggiga lagret är välutvecklat och består av 3-5 lager av rundade celler, det finns 2 nukleolära celler.

Omedelbart under basalmembranet finns tätt placerade tunna buntar av kollagenfibrer, parallellt med dem finns ett stort antal övergivna kärl, djupare kollagenfibrer är grövre, samlade i täta buntar. Många stora fibroblaster, mastceller (2-3 i synfältet), makrofager, leukocyter och övergivna kärl, vars väggar är lösa, runt dem finns löst placerade kollagenfibrer. I vissa kärl finns stas, diapedes av bildade element. Runt kärlen finns fibroblaster, enskilda lymfocyter. Hudbihang saknas.

Vid transplantation av en keratinocytsuspension på ett polerat ärr skiljer sig den mikroskopiska bilden från den föregående. Hos de flesta djur är epidermis tunn och består av 5-6 celllager. Det undre lagret består av celler med oregelbunden, polygonal form med kärnor med rund-oregelbunden form. Tillståndet hos det subepidermala lagret liknar dess tillstånd hos gruppen djur utan MPALK-transplantation.

I detta fall kan vi tala om antingen en försening i processerna som följer med celltransplantation, eller om en stor förlust av celler transplanterade i form av en suspension. Därför drogs en slutsats om det olämpliga med ärrkorrigering genom transplantation av keratinocyter i form av en suspension.

Råttärr 2 månader efter transplantation av råttkeratinocyter.

Klinisk bild. Ärret ser tunt och ömtåligt ut. På sina ställen observeras flagning och fjällande fläckar.

Mikroskopisk bild. Stratum corneum är förtjockat, bitvis - hyperkeratos. Epidermis är förtjockad och består av 12-20 rader av celler. Gränsen mellan epidermis och dermis är en rak linje. Delikata kollagenfibrer under epidermis ligger ganska tätt. I de djupare skikten av ärret är de samlade i stora grova buntar. I det subepidermala skiktet uppstår ny kärlbildning. I de nedre skikten av ärrvävnad finns många övergivna kärl belägna parallellt med epidermis yta. Stora fibroblaster är jämnt fördelade i ärrets tjocklek, det finns jättelika, flergrenade, många makrofager.

Råttärr 5 månader efter transplantation av råttepidermala celler.

Klinisk bild. Ärret ser jämnt ut, slätt utan att flagna, det finns enstaka hårstrån, deras densitet är större i ärrens utkant, vilket tyder på marginell inväxt av hårsäckar i ärret och nybildning av hårsäckar. Ärrytan fortsätter att minska.

Mikroskopisk bild. Epidermis är fortfarande tjock (15-20 lager, på vissa ställen upp till 30) och i de övre lagren är den fylld med keratohyalinkorn. Basalmembranet är tydligt synligt. Under det ligger kollagenfibrer löst. I de nedre lagren är kollagenet kraftigare och tätt packat. Det finns många kapillärer bland kollagenbuntarna. I de övre lagren har antalet övergivna kärl minskat. Övergången mellan epidermis och dermis är något vågig. På vissa ställen finns djupa epidermala utväxter i ärrvävnaden. Nybildade kärl är synliga bland kollagenfibrerna. Enstaka hårsäckar och talgkörtlar uppträder.

Råttarr 9 månader efter transplantation av råttepidermala MPA-celler.

Klinisk bild. Ärren har blivit betydligt mindre i storlek jämfört med tidigare perioder, deras yta är i genomsnitt cirka 1,5-2,0 cm² ^. Ärren är ojämnt täckta med fina hårstrån, särskilt i periferin. Mindre fina flagningar kvarstår.

Mikroskopisk bild.

Epidermis har blivit tunnare, representeras av 6-8 rader celler, liknar epidermis hos normal råtthud i struktur, bara celltätheten är 1 mm högre och de är mindre. Basalskiktet består av små rundcylindriska celler. Basalmembranet är välutvecklat, hemidesmosomer är tydligt synliga. Närvaron av epidermala utväxter i det subepidermala skiktet noteras. Papillärskiktet är uttryckt längs hela ärrets längd. Dessa fakta indikerar att vidhäftningen av de transplanterade keratinocyterna med den underliggande ärrvävnaden vid denna tidpunkt har blivit mycket starkare. Därför kan ärrvård hos personer med MPALK-transplantation 9 månader efter MPC-transplantation vara traditionell. Under epidermis är kollagenfibrer mer känsliga än i de djupa skikten. Många kärl har dykt upp, särskilt ytliga. Väggarna i större kärl är förtjockade. Hårsäckar och talgkörtlar finns i stora mängder. Den mikroskopiska bilden liknar dermalliknande vävnad.

Resultat av experimentellt arbete och deras diskussion.

Under detta arbete transplanterades keratinocyter i olika former på artificiellt skapade råtthudsärr efter dermabrasionskirurgi – på sårbeläggningar, som suspension på cambric och som ett flerskiktsskikt utan substrat. Arbetet utfördes i syfte att erhålla morfologiska data om effekten av transplanterade allogena keratinocyter på ärr, samt att fastställa optimala transplantationsalternativ.

Det konstaterades att alla tre transplantationsmetoderna är genomförbara, men transplantation av MPAC utan substrat är en mycket arbetsintensiv procedur, under vilken MPAC kan skadas, vilket påverkar transplantationsresultatet. Dessutom utesluter denna transplantationsmetod arbete på stora ytor.

Transplantation av keratinocytsuspensioner är en mycket mer kostnadseffektiv metod, kräver inte långvarig cellodling och är enkel i den version vi föreslår med hjälp av sterila kambriska ämnen, vars storlek motsvarar ärrens storlek. Fördröjningen av den terapeutiska effekten vid transplantation av en cellsuspension på cirka en månad jämfört med MPC på en sårbeläggning är inte en betydande punkt vid en behandlingstid på många månader. Det är känt att när MPC transplanteras till brännskadepatienter sker transformationen av hudstrukturen gradvis och under flera år. Transplantation av keratinocytkultur på sårbeläggningar är den mest bekväma och lovande metoden, men också betydligt dyrare. Dessutom kräver det för närvarande en sökning efter mer avancerade beläggningsalternativ som ska vara flexibla, hygroskopiska, ha bakteriostatiska eller bakteriedödande egenskaper och vara biologiskt neutrala för celler. Filmen "Polypor" - en mellanversion av den inhemska sårbeläggningsfilmen, trots vissa brister, gjorde det möjligt för oss att i experimentet studera transplantation av råttkeratinocyter på ärr och dra slutsatser om effektiviteten av denna riktning för ärrbehandling.

Författarna som transplanterade MPC på brännskador noterade att epidermis förtjockades och skiktades under den första veckan efter transplantation av ett flerskiktat lager av keratinocyter på desinficerade såren. Alla lager av epidermis var tydligt synliga. Intressant nog var antalet celllager i transplantaten 10–30 % större än i hudbiopsierna. Författarna noterade uppkomsten av keratohyalingranuler på den femte dagen efter MPC-transplantation, och basalmembranet och hemidesmosomer – redan på den tredje dagen.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) fann att i de tidiga stadierna efter transplantation av MPC till patienter med fullhudsdefekter efter brännskador är kopplingen mellan dermis och epidermis mycket svag och är en rak linje, papillärskiktet saknas. Vid slutet av den andra månaden börjar ytliga papiller och hudbihang bildas, kopplingen mellan dermis och epidermis blir starkare. Litteraturdata indikerar att transplantation av allogena keratinocyter på sår hos brännskadepatienter är en lovande metod. Trots att avstötning av allogena keratinocyter sker, enligt olika författare, inom 10 dagar till 3 månader, spelar de ändå en roll i läkning av sårytan, utsöndring av tillväxtfaktorer och mekanisk tillslutning av defekten. Man tror att MPALC har minskad antigenaktivitet, eftersom de under in vitro-odling förlorar Langerhans-celler, vilket gör att de kan existera i mottagarens kropp under lång tid. Dessutom har en allogen kultur erhållen från huden hos unga friska människor en ojämförligt större biologisk potential än en autolog kultur av patienter efter en skada.

Huvudmålet med vår studie var att ta reda på om allogena keratinocyter kommer att rota sig på ärr och vilka förändringar som kommer att ske i ärrvävnaden under påverkan av en sådan biologiskt aktiv "sårbeläggning". Vid ett positivt resultat, att utveckla den mest effektiva och minst arbetsintensiva tekniken för detta område av rehabiliteringsmedicin.

De data vi erhöll liknade på många sätt litteraturdata om morfologiska förändringar som sker i den mänskliga epidermis efter transplantation av allogena keratinocyter till brännskador. Det finns dock också betydande skillnader, både vad gäller det morfologiska substratet på vilket transplantationen sker och vad gäller teknik. Således sker processen för bildandet av basalmembranet och dermal-epidermala kopplingar (hemidesmosomer, papiller) i ett senare skede jämfört med transplantation av keratinocyter till sårytor utan ärrförändringar. Tydligen sker detta på grund av ärrvävnadens sämre näring jämfört med dermis eller muskelfascia. Ett ärr, särskilt ett gammalt, är en tät bindväv med ett mycket litet antal kärl, medan botten av ett brännsår är granulationsvävnad rik på kärl. Det är således uppenbart att förhållandena under vilka transplantation och inympning av keratinocyter sker är helt annorlunda. Ju mer vaskulariserat celltransplantationsområdet är, desto enklare är processen för deras inympning. Från detta postulat följer slutsatsen om preferensen att arbeta med unga ärr, där bindväven fortfarande är ganska lös och rik på kärl.

Som ett resultat av detta experimentella arbete bevisades det att:

1. Transplantation av MPALK till ärr är möjlig.
2. Den optimala transplantationsmetoden är transplantation av keratinocyter på sårbeläggningen.
3. Ärrytan bör poleras med kirurgisk laserdermabrasion eller en Schumann-skärare.
4. Under påverkan av MPALK sker snabb epitelisering av ärrets polerade yta.
5. Ju bättre vaskulariserad ärrvävnaden är, det vill säga ju yngre ärret är, desto bättre blir resultaten av keratinocyttransplantation.
6. Under inverkan av transplanterade keratinocyter omvandlas ärrvävnaden gradvis och övergår till en dermalliknande (mer lös ärrvävnad med hudbihang).
7. Gradvis lossning av ärrvävnad, med början i det subepidermala lagret. Dess vaskularisering förbättras, kollagenfiberbuntar i ärrets övre och nedre delar får en lösare placering än i ärrvävnad utan celltransplantation. Hårsäckar och talgkörtlar uppträder. Epidermis, i sin struktur, efter att ha passerat hypertrofifasen, närmar sig epidermis hos normal hud.
8. De observerade förändringarna är associerade med tillväxtfaktorer och cytokiner som utsöndras av keratinocyter, vilka genom att förbättra ärrvävnadens trofism främjar dess omvandling från grov fibrös vävnad till lösare vävnad, vilket leder till en förbättring av ärrets utseende.

Baserat på denna studie kan man således dra slutsatsen att transplanterade keratinocyter har en gynnsam effekt på ärrvävnad, vilket kan ha praktiska konsekvenser för rehabilitering av patienter med olika typer av ärr.

Detta arbete på råttor gjorde det också möjligt för oss att formulera kraven för sårbeläggningar på vilka keratinocyter odlas.

Sårförband bör vara:

• biokompatibel med celler,
• andningsbar,
• ha en elastisk, formbildande bas,
• vara hydrofil,
• eftersom medicinska tillsatser innehåller antibakteriella läkemedel och antioxidanter som inte är giftiga för odlade celler.

Kliniska resultat av bioteknologisk behandling av ärr.

Tidigare fann N. Carver et al. (1993) att ocklusiva förband bäst främjar fäste vid såret och keratinocyternas överlevnad, men inte tillåter bildandet av stratifierad (mogen) epidermis. En luftig miljö är nödvändig för bildandet av stratifierad epidermis. Därför föreslogs det, efter fästandet av ett flerskiktsskikt, att ta bort det ocklusiva sårförbandet efter 7-10 dagar och behandla såren under torra förband eller vattenlösliga salvor. Man kan säga att kvaliteten och egenskaperna hos det "substrat" på vilket cellerna odlas är en mycket viktig punkt för effektiviteten av cellulär materialtransplantation, och därmed för resultaten av läkarnas arbete. Men det finns inget idealiskt sårförband idag, trots överflödet av föreslagna alternativ (konstgjord hud, non-woven-tyg tillverkat av karboximetylcellulosa, fibrinbeläggningar, semipermeabla polyuretanfilmer). En viktig punkt i denna fråga är kostnaden för "substrat" (speciella sårbeläggningar), eftersom deras höga kostnad ökar den totala kostnaden för bioteknologisk behandling.

Cellteknologiernas effektivitet har bevisats hittills, men tyvärr är dessa teknologier mycket dyra, särskilt i länder där industriell produktion av cellkompositioner inte har etablerats. Länder som USA har dock länge etablerat en industri för produktion av cellmaterial för brännskadetransplantationer. I synnerhet har företaget BioSurface Technology Inc. sedan 1989 odlat 37 000 flerskiktade keratinocytlager, som användes för att behandla 240 patienter i 79 länder runt om i världen (R. Odessey, 1992), medan 1 cm2 cellkultur ^kostar cirka 7-8 amerikanska dollar.

Tekniken för behandling av olika hudsjukdomar och problem har ett antal skillnader, men all cellbehandling bygger på att man erhåller högkvalitativt cellmaterial och transplanterar det.

Denna process består av följande steg:

• ta hud från offer (eller från donatorer),
• transportera hudflikar till ett bioteknikcenter,
• isolering av basala lagerceller och deras proliferation,
• tillväxt av flerskiktade keratinocytlager (MLK).
• cellkulturtransplantation.

Det största problemet med att utföra behandling med transplantation av flerskiktade keratinocytskikt är behovet av livskraftiga celler i alla stadier av celltransplantationen. Hudbitar för isolering av autologa eller allogena celler bör vara så tunna som möjligt, eftersom de i detta fall är lättare att separera med mekaniska och enzymatiska metoder och erhålla en suspension av levande celler för odling. De kan erhållas genom att skära med en dermatom eller genom att använda huden på ögonlocken, förhuden och axelns inre yta. Med tanke på att cellerna är känsliga för halogener (klor, jod) och väteperoxid, kan de inte användas vid bearbetning av huden under materialinsamling.

Det kvantitativa och kvalitativa utbytet av celler från hudtransplantat och effektiviteten i deras odling beror också på givarens hälsa och ålder. Dessutom måste hudbiopsier levereras så snabbt som möjligt och under lämpliga förhållanden (miljö, temperatur) till ett laboratorium som är certifierat och ackrediterat för dessa ändamål.

För förvaring och transport av hudflikar kan Eagle's medium eller medium 199 med tillsats av 10 % bovint serum, DMEM-medium med tillsats av 5 % fetalt bovint serum och antibiotika användas.

I cytologilaboratoriet delas hudbiopsin först mekaniskt i små bitar, sedan bearbetas hudbitarna med hjälp av enzymer: trypsin, kollagenas, dispas, etc.

Under enzymernas inverkan förstörs desmosomer och keratinocyter frigörs i mediet i form av individuella celler eller aggregat bestående av olika antal celler. Endast basala keratinocyter används för odling, vilka odlas på speciella medier i termostater innehållande 5 % CO₂, i petriskålar eller i kolvar vid t = 37 °C. Redan efter 48 timmar observeras bildandet av keratinocytkolonier, vilka gradvis smälter samman och bildar ett monolager. Efter att ha mottagit ett tillräckligt antal celler sås den resulterande suspensionen på sårförband som framställts för detta ändamål och placeras i petriskålar. Först bildas ett monolager och sedan ett flerskiktslager av keratinocyter från suspensionen. Stegen i keratinocytodlingsprocessen visas schematiskt i figur 12 (33,43,54,65).

Bildandet av ett flerskiktat keratinocytlager lämpligt för transplantation tar vanligtvis 7–10 dagar. Ibland är denna period längre, vilket beror på källmaterialets kvalitet (ålder, givarens hälsotillstånd, korrekt materialinsamling, kvalitet på det använda mediet etc.). Om flerskiktet växer över kan celler med apoptosfenomen som är olämpliga för transplantation uppstå på dess yta. Petriskålar med flerskiktade keratinocytlager (MLK) odlade i dem på sårbeläggningar levereras till kliniken i speciella behållare vid en temperatur på minst +15° C.

Modifierad Greens metod för odling av MPC

I vårt arbete använde vi flerskiktade kambric som sårskydd och övergav "Polypor"-filmerna som vi började arbeta med i experimentet med råttor. Vi odlade därför flerskiktade keratinocytlager på föravfettad och steril kambric, även om det inte heller är ett optimalt sårskydd.

Kliniska studier genomfördes på volontärer i enlighet med nödvändiga etiska standarder: undertecknande av avtal och informerat samtycke.

1. En kultur av patientens egna (autologa) och bankade (allogena) keratinocyter användes.
2. Patienternas egna keratinocyter erhölls från en bit hud som skurits från insidan av deras överarmar.
3. Ärrdermabrasion utfördes med hjälp av termokauteri, roterande skivor och en erbiumlaser.
4. Patientgrupper med normotrofiska, hypotrofiska och hypertrofiska ärr togs.

Den tekniska processen för tillämpning av cellteknik för att förbättra utseendet på hudärr bestod av följande steg:

1. Patientval.
2. Förklaringar av behandlingens innehåll, tidsramen för att uppnå förväntade resultat, undertecknande av kontrakt och informerat samtycke.
3. Förskriv till patienter 2-3 veckor före operationen Selmevit 1 tablett 3 gånger om dagen, Zinctheral 1 tablett 3 gånger om dagen.
4. Ta en bit hud 2,0 cm lång och 0,7-1,0 cm bred från axelns inre yta, högt upp, nästan i den nedre delen av axillärregionen för att erhålla autologa keratinocyter.
5. I fall där patienter vägrade att isolera sina egna keratinocyter på grund av risken för ett linjärt ärr på axelns inre yta, togs cellmaterial från en cellbank (allogena keratinocyter).
6. Keratinocyter isolerades och odlades i ett laboratorium som är certifierat för denna typ av arbete.
7. Efter att ha erhållit en tillräcklig mängd MPC för transplantation på ärren, bestämdes en dag för operationen på kliniken, där materialet fördes i speciella behållare i petriskålar.
8. En ärrdermabrasionsoperation utfördes, hemostasering, den polerade ytan tvättades med en steril saltlösning, torkades, varefter MPC:erna transplanterades på den sterila kambriska "celler nedåt". Det vill säga, cellerna som var övre i MPC:n visade sig vara lägre, intill den polerade ytan.
9. En steril film applicerades ovanpå, vilken fixerades på huden med ett elastiskt bandage eller elastiskt Omnifix-plåster. Istället för filmen kan indifferenta sårförband innehållande silikon användas, till exempel Mepitel, Mepiform, silikongelark.

Efter 5–7 dagar avlägsnas filmen eller silikonbeläggningen. Vid det här laget bör alla keratinocyter ha krupit upp på det polerade ärret och fäst sig på dess yta.

10. Den fuktiga miljön som skapas under filmen och silikonbeläggningen bidrar aktivt till detta. Den kambriska ytan som finns kvar på ärret från och med nu kan blötläggas med curiosin eller kitosan gel. Som ett resultat skapas en tät skorpa på den andra dagen, som för patientens bekvämlighet bäst fixeras med en elastisk, andningsbar plåster, såsom Omnifix. Den andningsbara skorpan gör att den bildade epidermis kan differentieras och omvandlas till en mogen hud.

Beroende på ärrtyp och hur djupt ärret slipas, stöts bandaget bort efter 8–10 dagar. Vid denna tidpunkt har epidermis 30–40 % fler celllager än i normal hud. Basalmembranet är inte bildat. Keratinocyter i den förtjockade epidermis utsöndrar mycket biologiskt aktiva molekyler i ärrvävnaden.

Framgången med bioteknologisk ärrbehandling beror till stor del på vårdmetoden under den postoperativa perioden. Cellkulturer är en "skonsam" typ av sårbeläggning och i de tidiga stadierna efter transplantation kan IPC:erna lätt skalas av från den underliggande vävnaden. Därför rekommenderas patienter att hantera ärret försiktigt efter operationen. Gnugga inte ärret under 8-9 månader och behandla försiktigt med kallt kokt vatten för att undvika att riva av den tunna, nyskapade epidermis, som inte har en tät bindning med den underliggande vävnaden.

Notera.

Före operation och under dermabrasion är användning av halogenerade antiseptiska medel och oxidationsmedel (jodopyron, suliodopyron, jodinol, jodinat, klorhexidin, väteperoxid) tillåten, före celltransplantation - är strikt kontraindicerat på grund av deras cytotoxiska effekt. Metylenblått och briljantgrönt är också giftiga för celler.

För att undvika infektion, särskilt vid arbete med hypertrofiska ärr, kan operationsområdet behandlas med neomycinsulfat, polymyxin eller gentamicin. De har ingen cytotoxisk effekt på keratinocyter.

Som ett resultat av sådan behandling uppnås en trippel effekt.

1. Utjämning av ärrytan.
2. Skapandet av ett lager av ny epidermis med normal tjocklek ovanför den.
3. Omvandling av ärrvävnad till dermalliknande vävnad på grund av verkan av cytokiner, tillväxtfaktorer och andra biologiskt aktiva molekyler som utsöndras av transplanterade celler och stimuleras av dem - keratinocyter, fibroblaster och makrofager.

Ärret blir mindre synligt, mer elastiskt, porer och vellushår uppträder i det, och pigmentering kan återställas på grund av närvaron av melanocyter i IPC.

Alla dessa positiva aspekter av ärret uppstår dock inte omedelbart. I detta avseende är det nödvändigt att varna patienterna för att processen med omvandling av ärrvävnad till hudvävnad sker långsamt och att det optimala resultatet av sådan behandling kan förväntas tidigast efter 10-14 månader. Omedelbart efter att förbanden har tagits bort har de polerade ytorna en uttalad polykromi, ju ljusare desto djupare polering utfördes. Minst möjliga hudskador observeras vid polering av normotrofa ärr med erbiumlaser. Färgen på ärren och omgivande hud återställdes inom 3 till 8 veckor. Trots sådana försiktighetsåtgärder uppstår ibland postoperativ hyperpigmentering, som kan försvinna av sig själv inom några månader.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]