Myggor med inbyggd "genetisk sköld" stoppar malaria – infektionsgraden minskar med 93 %

Att övervinna insektsmedelsresistens: Hur en enda genmodifiering hos myggor sprider sig själv över generationer och praktiskt taget eliminerar malariaöverföring utan att äventyra överlevnaden.

I en nyligen publicerad studie i Nature undersökte ett forskarteam huruvida glutamin 224 (Q224)-allelen i fibrinogenrelaterat protein 1 (FREP1) gör Anopheles stephensi-myggor resistenta mot Plasmodium-infektion, uppskattade överlevnadskostnaderna i samband med denna allel och testade ett allelt gendrivningssystem för att sprida denna skyddande mutation genom populationer.

Förkunskapskrav

Omkring 600 000 människor dog av malaria år 2023, mestadels barn i Afrika söder om Sahara och Sydasien. Traditionella bekämpningsmetoder – myggnät, insektsmedelsbehandlingar, malarialäkemedel – förlorar sin effektivitet på grund av resistens hos myggor och parasiter. Gendrivande teknologier som sprider gynnsamma alleler genom myggpopulationer erbjuder en lovande och hållbar lösning.

FREP1-proteinet hjälper parasiter att ta sig igenom myggans tarmkanal, men den naturliga varianten Q224 kan förhindra infektion utan att äventyra myggans biologi. Målet var att testa om en sådan endogen allel kunde distribueras säkert för att minska malariaöverföring samtidigt som myggans livskraft bibehölls.

Om studien

Med hjälp av CRISPR/Cas9 skapades två stammar av Anopheles stephensi som endast skilde sig åt i den 224:e aminosyran i FREP1-proteinet: en vildtyp med leucin (L224) och en potentiellt skyddande stam med glutamin (Q224). Guide-RNA:t riktade in sig på en intronregion 126 bp uppströms om kodonet, vilket möjliggjorde homolog rekombination med insättning av en fluorescerande märkning (GFP eller RFP).

Kondition bedömdes utifrån vinglängd, fekunditet, äggkläckningsförmåga, puppning, vuxna individers framväxt och livslängd (Kaplan-Meier överlevnadsanalys).

Vektorkompetens bestämdes med hjälp av standardmembranmatning av Plasmodium falciparum (människa) och Plasmodium berghei (gnagare) parasiter, med oocyst- och sporozoitantal i spottkörtlar.

Alleldrivsystemet inkluderade en kassett med gRNA mot L224 och Cas9 under kontroll av vasapromotorn. Allelfrekvenser övervakades med hjälp av fluorescerande taggar i flercykelexperiment (10 generationer). Genotypning utfördes med PCR, Sanger-sekvensering och NGS. Bayesiansk modellering uppskattade allelkonvertering, fitnesskostnader och dynamik under fri parning i laboratoriet.

Resultat

FREP1Q224-allelen orsakade inte signifikanta förluster i överlevnad: vinglängd, fekunditet, kläckning, puppning och uppkomst av vuxna individer var identiska med FREP1L224-kontrollen. Små skillnader i hanarnas storlek och livslängd påverkade inte konkurrenskraften. Jungfruliga FREP1Q224-honor levde lika länge som kontrollerna, och honor efter blodintag visade endast en liten minskning av livslängden.

Utmaningsexperiment visade markant skydd hos homozygoter.

• Vid låga koncentrationer av P. falciparum-gametocyter (0,08 %):
  • Infektionsgraden sjönk från 80 % till ~30 % i FREP1Q224;
  • Genomsnittligt antal oocyster: från 3 till 0;
  • Sporozoiter i spottkörtlar: från >4000 till 0.
• Vid högre gametocytemi (0,15 %):
  • Genomsnittligt antal oocyster: från ~32 till
  • Sporozoiter minskade också dramatiskt.
• För P. berghei:
  • Genomsnittligt antal oocyster: från 43 till 25;
  • Sporozoiter: från ~19 000 till 11 000.
• Heterozygoter (FREP1L224/Q224) var inte skyddade.

Gendrivningseffektivitet

• I parade korsningar omvandlade Cas9 + gRNA L224 50 till 86 % av FREP1L224-allelerna till FREP1Q224;
• Med moderns Cas9 var frekvensen högre;
• I den andra generationen nådde frekvensen av den skyddande allelen 93 %;
• Förekomsten av NHEJ-reparationsfel var låg (0–12 %) och orsakade vanligtvis skada.
• I cellpopulationer med ett donator:mottagare-förhållande på 1:3 ökade FREP1Q224-frekvensen från 25 % till >90 % över 10 generationer;
• Frekvensen av NHEJ-alleler minskade från 5,4 % till

Bayesiansk modellering stödde hypotesen om hög konvertering, låg frekvens av stabila mutationer och en letal steril mosaicism-effekt, där WT-homozygoter med den maternella Cas9-genotypen led av somatiska mutationer och minskad överlevnad.

Senare generationer visade nästan fullständig hämning av P. falciparum-oocyster (median 0 till 5,5), vilket bekräftade att populationen i stort sett hade blivit refraktär mot parasitöverföring.

Den skyddande allelen hade inga dolda fördelar eller biverkningar och spreds genom drivkraft.

Slutsatser

Studien fann att ersättning av en enda aminosyra i FREP1-proteinet och förskjutning av dess arv med hjälp av en gendrivare skulle kunna göra Anopheles stephensi praktiskt taget immun mot malaria – både människa och gnagare – utan att äventyra myggornas livskraft.

Denna metod kompletterar befintliga åtgärder (nät, insekticider, läkemedel) vars effektivitet minskar på grund av resistens. Ett sådant system kan också användas för att återställa känsligheten för insekticider eller introducera andra skyddande alleler.

Innan tekniken kan implementeras behövs strikta miljömässiga, etiska och styrningsmässiga ramverk, samt system för att kontrollera spridning.