Experimentellt arbete med transplantation av allogena keratinocyter på artificiellt skapade ärr av vita råttor

Lusten att använda cellpotentialen och behovet av att söka efter nya effektiva metoder för att förbättra det estetiska utseendet hos ärr ledde till tanken på att försöka studera möjligheten att keratinocyttransplantation skarrar ytor.

För att bevisa möjligheten att använda keratinocytkulturen att förbättra utseendet på ärr experimentellt arbete har gjorts på vita laboratorieråttor, som skapades ärr yta. Modellen av råttens romen erhölls som ett resultat av läkning av artificiellt påförda sår på ryggen längs ryggraden. Råttor skars bitar av samma läder, storlek på 2x3 cm. Efter 2,5 månader efter operation "simulering ärrbildning" råttor utfördes dermabrasion kirurgi (avlägsnande av de övre skikten via ignioperation våmmen) och transplanterade allogena keratinocyter, isolerade från huden hos unga råttor 2-4 dagar efter födseln.

Isolering och tillväxt av råtta-epidermocyter utfördes i laboratoriet för cellulära teknologier av Cytology Institute of the following technology.

Huden tvättades i Hanks saltlösning innehållande 200 U / ml gentamicin, skuren i små bitar, ett område av 0,2-0,5 cm ². Hudbitar inkuberades i en 0,5% lösning av disaspas i en balanserad saltlösningfosfatbuffrad lösning vid 37 ° C under en timme. Delarna överfördes därefter till Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning och epidermis separerades från dermis. Epidermen inkuberades i en 0,125% trypsinlösning i 10-15 minuter med omrörning vid 50 varv per minut, varefter enzymets verkan stoppades genom tillsats av 5% fetalt bovint serum. En tredjedel av den resulterande cellsuspensionen användes i ren form för ett av alternativen att transplantera ärr, andra tredjedel odlas på inhemska biokompatibel filmbeläggning "Polipor", den tredje - på en petriskål utan ett substrat. Dermabrasionsoperationen hos de erhållna ärren hos råttor med efterföljande transplantation av råtta-epidermocyter på dem utfördes under eteranestesi med användning av en värmekärlek.

Den första gruppen av råttor efter dermabrasion på polerat, tvättades med koksaltlösning och torkades yta sterila vommen lagrade stycken av gräsmatta, vilken deponerades oordning allogen råtta epidermotsitov uppslamning vid en koncentration av 1,5 miljoner celler per 1 ml (enligt Institute of Cytology). Cambric bitar staplade på polerade ärr så att cellerna bildade på ytan av ärret. Bandage på toppen av flera skikt av ostduk, som är sydda till kanterna av ärret.

En del av den resulterande cellsuspensionen belades i petriskålar på sterila Polypore-filmer skurna i form av koppar, den andra delen på petriskålar utan film. Odlingen utfördes i ett FAD-medium bestående av en blandning av DMEM och F12 i ett förhållande av 3: 1. Med tillsats av 10% fetalt bovint serum, 5 | ig / ml insulin (Sigma), 0,5 | ig / ml hydrokortisonhemisuccinat (Sigma). 10 μg / ml epidermal tillväxtfaktor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Den andra och tredje gruppen av råttor med 7 individer drevs 6 dagar efter det första. Vid denna tidpunkt bildades flerlagsskikt från suspensionen av sådda keratinocyter i petriskålar, vilka transplanterades till råttor. Den andra gruppen transplanterades med epidermocyter på filmen, den tredje gruppen - med ett flerskiktsskikt utan substrat. Efter 7 dagar transplanterades de flerlagiga skikten av alogiska keratinocyter (MPALK), som såddes på Polypore-filmer, genom odling direkt på sårytan. Ovanpå fixerades filmen för att undvika rippning med en flerskiktsgasbindning och sys till råttans hud.

Före omplantering keratinocyter tredje grupp av råttor, som odlas utan substratet, vilket ger en separation av PAC från botten av petriskålen dispas behandling, som har förmågan att selektivt bryta den dermo-epidermala kommunikation. Under verkan av en flerskiktad behållare dispas förstör anslutningen av det basala cellskiktet till botten av petriskålen och i mycket mindre utsträckning, påverkar det den intercellulära kommunikationen, vilket gör det möjligt att "ta bort" hela skiktet. Avlägsnandet av flerskiktscellstratum genom disposition utfördes enligt följande. Från Petriskålar blandas transportmedium delades cellarken tvättades tre gånger med medium innehållande antibiotika, i synnerhet - gentamicin (0,2 mg / ml). Hälldes flerskikts skikten 0125% dispas-lösning ( «Sigma») och placerades i en inkubator där de inkuberades vid t = 37 ° C under 20-30 minuter. Uppkomsten av vita kronblad, skalar runt periferin av reservoaren - en indikator av början av processen att separera det från kanterna och botten av petriskålen. Några minuter efter starten av separationsprocessen, var dispas lösning töms 2-3 gånger epiteliala skikten tvättades med medium. På ytan av det epidermala lagret applicerades, tillskuret kopp bit sterilt sårförband "Leith-färg, som spjälkas separeras dispas bildning, ytterligare delaminering av botten av koppen med en spatel. Använda oftalmiska pincetter skikt tillsammans med beläggningen av bindan" Leith-color "(Russian ) bröt bort från botten av en petriskål och försiktigt till den preparerade ytan av ärret. Servetter "Lita-color" innehåller i sin sammansättning och gentamicin eksolin (kollagenextrakt), som när de är våta miljön förblir gro i framtiden Sem saltlösning svällde och blev modern sår beläggning som ger bra skydd mot yttre infektion och snabb läkning på grund av begynnande våthet med struktur.

Polypropfilmer och Lita-färgservetter skiktades med gasbindningar som sys på huden hos råttor för mer hållbar fixering. Varje råtta plantades i en separat bur, för att skapa optimala betingelser för dess underhåll och engraftment av transplanterade keratinocyter. Bandage råttor som transplanterade fjädring och flerskiktade behållare epidermotsitov skott dispas, varje dag flera gånger om dagen, fuktade med steril koksaltlösning för att skapa de mest gynnsamma förhållanden celler för transplantation. Med tanke på att filmen "Polypor" var ogenomtränglig för vatten, fuktade råttorna i den andra gruppen inte förbandet, vilket var en av fördelarna med transplantationer utan filmer. Efter 10 dagar avlägsnades bandagen. Den kliniska bilden av ärr efter celltransplantation skilde sig lite från ärr utan transplantation, förutom en mer rosa färgning (på grund av dermabrasion) och större skalning. Detta faktum tyder på att. Att omedelbart efter att sårbeklädnaderna försvunnit med IPC inträffade inga förändringar i buken.

Ta biopsi material i råttor.

Efter 1, 2, 5 och 9 månader efter transplantation av keratinocyter på råtta allogichnyh mark ärr vita råttor, med en producerat material för histologisk, cytomorphological och elektronmikroskopstudie. Som kontrollprover av normal råttahud och ärr togs utan transplantation av celler. Anestesi hos råttor utfördes med eterbedövning.

Efter anestesi, från de markerade områdena till vilka keratinocyter transplanterades, en biopsipierare med en diameter av 2 mm. De bitar av ärrvävnad togs och placerades i en 2,5% glutaraldehydlösning för att framställa materialet för elektronmikroskopi. Vävnadsbitar tagna för histologisk undersökning placerades i 10% neutral formalinlösning, följt av genom ledningar alkoholer och fylldes i paraffin, följt av skärning av ultratunna sektioner och visa dem i det ljus optiskt mikroskop.

Kontroll I. Normal råtthud.

För att se skillnaden mellan den mikroskopiska bilden av den normala ärrförändrade huden hos råttor och ärr vid vissa tillfällen efter IPC-transplantationen, visas fotografier och beskrivningar till dem i alla stadier av denna studie.

Den epidermis av normal hud består av 7-9 lager av celler. Kåt lager av måttlig tjocklek. På platser består det av 6-8 lager horniga vågar. Basalskiktet representeras av celler av cylindrisk form med stort ljus, regelbundna kärnor och flera nukleoler. Desmosomala kopplingar mellan cellerna och det basala membranet uttrycks tydligt. Under väl definierade basalmembran, som har fina utbuktningar i subepidermala skiktet ligger parallellt till den milda knippen av kollagen och elastin fibrer, inklusive långsträckta fibroblaster, små fartyg. I djupare lager ligger buntarna av kollagen och elastinfibrer i olika riktningar. Bland dem finns det många fartyg med tunna väggar av samma kaliber, cellulära element (fibroblaster, mastceller, leukocyter). I ett stort antal hårsäckar, talgkörtlar.

Kontroll 2. Ärr hos en råtta 2 månader gammal.

Klinisk bild. Ärr blekrosa, med skalning, på plats kvarstår korparna. Deras område är minskat på grund av sammandragning av kollagenfibrer och bli ca 3,0-3,5 cm ^:. Hudfogar är frånvarande.

Mikroskopisk bild. Epidermis består av 3-5 skikt av celler, veckade, representerade av avrundade basalceller, en rad subulate, 1-2 rader keratohyalin granul med korn i det övre skiktet, det finns partier av intracellulärt ödem. Hornhinneskiktet är heterogent ändrat från mycket tunt till förtjockat. Det finns en vikning av kväva på grund av (sammandragning) av ärrvävnad. Vikarna tränger in i papillärskiktet och ger intryck av papillor. Gränsen mellan epidermis och dermis är en rak linje. Det basala membranet kan inte spåras överallt. I den nedre delen av de subepidermala och djupare skikten - kärl med en tjock, lossad mur, många övergivna, med stasisfenomen. Runt kärlen - ett kluster av makrofager, fibroblaster. Makrofager omger erytrocyterna som kommer ut ur kapillärerna och fagiserar dem. I de mer ytliga lagren - små kapillärer. Under epidermis är kollagenfibrer lös. I det djupare lagret av magen - grova buntar av kollagenfibrer, bland vilka det finns många fibroblaster.

Scarring av en råtta en månad efter transplantation av MPAl råtta råttkeratinocyter.

Klinisk bild. Ärrrosa, deras areal minskade, speciellt i diameter och i genomsnitt 2,5-3 cm ². Hår- och talgkörtlar är frånvarande.

Dessa mikroskopisk undersökning av det erhållna materialet från råttor med överförings MPAlK MPAlK på filmen och substratet utan att väsentligen identiska. Men tekniskt, arbete med MPAlK stöds mycket svårare och mödosam än när den odlas MPAlK på substratet, så att ytterligare studier av frågan på transplantation kertainotsitov ärr vi använde som grund för odlingen ( "substrat") skiktad gräsmatta.

Mikroskopisk bild. Det finns en förtjockning av epidermis till 15-20 lager, nästan till mitten av vilka keratinocyterna har en smal, långsträckt, vertikal form och ett kompakt arrangemang. Basalcellerna är anordnade i ojämn linje. Deras kärnor är lätta, stora, runda i form med en eller två nukleoler, vilket indikerar sin höga syntetiska och proliferativa aktivitet. Gränsen mellan epidermis och dermis är en rak linje. Det torniga skiktet är välutvecklat, består av 3-5 lager celler med rund form, det finns 2 nukleolceller.

Omedelbart under basalmembranet - tätt placerade tunna buntar av kollagenfibrer, parallellt med dem ett stort antal tomma kärl, är djupare kollagenfibrer grövre, uppsamlade i täta buntar. Många stora fibroblaster, mastceller (2-3 i synfältet), makrofager, leukocyter och tomma kärl, vars väggar lossnar runt dem är lösa kollagenfibrer. I vissa fartyg - stasis, diapedesis av enhetliga element. Runt kärlen - fibroblaster, enda lymfocyter. Hudfogar är frånvarande.

När en keratinocytuppsättning transplanteras till en polerad ärr, skiljer sig den mikroskopiska bilden från den föregående. I de flesta djur är epidermis tunn, består av 5-6 lager celler. Det nedre skiktet består av celler av oregelbunden, polygonal form med rundade oregelbundet formade kärnor. Läget för det subepidermala skiktet liknar det i gruppen av djur utan transplantation.

I detta fall kan man tala antingen om fördröjning av de processer som åtföljer celltransplantation eller av en stor förlust av celler transplanterade i form av en suspension. En slutsats drogs därför att korrigeringen av ärrbildning genom keratinocyttransplantation i form av en suspension är olämplig.

Scarring av råttan 2 månader efter transplantationen av MPAl råtta råttkeratinocyter.

Klinisk bild. Ärret ser tunt, ömt ut. På platser finns en ekdys, skalor.

Mikroskopiska bilder. Stratum corneum är förtjockad, på platser - hyperkeratos. Epidermis är förtjockad, den består av 12-20 rader celler. Gränsen mellan epidermis och dermis är en rak linje. Delikat kollagenfibrer under epidermis ligger ganska tätt. I djupare skikt av måren samlas de i grova stora buntar. I det subepidermala skiktet uppträder en ny formning av kärl. I de nedre lagerna av ärrvävnad - många tomma kärl, placerade parallellt med ytan av epidermis. Stora fibroblaster fördelas jämnt i tjockleken på buken, det finns stora, mångfacetterade, många makrofager.

Scarring av råtta 5 månader efter transplantation av MP av råttspermocyter.

Klinisk bild. Ärr ser slät, slät, utan skalning, finns det enda hårstrå av sin större densitet på periferin av ärret, vilket indikerar kantinåtväxande hårfollikel i vommen och tumör i hårsäckarna. Ärens område fortsätter att minska.

Mikroskopisk bild. Huden är fortfarande tjock (15-20 lager, ibland upp till 30) i de övre skikten fylls med keratogialinkorn. Det basala membranet är tydligt synligt. Under hennes kollagenfibrer ligger lös. I de nedre lagren är kollagen kraftfullare och tätt packad. Bland kollagenbjälkarna finns det många kapillärer. I de övre skikten minskade antalet tomma kärl. Epidermis och dermis är lite vågiga. Det finns djupa epidermala utväxter i ärrvävnaden. Bland kollagenfibrerna är synliga nybildade kärl. Visa enskilda hårsäckar och talgkörtlar.

Scarring av råttan 9 månader efter transplantationen av IPA råtta råtta epidermocyter.

Klinisk bild. Ärr blev mycket mindre i jämförelse med tidigare villkor, deras område är i genomsnitt ca 1,5-2,0 cm ². Ärr är ojämnt täckta med tunt hår, speciellt runt omkretsen. Mindre liten tallrikskalning behålls.

Mikroskopisk bild.

Epidermierna blev tunnare, representerade från 6-8 rader av celler, vilket påminner om den epidermala strukturen hos normala hud hos råttor, endast cellernas densitet med 1 mm. Högre och de är mindre. Basalskiktet består av småceller av rundcylindrisk form. Det basala membranet är väldefinierat, hemidesmosomen är tydligt synliga. Förekomsten av epidermala utväxningar i det subepidermala skiktet noteras. Det papillära skiktet uttrycks längs hela längden på ärret. Dessa fakta visar att vidhäftningen av de transplanterade keratinocyterna för denna tidsperiod har blivit betydligt starkare med den underliggande vävnaden hos buken. Följaktligen kan vård av ärr med MALC-transplantation 9 månader efter IPC-transplantation vara traditionell. Under epidermis är mer känsliga kollagenfibrer än i de djupa lagren. Det fanns många fartyg, särskilt ytligt belägna. I större fartyg är väggarna förtjockade. Hårfolliklar och talgkörtlar i stora mängder. Det mikroskopiska mönstret liknar en dermal vävnad.

Resultat av experimentellt arbete och deras diskussion.

Under detta arbete på artificiella hud ärr av råttor efter drift dermabrasion, transplanterade keratinocyter i olika formah- på lindade ytor, som en suspension i cambric och skiktad bildning utan ett substrat. Arbetet gjordes för att erhålla morfologiska data om effekten av transplanterade allogena keratinocyter på ärr samt bestämning av de optimala transplantationsvarianterna.

Det konstaterades att alla tre transplantationsmetoderna är verkliga, men transplantation av IPAA utan substrat är ett mycket arbetskrävande förfarande, under vilket IPAC kan skadas, vilket påverkar resultaten av transplantationen. Vidare utesluter denna transplantationsmetod arbete på stora ytor.

Transplantation keratinocyt fjädring - är betydligt mer ekonomisk metod kräver inte en lång odling av celler och enkel i föreliggande utföringsform, kontakt med användning av sterila cambric förformer, vars dimensioner motsvarar värdet för ärrbildning. Fördröjningen av den terapeutiska effekten under transplantationen av cellsuspensionen i ungefär en månad i jämförelse med MIC på sårbeläggningen är inte ett signifikant ögonblick med behandlingens varaktighet, beräknad under många månader. Det är känt att omvandlingen av hudstruktureringen vid transplantation av IPC för att bränna patienter uppstod gradvis och i flera år. Transplantation av keratinocytkulturen på sårbeläggningar är den mest praktiska och lovande metoden, men det är också mycket dyrare. Dessutom kräver det för idag att söka efter mer sofistikerade beläggningar som måste vara plastiska, hygroskopiska, ha bakteriostatiska eller baktericidala egenskaper och vara biologiskt neutrala för celler. Filmen "Polipor" - en mellanliggande version av den inhemska film sår täckning, trots vissa brister, har tillåtit oss att studera experimentellt keratinocytceller transplantations råttor på ärr och dra slutsatser om effektiviteten i denna riktning attraktion ärrbildning.

Författare som utförde transplantationen på IPC såren brända, noteras att under den första veckan efter transplantation av de flerskiktade reservoar keratinocyter vid såret desinficeras, tjockare överhuden och skiktade. Alla skikt av epidermis var väldefinierade. Det är intressant att antalet cellskikt i transplantationer är 10-30% större än i hudbiopsiprover. Författarna noterade utseendet av granuler av keratogialin den 5: e dagen efter transplantationen av MPA, det basala membranet och hemidesmosomen - redan på tredje dagen.

J. Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) fann att under de tidiga perioderna efter transplantation BMD patienter med polnosloynymi huddefekter efter brännskador, är kommunikation mellan dermis och epidermis mycket svag och är en rak linje, är papillärt skikt frånvarande. Vid slutet av den andra månaden börjar bildandet av grunda papiller och hudhuden, förbindelsen mellan dermis och epidermis blir hållbarare. Litteraturdata talar om transplantation av allogena keratinocyter på såren hos brända patienter, som en lovande metod. Trots att avvisandet av allogena keratinocyter sker in av olika författare under perioden från 10 dagar till 3 månader, men de har en roll i läkningen av sårytan, släppa tillväxtfaktorer och mekaniskt stänga defekten. Man tror att MPALK har en minskad antigenaktivitet, eftersom Langerhans-cellerna under odlingen in vitro förlorar, vilket gör det möjligt för dem att existera länge i mottagarorganismen. Dessutom har den allogena kulturen som erhållits från huden hos unga friska människor en ojämförligt större biologisk potential än den autologa kulturen hos patienter efter trauma.

Huvudsyftet med vår studie var att ta reda på om allogena keratinocyter kommer att överleva på ärren och vad som kommer att bli förändringar i ärrvävnaden under inverkan av sådan biologiskt aktiv "sårbeläggning". Vid ett positivt resultat ska du utarbeta den mest effektiva och minst arbetsintensiva tekniken inom detta område för rehabiliteringsmedicin.

Uppgifterna som vi erhållit på många sätt visade sig vara likartade litteraturdata om de morfologiska förändringar som uppstår i den mänskliga epidermis efter överföringen av allogena keratinocyter för att bränna sår. Men det finns betydande skillnader, både när det gäller det morfologiska substratet, vilket transplanteras, och i termer av teknik. So. Processen för bildning av basalmembranet och dermo-epidermala anslutningar (hemidesmosomer, papiller) inträffar vid ett senare tillfälle än vid keratinocyttransplantationen till sårytorna utan ärrförändringar. Detta förefaller vara på grund av dålig näring av magevävnaderna i jämförelse med dermis eller muskelfascia. Ärret, särskilt det gamla, är en tät bindväv med ett mycket litet antal kärl, botten av brännsåret är en granulationsvävnad rik på blodkärl. Således är det uppenbart att de betingelser under vilka transplantation och engraftment av keratinocyter uppträder är helt olika. Ju mer vaskulär området för transplantation av celler, desto lättare är det att bearbeta dem. Från detta postulat finns det en slutsats om preferensen för att arbeta med unga ärr, där bindväven fortfarande är tillräckligt lös och rik på blodkärl.

Som ett resultat av detta experimentarbete har det visat sig att:

1. En transplantation av MALK till ärr är möjlig. 
2. Den optimala transplantationsmetoden är transplantationen av keratinocyter på sårkåpan.
3. Ytan på ärr bör males med hjälp av en operativ dermabrasion med Schumanns laser eller en skärare.
4. Under inverkan av MPALK uppträder snabb epithelisering av magsytan.
5. Ju bättre vaskulär ärrvävnad, det är ju yngre ärr, desto bättre blir resultatet av keratinocyttransplantation.
6. Ärrvävnaden som påverkas av transplanterade keratinocyter förvandlas gradvis och blir till en dermaltliknande (mer spröd ärrväv med hudanslutningar).
7. Gradvis lossning av ärrvävnad börjar med det subepidermala skiktet. Förbättrar sin vaskulärisering, buntar av kollagenfibrer i de övre och nedre delarna av buken tar en mer spröd plats än i ärrvävnaden utan transplantation av celler. Det finns hårsäckar och talgkörtlar. Epidermis i sin struktur, när den passerar fasen av hypertrofi, närmar sig epidermis av normal hud.
8. De observerade förändringarna är relaterade till keratinocyter utsöndrade tillväxtfaktorer, cytokiner som förbättrar trofism av ärrvävnad bidrar till dess omställning från en stel fibrös vävnad i en lösare, vilket leder till en förbättring av ärret.

På grundval av denna studie kan man därför dra slutsatsen att den positiva effekten av transplanterade keratinocyter på ärrvävnad, vilket kan vara av praktisk betydelse för rehabilitering av patienter med olika typer av ärr.

Detta arbete på råttor får också formulera krav. Till sårbeläggningarna, på vilka keratinocyter odlas.

Sårbeläggningar ska vara:

• biokompatibla med celler,
• andas,
• ha en elastisk formbyggnadsbas,
• vara hydrofil,
• som läkemedelstillsatser innehåller antibakteriella läkemedel och antioxidanter är inte giftiga för odlade celler.

Kliniska resultat av bioteknologisk behandling av ärr.

Tidigare, N. Carver et al. (1993) fann att ocklusiva förband är bäst för att fästa vid sår och överlevnad av keratinocyter, men tillåter inte bildandet av en stratifierad (mogen) epidermis. För att bilda stratifierad epidermis behövs en luftmiljö. Därför föreslogs efter ocklusion av det flerskiktiga skiktet ett ocklusivt sårskydd efter 7-10 för att avlägsna och leda sår under torra bandage eller vattenlösliga salvor. Vi kan säga att kvaliteten och egenskaperna hos "substratet" på vilket cellerna odlas är väldigt viktiga för effektiviteten av transplantationen av det cellulära materialet och följaktligen för resultaten av läkarnas arbete. Men det finns ingen ideell sårbeklädnad idag, trots att de föreslagna alternativen är överflödiga (konstläder, non-woven tyg av karboximetylcellulosa, fibrinbeläggningar, semipermeabla polyuretanfilmer). Oviktigt ögonblick i denna fråga är kostnaden för "substrat" (speciella sårbeläggningar), eftersom deras höga kostnader ökar den totala kostnaden för bioteknisk behandling.

Effektiviteten hos cellulära teknologier har visat sig hittills, men tyvärr är dessa tekniker väldigt dyra, särskilt i länder där industriproduktion av cellulära kompositioner inte är etablerad. Ändå har länder som Förenta staterna länge etablerat en industri för produktion av cellulärt material för transplantation av förbrända. I synnerhet, företaget Biosurface Technology Inc, sedan 1989, höjde 37.000 laminerade skikt av keratinocyter, som har använts för behandling av 240 patienter i 79 länder runt om i världen (R.Odessey, 1992) med en cm ² cellodling kostar ca 7-8 $ US.

Tekniken för att behandla olika sjukdomar och hudproblem har ett antal skillnader, men i centrum för någon behandling med celler är produktionen av kvalitetscellmaterial och dess transplantation.

Denna process består av följande steg:

• Val av hud från de drabbade (eller från givare),
• transport av hudflikar till bioteknikcentralen,
• isoleringen av basalskiktets celler och deras multiplikation,
• uppbyggnad av flera lager av keratinocyter (IPC).
• transplantation av cellkulturer.

Huvudproblemet i behandlingen med transplantationen av multilagret keratinocytstrata är behovet av livskraftiga celler vid alla stadier av celltransplantation. Huddelar för isolering av autologa eller allogena celler bör vara så tunna som möjligt, eftersom de i detta fall är enklare att separera med hjälp av mekaniska och enzymatiska metoder och för att få en suspension av levande celler för tillväxt. De kan erhållas genom att avlägsna dermatomen eller genom att använda ögonlocket, förhuden, axelns inre yta. Eftersom cellerna är känsliga för halogener (klor, jod), väteperoxid, kan de inte användas vid behandling av huden vid tidpunkten för materialets användning.

Det kvantitativa och kvalitativa utbytet av celler från hudtransplantationer och effektiviteten av deras odling beror också på givarens hälsotillstånd och ålder. Dessutom ska hudbiopsiprover levereras till laboratoriet så snart som möjligt och under lämpliga förhållanden (miljö, temperatur) levereras till ett certifierat och ackrediterat laboratorium.

Eagle's medium eller medium 199 med tillsats av 10% bovint serum, DMEM-medium kompletterat med 5% fetalt bovint serum och antibiotika kan användas för att lagra och transportera hudflikar.

I det cytologiska laboratoriet delas kutan biopsi först mekaniskt i små bitar, sedan behandlas hudfragment med hjälp av enzymer: trypsin, kollagenas, dyspas etc.

Under enzymens verkan sker destruktion av desmosomer och keratinocyter släpps ut i mediet som separata celler eller aggregat som består av olika antal celler. För odling används endast basala keratinocyter som odlas på specialmedium i inkubatorer innehållande 5% CO., I petriskålar eller i flaskor vid t = 37 ° C. Inom 48 timmar observeras bildandet av keratinocytkolonier som gradvis konvergerar till ett monoskikt. Efter erhållande av ett tillräckligt antal celler sprids den resulterande suspensionen på sårdäcken som framställts för detta ändamål och placeras i petriskålar. Från suspensionen bildas först ett monoskikt och sedan ett flerskiktsskikt av keratinocyter. Schematiskt visas stegen i keratinocytodlingsprocessen i Fig. 12 (33,43,54,65).

Bildningen av en multilagskeratinocytbildning lämplig för transplantation tar vanligen 7-10 dagar. Ibland är denna period längre, vilket beror på källmaterialets kvalitet (ålder, givarens hälsa, materialets korrekthet, kvaliteten på de använda medierna etc.). Om flerlagskiktet växer över kan det finnas celler med apoptosfenomen som inte är lämpliga för transplantation på dess yta. Petriskålar, som odlas i dem på sårbeklädnader med flera lager av keratinocyter (IPC), levereras till kliniken i speciella behållare vid en temperatur som inte är lägre än + 15 ° C.

Modifierad Grön metod för odling av IPC

I vårt arbete som sårbeläggning använde vi en flerskiktad kamera, övergav polyporfilmerna som vi började arbeta med i ett experiment med råttor. Således odlades flerlags keratinocytstrata av oss på prefat och steril batiste, även om det inte heller är det optimala sårbeläggningen.

Kliniska studier utfördes på volontärer med iakttagande av nödvändiga etiska normer: undertecknande av ett fördrag och informerat samtycke.

1. Kulturen av egen (autolog) och tas från bankcellerna (allogena) keratinocyter applicerades.
2. Egna keratinocyter erhölls från ett stycke hudskärning från insidan av patientens axel.
3. Dermabrasion av ärr utfördes med hjälp av termoelement, rotationsskivor och erbiumlaser.
4. Grupper av patienter med normotrofa, hypotrofa och hypertrofa ärr togs.

Den tekniska processen för tillämpning av cellteknik för att förbättra typen av hud är bestående av följande steg:

1. Val av patienter.
2. Förklara kärnan i behandlingen, tidpunkten för att uppnå de förväntade resultaten, undertecknandet av ett fördrag och informerat samtycke.
3. Utnämning av patienter i 2-3 veckor före operation selmevit med 1t. 3 gånger om dagen, zinkteral på 1t. 3 gånger om dagen.
4. Ta en bit av huden 2,0 cm lång och 0,7-1,0 cm bred från axelns inre yta, högt, nästan i botten av axillärområdet, för att erhålla autologa keratinocyter.
5. I händelse av att patienter vägrar att isolera sina egna keratinocyter på grund av möjligheten att erhålla linjär ärr på axelns inre yta, togs det cellulära materialet från en cellbank (allogena keratinocyter).
6. Keratinocyter isolerades och odlades under betingelser för ett laboratorium certifierat för denna typ av arbete.
7. Efter att ha fått en IPC som var tillräcklig för transplantation, administrerades en kirurgi till öronen vid kliniken där material fördes i speciella behållare i petriskålar.
8. Operationen av dermabrasion av buken, hemostasen utfördes, markytan tvättades med steril saltlösning, torkades, varefter IPC transplanterades på sterila batistiska "celler ner". Det vill säga, cellerna som var övre i MIC var lägre, intill den polerade ytan.
9. En steril film placerades ovanpå, vilken fixerades på huden med ett elastiskt bandage- eller Omnifix-elastiskt bandhjälpmedel. Istället för filmen kan likgiltiga sårbeläggningar innehållande silikon, exempelvis Mepitel, Mepiform, silikongelplattor, användas.

Efter 5-7 dagar avlägsnas film- eller silikonbeläggningen. Vid den här tiden måste alla keratinocyter krypa på det polerade ärret och fästa vid dess yta.

10. Den våta miljön som skapas under film- och silikonbeläggningen bidrar aktivt till detta. Döparen som kvarstår i ärr från denna punkt kan impregneras med curios eller chitosangel. Som ett resultat, på 2: a dagen, skapas en tät skorpa, vilket för patientens bekvämlighet är bättre att fixa med en elastisk, luftgenomsläpplig gips, till exempel Omnifix. Den andningsbara skorpan gör det möjligt för de nybildade epidermierna att skilja sig och bli en mogen.

Beroende på typen av ärr och djupet av slipning avvisas förbandet efter 8-10 dagar. Epidermis vid denna tid har 30-40% mer cellulära lager än i normal hud. Det basala membranet bildas inte. Keratinocyter av den förtjockade epidermisen frisätter en massa biologiskt aktiva molekyler i ärrvävnaden.

Framgången med bioteknisk behandling av ärr beror till stor del på hur de tas hand om under den postoperativa perioden. Cellkulturer är ett "sår" slags sårskydd och under de tidiga perioderna efter transplantationen kan BMD enkelt avlägsnas från de underliggande vävnaderna. Därför rekommenderas patienter att ta hand om ärr efter operationen. För 8-9 månader, gnugga inte och arbeta lätt med kallt kokt vatten för att undvika att riva av en tunn, nyskapad epidermis som inte har ett hårt grepp med underliggande vävnader.

Obs.

Före kirurgi och under dermabrasion användning av halogenerade oxidanter och konserveringsmedel (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, klorhexidin, väteperoxid) är tillåten innan omplantering kletok- absolut kontraindicerat beroende på deras cytotoxiska effekter. Giftig för celler är också metylenblå. Lysande grön.

För att undvika smitta, speciellt vid arbete med hypertrofiska ärr, är det möjligt att behandla operationsfältet med neomycinsulfat, polymyxin eller gentamicin. De utövar inte en cytotoxisk effekt på keratinocyter.

Som ett resultat av denna behandling uppnås en trippel effekt.

1. Justering av magen på ytan.
2. Skapa ett lager ovanför det av en ny epidermis, normal tjocklek.
3. Omvandling av ärrvävnad i dermopodobnuyu genom verkan av cytokiner, tillväxtfaktorer och andra bioaktiva molekyler som utsöndras av transplanterade celler och keratinocyter som stimuleras av dem, fibroblaster och makrofager.

Ärret blir mindre märkbart, mer elastiskt, porer förekommer i det, puffhår, pigmentering kan återställas på grund av närvaron av melanocyter i MPC.

Men alla dessa positiva stunder i cicatrixen kommer inte omedelbart. I detta avseende är det nödvändigt att varna patienter. Att processen för omvandling av ärrvävnad till dermis är långsam och det optimala resultatet av sådan behandling kan förväntas inte tidigare än 10-14 månader. Omedelbart efter att förbandet avvisats har de polerade ytorna en uttalad polychrom, desto ljusare är slipningsprocessen. Minsta skada på huden uppträder vid slipning av normotrofiska ärr med en erbiumlaser. Färgen på ärr och omgivande hud återställdes under perioden 3-8 veckor. Trots sådana försiktighetsåtgärder finns ibland postoperativ hyperpigmentering, som kan gå på sig självständigt i flera månader.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]